滇杨组织培养再生及遗传转化体系建立.pdf

滇杨组织培养再生及遗传转化体系建立张晓琳1，纵丹1,2，李嘉其1，杨玲1，余进德1，何承忠1,2（1.西南林业大学云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室，云南昆明650224；2.西南林业大学西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室，云南昆明650224）摘要：【目的目的】建立高效的滇杨 Populus yunnanensis 离体叶片再生及遗传转化体系，有助于滇杨基因工程育种研究。【方法方法】以滇杨叶片为外植体，研究不同植物生长调节剂组合对叶片愈伤组织和不定芽诱导及生根的影响，从而获得滇杨再生组培苗；进一步以农杆菌 Agrobacterium tumefaciens 介导法探讨菌液吸光度、侵染时间和共培养时间等对滇杨遗传转化效率的影响。【结果结果】滇杨愈伤组织诱导的最适培养基为 1/2MS+0.005mgL1噻苯隆(TDZ)+0.010mgL1萘乙酸(NAA)，诱导率达 91.7%；不定芽诱导的最佳培养基为 1/2MS+0.002mgL1TDZ+0.010mgL1NAA，诱导率为75.0%；生根最适培养基为 1/2MS+0.010mgL1NAA+0.100mgL1吲哚乙酸(IBA)，生根率高达 96.7%，平均生根数为 2.57 条。利用 pBI121-GUS 载体转化滇杨，最适转化菌液吸光度 D(600)为 0.2，侵染时间为 5min，共培养时间为 2d；在分化过程中，抑制农杆菌生长的头孢霉素(Cef)最佳质量浓度为 200mgL1，抗性筛选中最佳培养基的卡那霉素(Kan)质量浓度为 20mgL1。对再生植株进行-D-葡萄糖苷酸酶(GUS)组织化学染色和 PCR 鉴定，获得 20 株阳性植株，转化阳性率为 45.45%。【结论结论】本研究成功建立了滇杨离体叶片再生和遗传转化体系。图 5 表 5 参 27关键词：滇杨；叶片；愈伤组织；再生体系；遗传转化中图分类号：S722.3文献标志码：A文章编号：2095-0756(2024)02-0314-08RegenerationsystemandgenetictransformationofPopulus yunnanensisZHANGXiaolin1，ZONGDan1,2，LIJiaqi1，YANGLing1，YUJinde1，HEChengzhong1,2（1.KeyLaboratoryforForestGeneticandTreeImprovement&PropagationinUniversitiesofYunnanProvince,Southwest Forestry University,Kunming 650224,Yunnan,China;2.Key Laboratory for Forestry ResourcesConservation and Utilization in the Southwest Mountains of China,Ministry of Education,Southwest ForestryUniversity,Kunming650224,Yunnan,China）Abstract:ObjectiveThisstudyisaimedtoestablishahighlyefficientsystemforregenerationandgenetictransformationofin vitroleavesofPopulus yunnanensissoastohelpgeneticengineeringbreedingresearchinP.yunnanensis.MethodFirst,withP.yunnanensisleavesasexplants,aninvestigationwasconductedoftheeffectsofdifferentcombinationsofexogenoushormoneconcentrationsontheinductionofcallus,adventitiousbuddifferentiationandrootingsoastoobtainregeneratedseedlingsofP.yunnanensis.Then,Agrobacteriumtumefaciensmediatedmethodwasusedtoexploretheeffectsofbacterialconcentration,infectiontimeandco-culturetimeonthegenetictransformationefficiencyofP.yunnanensis.ResultTheoptimalmediumforcallusinductionwas1/2MS+0.005mgL1thidiazuron(TDZ)+0.010mgL11-naphthylaceticacid(NAA),withaninductionrateof91.7%.Theoptimalmediumfortheinductionofadventitiousbudwas1/2MS+0.002mgL1TDZ+0.010mgL1NAA,withaninductionrateof75.0%whereastheoptimalmediumforrooting收稿日期：2023-05-15；修回日期：2023-12-13基金项目：国家自然科学基金资助项目(31860219)；云南省教育厅自然科学基金资助项目(2021Y272)作者简介：张 晓 琳(ORCID:0009-0005-9384-3844)，从 事 林 木 育 种 与 分 子 生 物 学 研 究。E-mail:。通信作者：何承忠(ORCID:0000-0001-9487-8612)，教授，博士，从事林木育种与分子生物学研究。E-mail:浙江农林大学学报，2024，41（2）：314321Journal of Zhejiang A&F Universitydoi:10.11833/j.issn.2095-0756.20230304was1/2MS+0.010mgL1NAA+0.100mgL13-indolebutyricacid(IBA),andtherootingratewasashighas96.7%,withanaveragenumberof2.57roots.TheoptimalconcentrationoftransformingbacteriumD(600)was0.2,theinfectiontimewas5min,andtheco-cultivationtimewas2days.Duringdifferentiation,theoptimalconcentrationofcefotaximetoinhibitthegrowthofA.tumefacienswas200mgL1,andtheoptimalconcentrationofkanamycininthescreeningmediumforresistantbudswas20mgL1.Theregeneratedplantswere identified by-glucuronidase(GUS)staining and PCR,identified 20 positive plants,with a positivetransformationrateof45.45%.ConclusionTheleafregenerationsystemandgenetictransformationsystemofP.yunnanensisweresuccessfullyestablished.Ch,5fig.5tab.27ref.Key words:Populus yunnanensis;leaf;callus;regenerationsystem;genetictransformation滇杨 Populus yunnanensis 为杨柳科 Salicaceae 杨属 Populus 青杨派树种，主要分布于云南中北部和南部、贵州西部及四川西南部等地区1。因速生性强、易无性繁殖和适应性强等优良特性2，滇杨在中国西南地区具有重要的经济、生态和社会效益3。但传统的滇杨遗传育种面临易感染黑斑病以及易遭蛀干虫害等问题1。相比之下，转基因育种能够将所需基因引入植物基因组培育新品种以及创制新种质4。然而，有效遗传转化体系的缺乏严重制约了滇杨转基因育种和功能基因组研究。目前，有关滇杨再生体系的建立鲜有报道，仅有张春霞等5、辛培尧等6以滇杨叶片、叶柄和茎段为外植体进行不定芽的诱导，但均难以形成愈伤组织，不利于滇杨的高效再生和遗传转化研究。而关于滇杨遗传转化的研究尚未开展。据此，本研究以滇杨叶片为外植体，探讨植物生长调节剂对叶片愈伤组织、不定芽及生根的影响，从而建立高效的滇杨再生体系。在此基础上，利用农杆菌 Agrobacteriumtumefaciens 介导法对滇杨进行遗传转化研究，进而解析影响滇杨转化效率的各种因素，以期为滇杨的快速繁殖、定向育种及种质资源保存提供科学依据。1材料与方法1.1材料1.1.1植物材料以西南林业大学苗木基地栽培的 10 年生滇杨优株为母株，采集 1 年生枝条，剪切为45cm 长度的枝段，于室温条件下水培，取嫩叶作为试验材料。1.1.2载体菌株根癌农杆菌为 GV3101，含-D-葡萄糖苷酸酶(GUS)报告基因及卡那霉素(Kan)筛选标记的质粒载体 pBI121(pBI121-GUS)，菌株和质粒均由实验室保存。1.2方法1.2.1外植体消毒以嫩叶作为外植体，将叶片冲洗干净后置于体积分数为 2%的次氯酸钠(NaClO)消毒 150s，用体积分数为 75%的乙醇浸泡 10s，无菌水清洗 3 次，用无菌滤纸吸干叶片表面水分。将叶片剪切成 1.0cm2小方块(叶盘)，叶背向下接种于分化培养基上。1.2.2愈伤组织及不定芽诱导将叶盘接种于含有噻苯隆(TDZ，质量浓度分别为 0.001、0.002、0.005mgL1)、萘乙酸(NAA，质量浓度分别为 0.010 和 0.050mgL1)的 MS 和 1/2MS 培养基上进行诱导分化。每瓶接种 4 个外植体，每个处理接种 10 瓶，置于暗条件下培养，30d 后统计愈伤组织诱导率。将获得的愈伤组织继续接种于上述培养基中进行不定芽诱导，置于光条件下培养，30d 后统计不定芽诱导率。1.2.3生根培养基筛选以 1/2MS 为基本培养基，添加不同质量浓度组合的 NAA(0、0.010、0.050、0.100mgL1)和吲哚乙酸(IBA，0、0.010、0.050、0.100mgL1)。待不定芽生长至 23cm 时转接于生根培养基中，每瓶接种 3 个不定芽，每个处理接种 10 瓶，置于光条件下培养，30d 后统计生根率和单株生根数。以上培养基均添加 20.0gL1蔗糖和 4.5gL1琼脂，在光照强度为 20002500lx、光照时间为 12h(光)/12h(暗)、温度为(252)条件下培养。1.2.4抑菌剂头孢霉素(Cef)质量浓度的确定采用液氮速冻法将 pBI121-GUS 质粒转化至农杆菌中，加第 41 卷第 2 期张晓琳等：滇杨组织培养再生及遗传转化体系建立315入 LB 培养液，置于 28 恒温振荡培养箱(200rmin1)培养，待菌液吸光度 D(600)达 0.60.8 时，吸取菌液，涂布于添加不同质量浓度头孢霉素(0、100、200、300 和 400mgL1)的 LB 固体培养基上，28 倒置培养 48h，观察农杆菌生长情况。同时，将叶盘接种于添加不同质量浓度头孢霉素(0、100、200、300 和 400mgL1)的分化培养基上进行筛选，每瓶接种 3 个叶盘，每个处理接种 10 瓶。30d 后统计分化率。1.2.5筛选剂卡那霉素(Kan)质量浓度的确定将叶盘接种于添加不同质量浓度卡那霉素(0、10、20、30 和 40mgL1)的分化培养基中进行筛选。每瓶接种 3 个叶盘，每个处理接种 10 瓶，置于暗条件下培养，30d 后观察统计不定芽生长情况。1.2.6菌液吸光度、侵染时间、共培养时间的筛选取 1.2.3 获得的滇杨组培苗，将叶片剪切为 1.0cm2叶盘，采用吸光度 D(600)为 0.2、0.6 和 1.0 的农杆菌菌液对其侵染，每种浓度侵染时间分别为 5、10 和 15min，侵染后分别进行共培养 0、2 和 4d。将共培养后的叶盘接种于含有头孢霉素和卡那霉素筛选培养基进行筛选。40d 后统计产生抗性芽的叶盘数，并统计转化率，转化率=产生抗性芽的叶盘数/叶盘总数100%。当抗性芽高度达 23cm 时，接种至生根培养基中培养约 20d。1.2.7阳性植株检测取 1.2.6 中的抗性植株及野生型再生苗的叶片置入 GUS 染色液(体积比为 X-GlucSolutionGUSBuffer=150)中，抽真空 30min，37 保育 24h，体积分数为 75%的乙醇脱色 3h，观察叶片着色情况。进一步将 GUS 染色为蓝色的植株提取基因组 DNA，以野生型再生苗为阴性对照，PCR 扩 增 GUS 基 因，引 物 序 列 为 GUS-F：5-TCTCAGAAGACCAAAGGGCAA-3 ；GUS-R：5-TGCGCCAGGAGAGTTGTTG-3，片段大小为 2239bp。PCR 扩增体系：12.5LTaqPCRMasterMix，1.0LDNA 模板，GUS-F 和 GUS-R(10.0molL1)各 1.0L，ddH2O 补足至 20.0L。扩增条件：94预变性 5min；94 变性 30s，55 退火 30s，72 延伸 1min，30 个循环；72 延伸 10min。1.3数据分析所有数据采用 Excel2016 进行记录处理，利用 SPSS26.0 进行单因素方差分析(ANOVA)，采用Duncans 法进行差异显著性分析。2结果与分析2.1植物生长调节剂对滇杨愈伤组织和不定芽诱导的影响将滇杨叶盘接种于含 TDZ 和 NAA 的 MS 和 1/2MS 培养基上，20d 后叶盘切口处形成淡绿色瘤状组织且出现芽点。接种于 MS 培养基的叶盘在 30d 后仅于切口处长出少量愈伤组织(图 1A)，而接种于 1/2MS 培养基的叶盘均分化出紧密的淡绿色愈伤组织(图 1B)。因此，选取 1/2MS 作为基本培养基进行愈伤组织和不定芽的诱导。此外，将叶盘(图 2A)置于含有 TDZ 和 NAA 不同质量浓度组合的 1/2MS 培养基上，30d 后统计愈伤组织诱导率及生长情况。结果表明(表 1)：组合 0.005mgL1TDZ 和 0.010mgL1NAA 培养基中的诱导效果最好，愈伤组织紧实，呈浅绿色(图 2B)，且诱导率达 91.70%。将上述愈伤组织转接入含有 TDZ 和 NAA 不同质量浓度组合的分化培养基中，30d 后统计不定芽诱导率及芽生长状况。由表 2 可知：在分化培养基中，组合 0.002mgL1TDZ和 0.010mgL1NAA 培养基诱导不定芽的效果最佳，诱导率达 75.00%，与其余组合的差异均达到显著水平(P0.05)，且不定芽健壮、生长旺盛(图 2C)。2.2植物生长调节剂对不定芽生根的影响从表 3 可见：在组合为 0.010mgL1NAA 和 0.100mgL1IBA 的培养基中，植株生长旺盛(图 3A)，生根率高达 96.70%，平均生根数为 2.57 条，均有较多的侧根及根毛(图 3B)；其次为组合 0.010mgL1NAA 和 0.050mgL1IBA 培养基，苗木长势较好，生根率为 83.30%，平均生根数为 1.93 条。此外，当A.MS培养基；ABB.1/2 MS培养基。图1滇杨叶片愈伤组织的诱导Figure1InductionofcallusinleavesofP.yunnanensis316浙江农林大学学报2024 年 4 月 20 日NAA 为 0.010mgL1时，随着 IBA 质量浓度的增加，生根率逐渐升高，平均生根数也逐渐增多，同时不定根和组培苗的长势逐渐增强。而 IBA 为0.010mgL1时，随着 NAA 质量浓度的增加，生根率逐渐降低，平均生根数逐渐减少，不定根和组培苗的长势减弱。因此，组合 1/2MS、0.010mgL1NAA、0.100mgL1IBA 培养基适合不定芽的生根诱导。2.3头孢霉素对叶盘及农杆菌生长的影响图 4 可见：当头孢霉素质量浓度为 0 时，农杆表1TDZ 和 NAA 对愈伤组织诱导的影响Table1EffectsofTDZandNAAoncallusinduction植物生长调节剂组合愈伤组织诱导率/%愈伤组织状况TDZ/(mgL1)NAA/(mgL1)0.0010.01036.0012.73e浅黄色，疏松，长势较差0.0010.05055.6012.72d浅黄色，疏松，长势较差0.0020.01063.909.64cd浅绿色，疏松，长势一般0.0020.05083.308.35abc浅绿色，紧实，长势一般0.0050.01091.708.35ab浅绿色，紧实，长势较好0.0050.05077.804.79bc浅绿色，紧实，长势一般说明：数据为平均值标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P0.05)。表2TDZ 和 NAA 对不定芽诱导的影响Table2EffectsofTDZandNAAonadventitiousbudinduction植物生长调节剂组合不定芽诱导率/%不定芽生长状况TDZ/(mgL1)NAA/(mgL1)0.0010.0108.3014.43cd苗矮小，生长较差0.0010.0505.504.79cd苗矮小，生长较差0.0020.01075.0014.43a苗健壮，生长旺盛0.0020.05019.504.79bc苗细弱，生长一般0.0050.01027.8012.73b苗细弱，生长一般0.0050.05016.6014.43bcd苗细弱，生长一般说明：数据为平均值标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P0.05)。表3NAA 和 IBA 对不定芽生根的影响Table3EffectsofNAAandIBAontherootingofadventitiousbud植物生长调节剂组合生根率/%平均生根数/条生长状态NAA/(mgL1)IBA/(mgL1)0.0000.00063.305.77bc1.330.49bc主根细长、无侧根苗长势较好0.0100.00056.7015.28c0.970.51c主根短少、侧根少、苗长势一般0.0100.10096.705.77a2.570.25a主根粗壮、侧根发达、苗健壮0.0100.05083.305.77ab1.930.57ab主根较粗、侧根较多、苗长势较好0.0100.01066.7015.28bc1.100.44c主根粗壮、侧根较少、苗长势一般0.0000.01070.0010.00bc1.230.30bc主根短少、侧根少、苗长势一般0.0500.01063.305.77bc0.770.15c茎部有短根、苗长势一般0.1000.01060.0026.46bc0.700.40c主根短少、侧根少、苗长势一般说明：数据为平均值标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P0.05)。A.叶盘；B.愈伤组织诱导；C.不定芽诱导。ABC图2滇杨不定芽诱导Figure2InductionofadventitiousbudsinP.yunnanensisA.再生植株；B.不定根。AB图3滇杨不定芽生根诱导Figure3InductionofadventitiousrootinginP.yunnanensis第 41 卷第 2 期张晓琳等：滇杨组织培养再生及遗传转化体系建立317菌生长迅速，但随着头孢霉素质量浓度的增加，农杆菌的数量逐渐减少，当头孢霉素质量浓度200mgL1时，可较好地抑制农杆菌的生长，此时，农杆菌数量为 0(图 4)。此外，将叶盘接种至含有不同质量浓度头孢霉素(0、100、200、300 和 400mgL1)培养基中进行培养，结果表明头孢霉素质量浓度为 0 时，叶盘分化率为 97.20%，随着头孢霉素质量浓度的增加，叶盘的分化率无显著差异(表 4)。因此，选取200mgL1头孢霉素作为后续抑制农杆菌生长的最佳质量浓度。AE表示头孢霉素质量浓度分别为0、100、200、300、400 mgL1。ABCDE图4不同质量浓度头孢霉素对农杆菌的抑制Figure4InhibitionofdifferentconcentrationofcefotaximeonA.tumefaciens2.4卡那霉素质量浓度对叶盘诱导不定芽的影响由表 5 可知：当卡那霉素质量浓度为 0 时，叶盘分化率为 88.90%。随着卡那霉素质量浓度的增加，叶盘分化率急剧下降。当卡那霉素质量浓度20mgL1时，叶盘生长速度缓慢，叶盘开始变黄甚至褐化，且分化率均为 0。因此，选取 20mgL1卡那霉素对滇杨转化植株进行抗性筛选。2.5农杆菌菌液吸光度、侵染时间及共培养时间对滇杨遗传转化效率的影响由图 5 可知：菌液 D(600)=0.2 时的转化率显著高 于 0.6 和 1.0 时(P 0.05)，此 时 转 化 率 最 高(50%)，随着 D(600)的增加，转化率明显降低，可能由于较高的 D(600)对叶盘产生了毒害作用(图 5A)；侵染时间为 5min 时，转化率显著高于 10 和 15min，随着侵染时间的增加，转化率呈下降趋势(图5B)；共培养 2d 时，转化率最高，而较短的共培养时间和较长的共培养时间均导致转化效率降低，这是由于时间较短不利于基因与外植体整合，而时间较长会对叶盘造成伤害(图 5C)。因此，菌液 D(600)为0.2，侵染时间为 5min，共培养时间为 2d 时，转化效率最高。2.6转化植株的阳性鉴定通过农杆菌转化共获得 44 株抗性植株，分别取抗性植株叶片和茎段进行 GUS 染色。图 6 表明：有20 株的叶片和茎段均显蓝色，说明 GUS 基因已成功转入滇杨并且能顺利表达。进一步提取经 GUS 染色表4头孢霉素对滇杨不定芽分化的影响Table4EffectofcefotaximeonregenerationoftheadventitiousbudsofP.yunnanensis头孢霉素质量浓度/(mgL1)诱导率/%生长状况097.204.79a不定芽多，生长正常10088.9012.73a不定芽较多，生长正常20083.308.35a不定芽较多，生长正常30083.308.35a不定芽较多，生长正常40083.308.35a不定芽较多，生长正常说明：数据为平均值标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P0.05)。表5不同质量浓度卡那霉素对叶盘分化的影响Table5Effectsofdifferentconcentrationsofkanamycinonleafdiscdifferentiation卡那霉素质量浓度/(mgL1)诱导率/%生长状况088.9012.73a产生大量不定芽1038.9012.73b产生少量不定芽200.000.00c生长速度缓慢，无不定芽的形成300.000.00c叶盘变黄400.000.00c叶盘变黑死亡说明：数据为平均值标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P0.05)。0.202040转化率/%60020406002040600.61.0菌液吸光度51015024侵染时间/min共培养时间/dAabcabcababBC不同字母表示差异显著(P0.05)。图5不同因素对滇杨转化率的影响Figure5EffectsofdifferentfactorsinthetransformationefficiencyofP.yunnanensis318浙江农林大学学报2024 年 4 月 20 日鉴定的基因组 DNA，进行 GUS 基因(预期 2239bp)的 PCR 扩增，结果显示：经染色鉴定为阳性的植株均可扩增出清晰的 GUS 基因条带(图 7)。最终获得阳性植株 20 株，阳性率为 45.45%。A.阴性植株叶片；B.阳性植株叶片；C.阴性植株茎段；D.阳性植株茎段。2 mm2 mm2 mm2 mmABCD图6再生植株 GUS 染色结果Figure6GUSstainingresultsofregeneratedplantsM.标记物；.阴性对照(野生型植株)；+.阳性对照(质粒)；120.阳性植株。3 000 bpM+12345678910111213141516171819202 000 bp图7GUS 基因 PCR 检测Figure7PCRanalysisofGUSgene3讨论与结论3.1植物生长调节剂对杨树组织培养的影响杨树 Populus 作为乔木树种的模式植物，一些种的再生体系已得到广泛研究，其中辽宁杨P.liaoningensis 和河北杨 P.hopeiensis 在以叶片为外植体进行愈伤组织诱导和不定芽分化时，均以MS 为最佳培养基78，而大青杨 P.ussuriensis 和毛果杨 P.trichocarpa 则以 WPM 培养基较为适宜910。本研究采用 MS 为基本培养基时，滇杨叶片外植体褐化较严重，而 1/2MS 基本培养基中的外植体呈嫩绿色，说明 1/2MS 培养基适合滇杨叶片外植体的培养，该结果也与张春霞等5的研究结果一致。表明不同杨树种的外植体愈伤组织和不定芽生长所需要的无机元素和营养物质具有差异性1113。植物生长调节剂的种类和质量浓度对植物愈伤组织和不定芽的诱导至关重要1415。本研究选取了不同质量浓度的 TDZ 和 NAA 进行组合添加至愈伤组织及不定芽诱导培养基中，发现 TDZ 质量浓度为0.005mgL1时，叶盘的愈伤组织诱导率较高，而当 TDZ 质量浓度为 0.001mgL1时，愈伤组织诱导率较低。同时，适宜质量浓度的 NAA(0.010mgL1)与低质量浓度的 TDZ(0.002mgL1)对不定芽的诱导有明显的促进作用。该结果与乌日罕等8对河北杨的研究结果一致。此外，杨树不定芽的生根是其再生的关键步骤16，青海青杨 P.cathayanavar.qinghai、胡杨 P.euphratica 和金叶杨 P.nigraJinye的最佳生根培养基为 1/2MS+IBA，生根率可达 90%以上1719，而彭言劼等20筛选出大叶杨 P.lasiocarpa 的最适生根培养基为 1/2MS+NAA。辛培尧等21研究发现：滇杨不定芽在 1/2MS+0.020mgL1NAA 生根培养基中进行培养，10d 开始生根。本研究在 1/2MS+0.010mgL1NAA+0.100mgL1IBA 培养基中，不定芽提前至 5d 开始生根，且根系粗壮，须根多，生根率高达 96.7%。说明采用 IBA 与 NAA 的组合更有利于滇杨不定芽的生根诱导。3.2筛选剂质量浓度对农杆菌介导的杨树遗传转化的影响在卡那霉素抗性筛选中，发现当卡那霉素质量浓度为 20mgL1时，滇杨叶盘的生长受到严重抑制，而李春利等22研究表明：当卡那霉素质量浓度为 30mgL1时，毛白杨 P.tomentosa 愈伤组织不能分化形成不定芽。说明不同树种的不同受体材料对筛选剂的敏感度不同，因此选择合适的筛选剂质量浓第 41 卷第 2 期张晓琳等：滇杨组织培养再生及遗传转化体系建立319度对获得转化植株至关重要23。此外，LI 等24选用 250mgL1头孢霉素作为毛果杨的抑菌浓度。而本研究发现：200mgL1头孢霉素就能完全抑制农杆菌生长，且对滇杨不定芽的生长影响较小。农杆菌质量浓度、侵染时间及共培养时间对植物的遗传转化效率起到重要作用2527。本研究对这 3 个因素分析发现：当菌液吸光度为 0.2，侵染时间为 5min，共培养为 2d 时，最有利于滇杨的遗传转化，这与 LI 等24在毛果杨中的研究结果相似。本研究以滇杨叶片为外植体，探讨了植物生长调节剂对叶片愈伤组织、不定芽诱导及其生根的影响，成功建立了滇杨离体叶片再生体系，并在此基础上，通过卡那霉素抗性筛选，利用农杆菌介导法从菌液吸光度、侵染时间和共培养时间开展了较为系统的研究，构建了滇杨的遗传转化体系。4参考文献何承忠,张志毅,陈宝昆,等.滇杨遗传改良策略初论J.西部林业科学,2004,33（1）:4448.HEChengzhong,ZHANGZhiyi,CHENBaokun,et al.PreliminaryexplorationongeneticimprovementstrategyofPopulusyunnanensisJ.Journal of West China Forestry Science,2004,33（1）:4448.1尹丽莎,陈杰,周军,等.滇杨根尖细胞染色体制片技术优化J.南方农业学报,2015,46（7）:12531258.YINLisha,CHENJie,ZHOUJun,et al.TechniqueoptimizationonchromosomepreparationofPopulus yunnanensisDoderoot-tipcellJ.Journal of Southern Agriculture,2015,46（7）:12531258.2何承忠,车鹏燕,周修涛,等.滇杨基因资源及其研究概况J.西南林学院学报,2010,30（1）:8388,94.HE Chengzhong,CHE Pengyan,ZHOU Xiutao,et al.A survey of research progress on gene resources of PopulusyunnanensisJ.Journal of Southwest Forestry University,2010,30（1）:8388,94.3ZHOUTingting,LINYing,LINYan,et al.RegenerationandAgrobacterium-mediatedgenetictransformationoftwelveEucalyptusspeciesJ/OL.Forestry Research,2022,2:152023-05-01.doi:10.48130/FR-2022-0015.4张春霞,樊军锋,黄建,等.滇杨的组织培养和植株再生J.植物生理学通讯,2006,42（6）:1131.ZHANGChunxia,FANJunfeng,HUANGJian,et al.TissuecultureandplantletgenerationofPopulus yunnanensisDodeJ.Plant Physiology Communications,2006,42（6）:1131.5辛培尧,刘岩,段安安,等.滇杨不同外植体分化培养研究J.云南农业大学学报,2011,26（6）:828832,860.XINPeiyao,LIUYan,DUANAnan,et al.StudyondifferentiationculturefromdifferentexplantsofPopulus yunnanensisJ.Journal of Yunnan Agricultural University,2011,26（6）:828832,860.6赵鑫闻,彭儒胜,赵继梅.辽宁杨叶片高频植株再生体系的建立J.中国农学通报,2015,31（10）:1316.ZHAO Xinwen,PENG Rusheng,ZHAO Jimei.Establishment of a highly efficient plant regeneration system of P.liaoningensisJ.Chinese Agricultural Science Bulletin,2015,31（10）:1316.7乌日罕,代金玲,白向东,等.河北杨叶片诱导不定芽再生体系的建立J.内蒙古农业大学学报(自然科学版),2021,42（4）:3438.Wurihan,DAIJinling,BAIXiangdong,et al.EstablishmentoftheregenerationsystemofPopulus hopeiensisleafinducedadventitiousbudsJ.Journal of Inner Mongolia Agricultural University(Natural Science Edition),2021,42（4）:3438.8姜洋,刘焕臻,李开隆.大青杨再生体系的优化J.东北林业大学学报,2017,45（4）:2832.JIANGYang,LIUHuanzhen,LIKailong.OptimizingPopulus ussuriensisregenerationsystemJ.Journal of NortheastForestry University,2017,45（4）:2832.9甄成.毛果杨组培再生及遗传转化体系研究D.哈尔滨:东北林业大学,2016.ZHENCheng.Study on Regeneration and Genetic Transformation System of Populus trichocarpa D.Harbin:NortheastForestryUniversity,2016.10马生健,刘金祥,曾富华,等.高羊茅高效组织培养再生体系的建立J.分子植物育种,2020,18（5）:16111616.MAShengjian,LIUJinxiang,ZENGFuhua,et al.EstablishmentofefficienttissuecultureregenerationsystemofFestucaaruudiuaceaJ.Molecular Plant Breeding,2020,18（5）:16111616.11SONGChengwei,LULiang,GUOYayu,et al.EfficientAgrobacterium-mediatedtransformationofthecommercialhybridpoplar Populus alba Populus glandulosa Uyeki J/OL.International Journal of Molecular Sciences,2019,20(10):25942023-05-01.doi:10.3390/ijms20102594.12王晨,张俊红,张苗,等.柳杉优良无性系组培快繁体系研究J.浙江农林大学学报,2020,37（4）:810816.13320浙江农林大学学报2024 年 4 月 20 日WANGChen,ZHANGJunhong,ZHANGMiao,et al.StudyonrapidpropagationsystemofsuperiorclonesinCryptomeriafortuneJ.Journal of Zhejiang A&F University,2020,37（4）:810816.BISWASKK,MOHRIT,KOGAWARAS,et al.AnimprovedsystemforshootregenerationfromstemexplantsofLombardypoplar(Populus nigraL.varitalicKoehne)J.American Journal of Plant Sciences,2012,3:11811186.14叶雯,袁超群,秦伟,等.火焰南天竹茎段离体培养再生体系的优化J.浙江农林大学学报,2020,37（2）:391396.YEWen,YUANChaoqun,QINWei,et al.OptimizationofregenerationsystemofstemsegmentsofNandina domesticaFirepowe