槐耳清膏通过抑制ROS介导的腺泡细胞焦亡减轻小鼠急性胰腺炎的严重程度.pdf

第 卷第期年月西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)J o u r n a l o fX ia nJ i a o t o ngU n i v e r s i ty(M e d i c a l S c i e n c e s)V o l N o M a r 本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版胰腺炎专题研究槐耳清膏通过抑制R O S介导的腺泡细胞焦亡减轻小鼠急性胰腺炎的严重程度龚梦元,张博,朱泽恩,马清涌,仵正,王铮,钱伟琨,(西安交通大学第一附属医院肝胆外科,陕西西安 ;西安交通大学胰腺疾病诊疗中心,陕西西安 )摘要:目的探究槐耳清膏对急性胰腺炎(a c u t ep a n c r e a t i t i s,A P)的治疗作用及其潜在机制.方法体内利用雨蛙肽诱导的小鼠A P模型验证槐耳清膏(简称槐耳)的治疗效果,采用HE染色及免疫组化染色评价小鼠胰腺组织的病理改变、采用透射电镜观察小鼠胰腺的焦亡形态;体外以 细胞系作为实验载体验证槐耳对腺泡细胞的保护作用,利用电镜及W e s t e r nb l o t t i n g评价腺泡细胞的焦亡水平,利用R O S荧光探针检测腺泡细胞的氧化应激状态.结果槐耳治疗明显改善了小鼠A P的严重程度,HE染色表现为胰腺内腺泡坏死和炎细胞浸润减少等,同时伴有血清淀粉酶水平下降;而免疫组化染色和W e s t e r nb l o t t i n g发现,槐耳治疗有效抑制小鼠胰腺组织内焦亡相关分子N L R P、G S DMD等的表达;进一步的电镜观察发现槐耳治疗降低炎症状态下小鼠胰腺腺泡细胞的焦亡水平;此外,体外实验发现,槐耳干预能显著降低胰腺腺泡细胞 的R O S水平,且R O S介导的腺泡细胞焦亡能被槐耳有效抑制.结论槐耳能有效减轻A P的严重程度,这一效应是通过抑制R O S介导的胰腺腺泡细胞焦亡所实现的.关键词:急性胰腺炎(A P);槐耳清膏;细胞焦亡;R O S中图分类号:R 文献标志码:AD O I:/j d y x b 收稿日期:修回日期:基金项目:国家自然科学基金青年基金资助项目(N o )S u p p o r t e db yt h eN a t i o n a lN a t u r a lS c i e n c eF o u n d a t i o no fC h i n a(N o )通信作者:钱伟琨,副研究员,住院医师 E m a i l:q i a n w e i k u n x j t u e d u c n网络出版地址:h t t p:/k n s c n k i n e t/k c m s/d e t a i l/R h t m l()H u a i e ra l l e v i a t e sa c u t ep a n c r e a t i t i s i nm i c eb yr e d u c i n gR O S i n d u c e dp y r o p t o s i s i na c i n a r c e l l sGONG M e n g y u a n,Z HANGB o,Z HUZ ee n,MAQ i n g y o n g,WUZ h e n g,WANGZ h e n g,Q I AN W e i k u n,(D e p a r t m e n to fH e p a t o b i l i a r yS u r g e r y,T h eF i r s tA f f i l i a t e dH o s p i t a l o fX ia nJ i a o t o n gU n i v e r s i t y,X ia n ;P a n c r e a t i cD i s e a s eC e n t e ro fX ia nJ i a o t o n gU n i v e r s i t y,X ia n ,C h i n a)A B S T R A C T:O b j e c t i v eT oi n v e s t iga t et h et h e r ape u t i ce f f e c to fH u a i e ro na c u t epa n c r e a t i t i s(A P)a n di t spo t e n t i a lm e c h a n i s mM e t h o d s Am o u s em o d e l o f c e r u l e a n i n d u c e dA Pw a s u s e d t ov e r i fyt h e t h e r ape u t i ce f f e c t o fH u a i e ri nv i v o H Es t a i n i nga n d i mm u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i ngw e r eu s e d t oe v a l u a t e t h eh i s t opa t h o l ogi c a l c h a nge s o ft h epa n c r e a s,a n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c op yw a su s e dt oo b s e r v et h ep yr opt o s i sm o rph o l og yo f t h epa n c r e a s I nv i t r o,c e l l l i n ew a s u s e da s t h ee xpe r i m e n t a l c a r r i e r t ov e r i fyt h epr o t e c t i v ee f f e c to fH u a i e ro na c i n a r c e l l s E l e c t r o nm i c r o s c op ya n d W e s t e r nb l o t t i ngw e r eu s e dt oe v a l u a t et h ep yr opt o s i sl e v e lo fa c i n a rc e l l s,a n d RO Sf l u o r e s c e n c epr o b e w a su s e dt od e t e c tt h eo x i d a t i v es t r e s ss t a t eo fa c i n a rc e l l s R e s u l t sH u a i e rs ign i f i c a n t lya l l e v i a t e dt h e s e v e r i tyo fA P i nm i c e H Es t a i n i ngo fpa n c r e a s s h o w e d t h a t n e c r o s i s a n d i n f l a mm a t o ryc e l l i n f i l t r a t i o nw e r er e d u c e d,a n dt h el e v e lo fs e r u ma myl a s ew a sd e c r e a s e d I mm u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i nga n d W e s t e r nb l o t t i ngs h o w e d t h a tH u a i e r e f f e c t i v e lyi n h i b i t e dt h ee xpr e s s i o n so fp yr opt o s i s r e l a t e dm o l e c u l e s s u c ha sN L R P a n dG S DMDi npa n c r e a t i ct i s s u e E l e c t r o nm i c r o s c op ys h o w e dt h a tH u a i e rc o u l dr e d u c et h ep yr opt o s i s l e v e lo fpa n c r e a t i ca c i n a rc e l l su n d e ri n f l a mm a t o rys t a t e I na d d i t i o n,t h el e v e lo fRO Si na c i n a rc e l l sw a ss ign i f i c a n t lyr e d u c e da f t e rt h ei n t e r v e n t i o no f H u a i e r,a n d RO S m e d i a t e dp yr opt o s i so fa c i n a rc e l l sc o u l db ee f f e c t i v e lyi n h i b i t e dbyH u a i e r C o n c l u s i o n H u a i e r c a ne f f e c t i v e lyr e d u c e t h e s e v e r i tyo fA Pbyi n h i b i t i ngRO S m e d i a t e dp yr opt o s i s o f a c i n a r c e l l s K E Y WO R D S:a c u t epa n c r e a t i t i s;H u a i e r;p yr opt o s i s;r e a c t i v eo xy ge nspe c i e s西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第 卷本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版急性胰腺炎(a c u t ep a n c r e a t i t i s,A P)是由胰管压力增高和胰酶异常活化导致胰腺及周围组织自身消化,进而诱发全身炎症反应、组织损伤甚至器官衰竭的一种炎症性疾病.全球A P的发病率高达/万,且呈逐年上升趋势.从病理生理学角度看,A P是由于胰腺腺泡细胞内胰蛋白酶原过度激活,导致腺泡细胞死亡和破裂,细胞内大量促炎细胞因子和趋化因子被释放,诱导多种炎症细胞聚集,加剧局部炎症反应并引起全身炎症级联反应 .因此,防止或减少细胞死亡和解体是控制级联损伤反应的关键之一.近年来,关于细胞死亡方式和途径一直是各种研究的热点.其中细胞焦亡(p y r o p t o s i s)是一种程序性炎性细胞死亡的方式,最早由S AN S ON E T T I团队于 年报道.特征是:染色质凝固、细胞膜起泡破裂、细胞质空泡化、内质网扩张(但细胞器结构尚完整),以及D NA碎裂成小片段等 ,常被报道在急性或慢性胰腺炎中发挥重要的作用 .但如何减轻A P过程中腺泡细胞的焦亡从而抑制炎症进展的方法仍旧不多.槐耳清膏(简称槐耳,H u a i e r)是一种珍贵的中药,在中国已有 多年的药用历史.新近的基础研究及临床实践表明,槐耳有多种药理作用,包括抑癌、调节免疫、抗炎等 .从机制层面看,槐耳能通过抑制N L R P 炎症小体(细胞焦亡关键分子)减轻溃疡性结肠炎的进展.然而,槐耳能否调控细胞焦亡抑制A P进展尚未见研究报道.因此,本研究旨在探讨槐耳对A P的潜在治疗作用及分子机制,为A P的有效防治提供新思路.材料与方法材料与试剂槐耳由中国启东盖天利公司提供.雨蛙肽(C e r u l e i n)购 买 自 美 国M e d C h e m E x p r e s s公 司.兔 抗C a s p a s e 、鼠抗A S C和兔抗G S DMD购买自中国A B c l o n a l公 司,兔 抗G A P D H购 买 自 中 国P r o t e i n t e c hG r o u p公司,兔抗N L R P、鼠抗C K 和兔抗Am y l a s e购买自英国A b c a m公司.DM E M培养基、胎牛血清、胰蛋白酶和青霉素链霉素溶液购自美国G i b c o公司.小鼠胰腺腺泡癌细胞系 细胞由南京大学医学院附属鼓楼医院消化内科的张舒博及其同事捐赠.实验动物及干预方案C B L/J小鼠(雄性,周龄,体质量约 g)由西安交通大学实验动物中心提供.所有小鼠饲 养 在 无 特 定 病 原 体(s p e c i f i cp a t h o g e nf r e e,S P F)级的、光照 h(湿度为)、以木屑为垫料的独立通风笼中(每笼只).所有小鼠均可自由饮用水和标准实验室食物.实验开始前适应性喂养周.具体干预策略为:将小鼠随机分为对照组(S a l C t r l)、A P组(C e r A P)和槐耳治疗A P组(C e r A P H u a i e r).C e r A P组(n)和C e r A PH u a i e r组(n)腹腔注射雨蛙肽(g/k g/次),每次间隔h,每天次,连续d诱导A P;S a l C t r l组(n)腹腔注射等量同频次的生理盐水.在距离首次注射后 h处死小鼠.此外,对C e r A PH u a i e r组小鼠,将槐耳溶于生理盐水中,按照g/k g的剂量从首次注射雨蛙肽前d开始灌胃(每天次)至研究结束,同时相应的S a l C t r l小鼠和C e r A P小鼠给予等体积的生理盐水灌胃处理.所有实验方案均得到西安交通大学第一附属医院伦理委员会批准.E L I S A检测各组小鼠血清淀粉酶水平麻醉后采用眼球采血,每只小鼠的血液样本先于室温下静置 m i n,然后以 r/m i n的转速离心 m i n.用无菌无酶的枪头吸附血清(离心后的血液样本表面的浅黄色清质上清液)后,按照 淀粉酶试剂盒说明书指示检测各组小鼠的血清淀粉酶水平.细胞内R O S水平的测定将 细胞接种到孔板中(每孔约 个细胞),根据 细胞的倍增时间使用不同的干预模式:空白对照组;HO组(细胞铺满约 时加入 mm o l/LHO干预h后观察);雨蛙肽组(细胞铺满约 时加入m o l/L雨蛙肽干预 h后,当 细胞铺满约 时观察);雨蛙肽槐 耳 组(细 胞 铺 满 约 时 加 入m o l/L雨蛙肽干预 h后,再加入m g/m L槐耳干预 h后,当 细胞铺满约 时观察);HO槐耳组(细胞铺满约 时加入m g/m L槐耳干预 h后,当 细胞铺满约 时,再加入 mm o l/LHO干预h后观察);雨蛙肽NA C(N 乙酰 L 半胱氨酸)组(细胞铺满约 左右加入m o l/L雨蛙肽干预 h后,再加入mm o l/LNA C干预h后,当 细胞铺满约 时观察).然后,根据说明书,使用活性氧测定试剂盒测定细胞内R O S的含量,将各组完全培养基去除,加 入 无 血 清DMEM和 胞 内R O S检 测 探 针D C F H D A于细胞培养箱中孵育 m i n,最后P B S清洗次后,荧光显微镜检测拍照.采用Z E I S S荧光显微镜和I m a g eJ(v e r s i o n a,N a t i o n a l I n s t i t u t e so fH e a l t h,B e t h e s d a,MD,U S A)软件对R O S的产生进行定量分析.W e s t e r nb l o t t i n g检测蛋白表达在小鼠胰腺组织或 细胞中加入适量R I P A裂解液,并于冰上充分裂解,将裂解液以 r/m i n转速于离心 m i n,提取上清液并采用B C A蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后,加入适量蛋白上期龚梦元,张博,朱泽恩,等槐耳清膏通过抑制R O S介导的腺泡细胞焦亡减轻小鼠急性胰腺炎的严重程度本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版样缓冲液,于 高温加热 m i n使蛋白变性.将 g的蛋白样品加入到 g/L的S D S P AG E凝胶上,蛋白样品经电泳分离后,以 V恒压转膜,用快速封闭液在常温下封闭 m i n之后置于配比好的 适 量 一 抗 溶 液 中,摇 床 上 孵 育 过 夜 后,用T B S T洗涤次,每次 m i n.再置于二抗于室温孵育h后用T B S T洗涤次,每次 m i n.使用E C L试剂盒进行免疫反应性条带检测.采用美国B i o R a d公司C h e m i D o cX R S系统检测并用I m a g eJ软件计算蛋白的相对表达情况.透射电镜观察离心收集新鲜 细胞和新鲜小鼠胰腺组织块修剪成约mm的体积,样品用 g/L戊二醛冷冻固定,再用 g/L锇酸固定,包埋在 n m的切片中,再用 g/L醋酸铀柠檬酸铅对样品进行双重染色.使用日本H 透射电镜观察细胞形态的变化.统计学分析本研究中每个实验分别进行了次及以上的独立的重复,所得数据均使用G r a p h P a dP r i s m统计软件进行分析.两组数据之间的显著性差异的比较采用非配对t检验来评估,组数据及以上的组间差异 性 比 较 采 用 了 单 因 素 方 差 分 析(O n e W a yANOVA)和T u r k e y法进行事后两两比较.实验数据以均值标准差(xs)表示.P 为差异具有统计学意义.结果槐耳减轻雨蛙肽诱导的A P的严重程度为了确定槐耳对雨蛙肽诱导的A P是否有潜在保护作用,本研究在A P诱导前对小鼠进行槐耳的灌胃治疗(图 A).血清淀粉酶是A P临床检测中最常用的生化指标,E L I S A结果显示,与对照组小鼠相比,炎症组(C e r A P)血清淀粉酶水平明显升高(图 B,P),而槐耳干预后A P小鼠血清淀粉酶显著降低(图 B,P);同样的,HE染色结果也证实,槐耳治疗显著降低了雨蛙肽诱导的胰腺急性炎症损伤,主要表现为胰腺组织的水肿程度降低、间质中炎症细胞浸润减轻、胰腺腺泡细胞的坏死和空泡化减少(图 C、D),最终量化表现为组织病理学评分降低(图 C、D).综上所述,槐耳能有效减轻雨蛙肽诱导的A P的严重程度.A:A P模型及槐耳干预模式图;B:E L I S A实验检测小鼠血清淀粉酶浓度;C、D:各组胰腺炎小鼠胰腺HE染色结果及病理评分统计分析;E、F:各组A P小鼠胰腺a m y l a s e和C K 免疫组化染色结果及染色评分统计分析.P.图槐耳减轻雨蛙肽诱导的A P的严重程度F i g H u a i e ra l l e v i a t e dt h es e v e r i t yo fA P西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第 卷本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版此外,A P关键的病理表现为胰腺腺泡细胞被不同程度的破坏,在抵御损伤和自我修复的过程中,少数腺泡细胞会发生腺泡导管化生(a c i n a rt od u c t a lm e t a p l a s i a,A DM)以适应外界环境刺激,表现为腺泡细胞具有导管细胞的特征(腺泡标志物如a m y l a s e逐渐消失,而导管标志物如C K 表达增加),而当外界压力/刺激消失后又逐渐恢复腺泡细胞表型.因此,评估A DM的水平也能从另一个角度反映A P的严重程度及随之而来的胰腺损伤过程.基于此,利用免疫组化染色发现,与S a l C t r l组相比,C e r A P组中腺泡标志物a m y l a s e表达水平下降(图 E、F,P )但导管标志物C K 表达水平显著升高(即炎症诱导A DM过程增强,图 E、F,P),而槐耳治疗显著降低了炎症诱导的C K 水平升高(图 E、F,P),且对a m y l a s e的表达有恢复作用(图 E、F,P).以上结果表明,槐耳治疗可明显抑制A DM形成,即减少胰腺腺泡细胞的损伤和增强胰腺腺泡细胞对外界刺激的抵御.槐耳降低A P时胰腺组织细胞焦亡相关蛋白的表达S a l C t r l组、C e r A P组和C e r A P槐耳组小鼠胰腺组织免疫组化染色结果显示,小鼠发生A P时腺泡细胞中焦亡关键分子G S DMD的蛋白表达显著升高(图 A、B,P),而槐耳治疗可显著降低炎症诱 导 的 腺 泡 细 胞G S DMD表 达(图 A、B,P);进一步使用W e s t e r nb l o t t i n g检测也发现,相比对照组小鼠,雨蛙肽诱导A P组小鼠胰腺组织中焦亡相关分子(G S DMD、N L R P、p r o c a s p a s e、c a s p a s e 以及A S C)高表达,而这一效应被槐耳有效抑制(图 C).既往研究表明,腺泡细胞焦亡是胰腺炎发生发展过程中的关键环节,因此推测槐耳对A P的保护作用可能是通过抑制腺泡细胞焦亡实现的(图 D).A B:各组A P小鼠胰腺G S DMD免疫组化染色结果及染色评分统计分析;C:各组A P小鼠胰腺组织蛋白提取物焦亡相关蛋白W e s t e r nb l o t t i n g结果;D:槐耳抑制N L R P 小体激活模式图.P.图槐耳降低A P时胰腺组织细胞焦亡相关蛋白的表达F i g H u a i e r s u p p r e s s e dt h ee x p r e s s i o np y r o p t o s i s r e l a t e dm o l e c u l e s i nA Pt i s s u e s期龚梦元,张博,朱泽恩,等槐耳清膏通过抑制R O S介导的腺泡细胞焦亡减轻小鼠急性胰腺炎的严重程度本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版槐耳减少A P诱导的胰腺腺泡细胞焦亡S a l C t r l组小鼠胰腺组织的亚细胞结构的透射电镜观察显示正常的胰腺腺泡细胞结构,表现为正常形态的细胞核、线粒体、酶原颗粒、内质网以及完整且连续的细胞膜结构;A P组小鼠发生焦亡的细胞数量明显变多,表现为细胞核染色质外周浓缩、细胞核坍塌、内质网和线粒体水肿扩张、细胞膜不连续、细胞肿胀,导致腺泡细胞结构模糊不清、酶原颗粒数量明显减少且部分已经分散在间质中,胰腺组织的正常结构也被不同程度地破坏(已经观察不到清晰的胰腺小叶结构和细胞之间的连接);而经过槐耳治疗后,小鼠胰腺组织的整体损伤水平显著降低,可观察到较为清晰的细胞连接和空隙,胰腺小叶结构清楚,损伤的腺泡细胞数量显著减少,单个腺泡细胞而言损伤程度也明显减弱,细胞膜的连续性得以保留,细胞核清晰可见,酶原颗粒数量得到恢复,细胞结构较为清晰(图 A).综上所述,体内应用槐耳治疗能有效抑制A P诱导的胰腺腺泡细胞焦亡.体外分别用雨蛙肽和槐耳干预 细胞,用透射电镜观察其超微结构的结果显示,对照组 细胞饱满,具有正常的细胞核、线粒体、内质网以及完整连续的细胞膜结构;而雨蛙肽刺激后,细胞核坍塌,细胞、内质网和线粒体肿胀、细胞灰度值明显降低、细胞膜不连续、细胞正常结构模糊不清,发生细胞焦亡的数量也明显升高(图 B,P);而经过槐耳治疗后,细胞的超微结构破坏减弱,相对雨蛙肽刺激组完整,焦亡数量也明显减少(图 B、C,P).此外,W e s t e r nb l o t t i n g检测各组 细胞中焦亡相关分子的表达结果显示(图 D),雨蛙肽刺激组 细胞的N L R P、N G S DMD、c a s p a s e 和A S C表达较对照组均显著升高,表明与体内表现一致,在雨蛙肽刺激后腺泡细胞焦亡增加;而用槐耳干预后,焦亡相关分子的表达被显著抑制.综上所述,体外应用槐耳干预亦能有效抑制雨蛙肽诱导的胰腺腺泡细胞焦亡.A、B:各组A P小鼠胰腺透射电镜观察结果;C D:各组 胰腺腺泡细胞系透射电镜观察结果及焦亡细胞数目统计分析;D:各组 胰腺腺泡细胞系焦亡相关蛋白的W e s t e r nb l o t t i n g检测结果.P.图槐耳减少A P诱导的胰腺腺泡细胞焦亡F i g H u a i e r i n h i b i t e dt h ep y r o p t o s i so f a c i n a r c e l l s i n d u c e db yA Pt i s s u e s西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第 卷本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版槐耳抑制雨蛙肽诱导的腺泡细胞R O S产生利用R O S探针D C F H D A检测细胞内氧化应激水平可以发现,阴性对照组 细胞的状态良好且在细胞内没有明显的R O S产生.而雨蛙肽刺激后,部分 细胞出现细胞膜破裂坏死,细胞内探及荧光较强,即R O S产生较多(图 A、B,P ).槐耳干 预 于 雨 蛙 肽 刺 激 下 的 细 胞 后,胞 内R O S水平比对照组有不同程度的升高,但远低于雨蛙肽组(图 A、B,P),同R O S清除剂NA C(阳性对照)起到相似的效果(图 A、B,P),提示槐耳能抑制雨蛙肽诱导的腺泡细胞R O S产生.而研究表明R O S是启动细胞焦亡的关键诱因之一,有趣的是W e s t e r nb l o t t i n g检测结果也显示,相较于NA C,槐耳干预组焦亡分子的蛋白表达并无显著差异(图 C),而阳性对照组与单纯雨蛙肽干预组相比焦亡相关分子的蛋白明显降低(图 C),说明在清除雨蛙肽诱导的 细胞的R O S产生后,可显著降低 细胞焦亡,而槐耳确能有效清除R O S.综上结果表明,槐耳抑制雨蛙肽刺激诱导的 细胞的焦亡,并可能是通过降低腺泡细胞R O S水平实现的.槐耳抑制R O S介导的腺泡细胞焦亡如图 A和图 B所示,同雨蛙肽一样,HO干预明显升高 细胞中的R O S水平,而槐耳和NA C干预后均可显著降低两者诱导的R O S水平升高(P).且用W e s t e r nb l o t t i n g进行焦亡相关蛋白的检测也表明,与用雨蛙肽刺激下的 细胞相比,HO同样可以促进焦亡关键蛋白(N L R P、N G S DMD等)的表达(图 C),即R O S能明显诱导腺泡细胞焦亡,而这一效应可被槐耳显著抑制(图 C),提示槐耳通过降低炎症背景下腺泡的R O S水平来抑制胰腺细胞的焦亡.A、B:各组 胰腺腺泡细胞系明场及R O S荧光探针染色结果及统计分析;C:各组 胰腺腺泡细胞系蛋白提取物焦亡相关蛋白W e s t e r nb l o t t i n g结果.P.图槐耳抑制雨蛙肽诱导的腺泡细胞R O S产生F i g H u a i e r s u p p r e s s e dt h eR O Sp r o d u c t i o n i na c i n a r c e l l s i n d u c e db yc e r u l e i n期龚梦元,张博,朱泽恩,等槐耳清膏通过抑制R O S介导的腺泡细胞焦亡减轻小鼠急性胰腺炎的严重程度本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版A B:各组 胰腺腺泡细胞系明场及RO S荧光探针染色结果及统计分析;C:各组 胰腺腺泡细胞系蛋白提取物焦亡相关蛋白W e s t e r nb l o t t i n g结果.P.图槐耳抑制R O S介导的腺泡细胞焦亡F i g H u a i e r i n h i b i t e dt h eR O S i n d u c e dp y r o p t o s i s i na c i n a r c e l l s讨论A P是一种复杂的外分泌疾病,具体发病机制目前尚不明确,目前普遍认为其发病与致病机理与级联炎性反应、氧化应激、微循环障碍和肠道菌群移位等多种病理改变密切相关.一般情况下,轻型A P多为自限性疾病,会在短期内痊愈,但有 的A P患者会发展为中度、重度A P,患者腺泡细胞大量死亡、胰酶被大量释放从而导致严重的局部炎症反应乃至全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征,这 是 临 床 上A P导 致 患 者 死 亡 的 主 要 原因.因此,如何抑制胰腺腺泡细胞死亡破裂,降低多种炎症因子的释放,从而减弱局部和全身的炎症反应,对于治疗A P是一个重要的思路.槐耳颗粒已经被国家食品药品监督管理总局批准用于临床治疗,因其抗肿瘤特性临床上主要用于肝癌患者的治疗,故大量研究集中于抗肿瘤治疗,如乳腺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌等 ,.但近年来也有研究证实槐耳的抗炎作用,如对实验性结肠炎、系膜增生性肾小球肾炎的治疗作用,且研究表明槐耳对正常肝肾几乎没有细胞毒性.此外,近年来,关于细胞死亡方式和途径一直是研究的热点.细胞焦亡是一种程序性炎性死亡的方式,在细菌病毒等信号的刺激下,细胞内的模式识别受体(如NO D样受体家族和P YH I N家族)作为感受器(主要为N L R P 蛋白),识别病原抗原信号,并与接头蛋白A S C和p r o c a s p a s e 结合形成多蛋白复合体 炎性小 体,同 时 切 割p r o c a s p a s e ,产 生 有 活 性 的c a s p a s e .而c a s p a s e 在细胞焦亡过程中又有两个功能:一方面切割并激活炎症因子I L 和I L ,释放到细胞外,招募大量炎症细胞扩大炎症反应;另一方面c a s p a s e 可以切割G S DMD蛋白两个结构域中间的连接区域,产生含有碳端的肽段和含有氮端活性域的肽段(N G S DMD),多个N G S DMD形成寡聚体,并转位到细胞膜上进行打孔,使得细胞内外相通,破坏细胞膜内外的渗透压平衡,导致细胞不断肿胀直西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第 卷本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版至破裂死亡,还能使得更多的炎症因子如I L 和I L 释放到胞外引发强烈的炎症反应 .既往研究证实,A P胰腺的腺泡细胞发生了焦亡,抑制焦亡可能是A P靶向治疗的潜在方向,且小鼠腺泡细胞G S DMD特异性敲除可以有效地抑制A P的发展.本研究结果提示,槐耳可有效降低A P组织中G S DMD等焦亡关键分子的表达,有效地抑制了腺泡细胞的焦亡.炎症反应可诱导诱导型一氧化氮合酶,再通过过度激活的炎症细胞浸润促进R O S水平的升高,导致A P胰腺组织中的氧化应激反应.A P状态下多种氧化应激反应的关键分子,如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等水平明显升高,从而和多种炎症因子共同触发并激活丝裂原活化蛋白激酶(m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e,MA P K)和核因子 B(n u c l e a rf a c t o r B,N F B),导致了炎症反应的级联扩增 .此外,R O S还可以攻击和破坏细胞内细胞器,如线粒体等.线粒体外膜的电压依赖性阴离子通道可被R O S氧化,进而正反馈调节线粒体中的R O S产生,并且进一 步 激 活N L R P 炎 症 小体.多项研究也证实了抗氧化治疗可以显著降A P时低胰腺组织的氧化损伤以及炎症细胞浸润.本研究用雨蛙肽腹腔注射诱导A P小鼠模型,首次发现槐耳是通过抑制腺泡细胞的焦亡对A P产生治疗作用,且进一步的体外试验表明槐耳是通过降低R O S水平来抑制胰腺腺泡细胞焦亡的,但对于槐耳清除R O S的具体作用机制有待进一步研究;其次,在本研究中各组实验小鼠的样本量均为只,数量上有所欠缺;此外,在A P中,腺泡细胞不是唯一受损的细胞类型,导管细胞和间质细胞也同样重要.本研究证实了槐耳对A P腺泡细胞的影响,但并未研究其对其他类型细胞的作用.综上所 述,本 研 究 发 现 槐 耳 清 膏 通 过R O S/N L R P 途径抑制腺泡细胞焦亡和炎症细胞浸润来减弱炎症反应和减少胰腺损伤.研究结果表明,槐耳作为治疗A P的天然药物具有一定治疗潜力.参考文献:GARDN E R T BA c u t epa n c r e a t i t i sJA n nI n t e r n M e d,():I T C I T C B OXHO O RNL,VO E RMAN SRP,B OUWE N S ESA,e ta l A c u t epa n c r e a t i t i sJ L a n c e t,():ME D E RO SM A,R E B E RHA,G I RG I SM D A c u t epa n c r e a t i t i s:ar e v i e wJ J AMA,():DU W Y,L I U G,S H IN,e ta l A m i c r o RNAc h e c kpo i n t f o rC as ign a l i nga n do v e r l o a d i na c u t epa n c r e a t i t i sJ M o lT h e r,():Z Y CH L I N S KY A,P R E VO S T M C,S AN S ON E T T IPJ S h i ge l l af l e x n e r ii n d u c e sapopt o s i si ni n f e c t e d m a c r oph age sJN a t u r e,():YUP,ZHANG X,L I UN,e t a l Pyr opt o s i s:m e c h a n i s m s a n dd i s e a s e sJ S ign a lT r a n s d u c tT a rge tT h e r,():L IH Y,L I NYJ,ZHANGL,e t a l P r ogr e s so fp yr opt o s i s i na c u t epa n c r e a t i t i sJ C h i n M e dJ(E ngl),():F ANR,S U I JD,DO NGXP,e ta l W e d e l o l a c t o n ea l l e v i a t e sa c u t epa n c r e a t i t i s a n da s s o c i a t e d l u ngi nju ryv i aG P X m e d i a t e ds up pr e s s i o no fp yr opt o s i sa n df e r r opt o s i sJ F r e eR a d i cB i o lM e d,:Z OU Y M,X I O NG H,X I O NG H H,e ta l Apo lys a c c h a r i d ef r o m m u s h r o o m H u a i e rr e t a r d sh u m a nh epa t o c e l l u l a rc a r c i n o m agr o w t h,a ngi oge n e s i s,a n d m e t a s t a s i si nn u d e m i c eJT u m o u rB i o l,():CH E NQ,S HU C,L AUR E N C EA D,e ta l E f f e c to fh u a i e rgr a n u l