黄芪根腐病拮抗菌的筛选及生防机制.pdf

第6 0卷2 0 2 4年第2期 西 北 师 范 大 学 学 报(自然科学版)V o l.6 0 2 0 2 4 N o.2 J o u r n a l o f N o r t h w e s t N o r m a l U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e)D O I:1 0.1 6 7 8 3/j.c n k i.n w n u z.2 0 2 4.0 2.0 1 3收稿日期:2 0 2 3 1 1 0 5;修改稿收到日期:2 0 2 4 0 1 2 2基金项目:国家自然科学基金资助项目(4 2 2 7 7 3 1 7);陕西省重大科技专项(2 0 2 0 z d z x-0 3-0 2-0 1)作者简介:许磊磊(1 9 9 9),男,安徽淮南人,硕士研究生.主要研究方向为微生物资源利用.E m a i l:2 1 8 8 2 0 9 1 4 1q q.c o m*通讯联系人,教授.主要研究方向为微生物资源利用.E m a i l:l i z h e f e i n w a f u.e d u.c n黄芪根腐病拮抗菌的筛选及生防机制许磊磊,白晓丽,李哲斐*(西北农林科技大学 生命科学学院,陕西 杨凌 7 1 2 1 0 0)摘要:由F u s a r i u m o x y s p o r u m引起的根腐病是制约黄芪产量和品质的重要因素之一,为了获得环境适应性强且拮抗效果好的黄芪根腐病生防菌,以病原真菌F.o x y s p o r u m为指示菌,通过稀释涂布法和平板对峙实验从黄芪根和根际土壤中共分离得到1 9 7株细菌,其中2 0株细菌对病原真菌有拮抗作用,且2 0株拮抗菌中优势菌为芽孢杆菌.7株拮抗菌对病原真菌生长抑制率超过3 5%,用这7株细菌进行盆栽试验,结果表明,菌株A S 1对黄芪根腐病的防治效果最好,在接种病原菌第2 0 d时A S 1对黄芪根腐病的防效达4 6.8 6%.进一步研究发现,菌株A S 1基因组中含有伊枯草素、脂肽和杆菌霉素的编码基因,A S 1处理后病原真菌孢子萌发率下降了7 4.4%.接种A S 1第8 h后植物的苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶、多酚氧化酶、过氧化物酶、脂氧合酶活性和茉莉酸含量较不接种对照分别提高了1 6.0%,2 1.5%,1 0.6%,1 2.6%,1 4.2%和9 7.3%.此 外,A S 1处 理1 5 d后 使 黄 芪 的 根 长 和 株 高 分 别 增 加 了3 7.5 2%和1 2.7 8%.根据生理生化特征和1 6 S r D NA测序发现菌株A S 1归属于贝莱斯芽孢杆菌.因此,A S 1是一株具有较大应用潜力的生防和促生菌株.关键词:黄芪根腐病;生防菌;诱导性系统抗性;贝莱斯芽孢杆菌中图分类号:S 4 3 2.4 5 文献标志码:A 文章编号:1 0 0 1-9 8 8(2 0 2 4)0 2-0 0 7 7-0 9S c r e e n i n g o f a n t a g o n i s t i c b a c t e r i a a n db i o c o n t r o l m e c h a n i s m o f a s t r a g a l u s r o o t r o tXU L e i-l e i,B A I X i a o-l i,L I Z h e-f e i(C o l l e g e o f l i f e s c i e n c e,N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y,Y a n g l i n g 7 1 2 1 0 0,S h a a n x i,C h i a n)A b s t r a c t:R o o t r o t c a u s e d b y F u s a r i u m o x y s p o r u m i s o n e o f t h e i m p o r t a n t f a c t o r s r e s t r i c t i n g t h e y i e l d a n d q u a l i t y o f A s t r a g a l u s m o n g h o l i c u s.I n o r d e r t o o b t a i n b i o c o n t r o l b a c t e r i a w i t h e x c e l l e n t e n v i r o n m e n t a l a d a p t a b i l i t y a n d a n t a g o n i s t i c e f f e c t,a t o t a l o f 1 9 7 b a c t e r i a l s t r a i n s w e r e i s o l a t e d f r o m t h e r o o t s a n d r h i z o s p h e r e s o i l o f A s t r a g a l u s m o n g h o l i c u s v i a d i l u t i o n c o a t i n g m e t h o d a n d p l a t e c o n f r o n t a t i o n u s i n g F.o x y s p o r u m a s i n d i c a t o r p a t h o g e n.T w e n t y b a c t e r i a l s t r a i n s h a d t h e a b i l i t y t o i n h i b i t t h e g r o w t h o f f u n g a l p a t h o g e n i c m y c e l i a t h r o u g h p r e l i m i n a r y s c r e e n i n g,a n d t h e d o m i n a n t b a c t e r i a a m o n g t h e t w e n t y s t r a i n s w e r e B a c i l l u s.T h e i n h i b i t i o n r a t e o f 7 a n t a g o n i s t s t o f u n g a l m y c e l i a l g r o w t h w a s m o r e t h a n 3 5%,t h e s e 7 b a c t e r i a w e r e s e l e c t e d t o p e r f o r m p o t e x p e r i m e n t.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t s t r a i n A S 1 h a d t h e b e s t c o n t r o l e f f e c t o n a s t r a g a l u s r o o t r o t,a n d t h e c o n t r o l e f f e c t w a s 4 6.8 6%o n t h e 2 0 t h d a y a f t e r i n o c u l a t i o n o f A S 1.F u r t h e r s t u d i e s s h o w e d t h a t t h e g e n o m e o f s t r a i n A S 1 c o n t a i n e d t h e c o d i n g g e n e s o f i t u r i n,l i p o p e p t i d e a n d B a c i l y s i n.A f t e r A S 1 t r e a t m e n t,t h e s p o r e g e r m i n a t i o n r a t e o f p a t h o g e n i c f u n g i d e c r e a s e d b y 7 4.4%.T h e a c t i v i t i e s o f p h e n y l a l a n i n e a mm o n i a l y a s e,c h i t i n a s e,p o l y p h e n o l o x i d a s e,p e r o x i d a s e,l i p o x y g e n a s e a n d j a s m o n i c a c i d c o n t e n t o f p l a n t s i n o c u l a t e d w i t h A S 1 i n c r e a s e d b y 1 6.0%,2 1.5%,77西 北 师 范 大 学 学 报(自然科学版)第6 0卷 J o u r n a l o f N o r t h w e s t N o r m a l U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e)V o l.6 0 1 0.6%,1 2.6%,1 4.2%a n d 9 7.3%,r e s p e c t i v e l y.I n a d d i t i o n,a f t e r 1 5 d a y s o f A S 1 t r e a t m e n t,t h e r o o t l e n g t h a n d p l a n t h e i g h t o f a s t r a g a l u s i n c r e a s e d b y 3 7.5 2%a n d 1 2.7 8%,r e s p e c t i v e l y.A c c o r d i n g t o p h y s i o l o g i c a l,b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d 1 6 S r D NA s e q u e n c i n g,t h e s t r a i n w a s f o u n d t o b e l o n g t o B a c i l l u s v e l e z e n s i s.T h e r e f o r e,A S 1 i s a b i o c o n t r o l a n d g r o w t h p r o m o t i n g b a c t e r i u m w i t h g r e a t a p p l i c a t i o n p o t e n t i a l.K e y w o r d s:r o o t r o t;b i o c o n t r o l b a c t e r i a;i n d u c i n g s y s t e m i c r e s i s t a n c e;B a c i l l u s v e l e z e n s i s 黄芪是我国使用非常广泛的传统中药材,为豆科 植 物 蒙 古 黄 芪(A s t r a g a l u s m e m b r a n a c e u s(F i s c h.)B g e.v a r.m o n g h o l i c u s(B g e.)H s i a o)或膜荚黄芪(A s t r a g a l u s m e m b r a n a c e u s(F i s c h.)B g e)的干燥根.黄芪含有黄酮类、皂苷类和多糖类等多种活性成分,具有抗菌、利尿、降压、补气固表等功能1-3.因其极高的应用价值和经济价值而在我国广为栽培4,其中山西、甘肃、内蒙古、陕西、河北等省为主要产区.由于黄芪生长需要质地疏松和渗水较好的土壤,使得黄芪种植区域受到一定限制.因此,黄芪种植过程中连作时间延长,轮作周期变 长,造 成 了 土 壤 中 微 生 物 群 落 组 成 发 生 改变5,细菌总数/真菌总数比例减小,最终使得黄芪在种植过程中土传病害发生率较高.其中根腐病是一种比较常见的病害,严重感染时能造成田间3 0%8 0%的植株染病,极大的降低了黄芪的产量和品质6-7.引起黄芪 根腐病的病 原体主要包 括F u s a r i u m s o l a n i,F u s a r i u m o x y s p o r u m,F u s a r i u m a c u m i n a t u m,F u s a r i u m e q u i s e t i m,A l t e r n a r i a s p.等真菌8-9.这些病原真菌的孢子在土 壤 中 以 休 眠 体 形 式 长 期 存 在,防 控 较 为 困难1 0,所以如何有效的防治根腐病的发生是黄芪种植产业中亟待解决的问题.目前对黄芪根腐病的防治主要通过使用化学杀菌剂和筛选抗性品种.然而筛选抗性品种是一项耗费时间、投资较高的手段,但抗根腐病能力较强的黄芪品系依然缺乏.化学杀菌剂是一种快速有效的黄芪根腐病防治方法,但长期使用化学农药不但造成残留在土壤中农药的积累,引起环境污染,而且农药 也 在 植 物 中 大 量 富 集,使 药 材 品 质 严 重 下降1 1.生物防治方法对环境友好,是预防作物土传病害最有前景的方法之一.目前已经从多种植物组织和根际土壤中分离得到了对病原真菌生长具有抑制作用的微生物.张爱梅等1 2从沙棘根瘤内分离的B a c i l l u s t e q u i l e n s i s对黄芪根腐病有较好的防治效果.高通量测序技术的发展揭示了在干旱、盐碱和病害胁迫下,植物能招募有益的微生物在其根际、叶际和植物组织内定殖,这些富集的微生物能帮助植物抵抗非生物和生物胁迫1 3.所以近些年来学者们开始关注从植物根际和根内分离拮抗菌并用于作物土传病害的生物防治.例如沈艳等1 4从小麦中分 离 的 生 防 菌 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌B 9 6 0 1-Y 2对B o t r y t i s c i n e r e a的生长有明显的抑制作用,在接种该生防菌后对番茄灰霉病的防治效果可达8 8%.闫助冰等1 5发现B a c i l l u s v e l e z e n s i s在P D A平板上 对S c l e r o t i u m r o l f s i i菌 丝 的 生 长 抑 制 率 为8 1.9%.盆栽试验表明该菌对花生白绢病的生防效果高达6 6%1 5.然而,关于黄芪根腐病生物防治方面的研究较为缺乏.为了探究拮抗菌对黄芪根腐病的防控作用,从甘肃省宕昌县采集黄芪和土壤样品,通过稀释涂布法从样品中分离细菌,再采用平板对峙法筛选对黄芪根腐病病原真菌F u s a r i u m o x y s p o r u m生长有拮抗作用的菌株,最后通过温室盆栽实验研究了生防菌株对黄芪根腐病的防治效果和植物诱导性抗性的激活作用,以期为黄芪根腐病的田间防治提供新的途径.1 材料和方法1.1 材料1.1.1 供试植物 试验所用黄芪为蒙古黄芪,种子购买于当地农户.1.1.2 供 试 菌 株 黄 芪 根 腐 病 病 原 真 菌(F u s a r i u m o x y s p o r u m HQ 1 6)分离自患病黄芪根部(植株采自甘肃省宕昌县哈达铺),菌株保存于西北农林科技大学农业与环境微生物重点实验室.1.2 方法1.2.1 采样地点 试验所用黄芪和土样均采自于甘肃 省 宕 昌 县 哈 达 铺 镇(N 3 4 1 6.8 1 9,E 1 0 4 0 9.8 5 5,海拔2 3 7 9 m).2 0 1 9年5月,在黄芪样地中随机采挖具有根腐病症状和健康的黄芪植株各87 2 0 2 4年第2期 许磊磊等:黄芪根腐病拮抗菌的筛选及生防机制 2 0 2 4 N o.2S c r e e n i n g o f a n t a g o n i s t i c b a c t e r i a a n d b i o c o n t r o l m e c h a n i s m o f a s t r a g a l u s r o o t r o t6株,采样深度为4 0 c m.将采集的植物样品连同根部附着的土壤装于自封袋并在袋上标记采样信息后带回实验室备用.1.2.2 根际和根内生细菌分离 用力抖动健康或发病植株根系除去表面松散结合的土壤,用毛刷将根表面1 2 mm厚的根际土刷到无菌离心管中,称取1 g黄芪根际土溶于9 m L无菌水中充分溶解,吸取1 m L土壤悬液1 0倍梯度稀释至1 0-7,备用.然后将上一步去掉根际土的根段用7 5%乙醇消毒2 m i n,3%次氯酸钠消毒1 m i n,再以无菌水冲洗6次.将表面消毒的根在无菌研钵中充分研磨,吸取1 m L匀浆液并进行1 0倍稀释至1 0-7,分别取1 0 0 L上述根际土悬液和根研磨液(1 0-5,1 0-6和1 0-7)以无菌操作法涂布于T S A,L B和R 2 A固体培养基上,于2 8 培养3 5 d.将长出的不同特征菌落在L B培养基上纯化,所得菌株保存于4 冰箱备用.1.2.3 拮 抗 菌 筛 选 用 无 菌 打 孔 器 从 长 有F.o x y s p o r u m的P D A平板取直径5 mm的菌块,将菌块置于新的P D A平板中心,将1 0 L根内生或根际细菌悬液分别接种于距离菌块中心2.5 c m处,以滴加相同体积无菌水作为对照,每个处理含3个重复,所有平板于2 8 培养5 d.观察病原真菌生长情况,计算生长抑制率.菌丝生长抑制率=(对照组真菌菌落半径-处理组真菌菌落半径)/对照组真菌菌落半径 1 0 0%.1.2.4 拮抗菌株的鉴定 用细菌D NA提取试剂盒D P 3 0 2(北京天根生化科技有限公司)提取所分离得到的拮抗菌株基因组D NA,以引物2 7 F/1 4 2 9 R扩增各个菌株的1 6 S r D NA(表1).扩增体系和条件为:模 板D NA 2 L,引 物2 7 F和1 4 2 9 R各1 L,2P C R M i x 2 5 L,d d H2O 2 1 L,9 5 预变性5 m i n;9 5 变性1 m i n,5 6 复性1 m i n,7 2 延伸2 m i n,3 0循环;7 2 延伸6 m i n.P C R产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后剩余扩增液送上海生工测序,在N C B I网站对所得序列进行搜索,将相似度较高的1 6 S r D NA序列下载并输入到ME GA 6.0 6软件中.序列比对完成后选择ME GA软 件 菜 单 中“P h y l o g e n y”-“C o n s t r u c t/T e s t N e i g h b o r-J o i n i n g T r e e”,B o o t s t r a p R e p l i c a t i o n s参数选择1 0 0 0,其余为软件默认构建系统发育树.并参照 伯杰氏细菌学鉴定手册 对菌株A S 1的生理生化特性进行测定.表1 扩增相关基因的引物T a b 1 P r i m e r s f o r a m p l i f y i n g r e l a t e d g e n e s引物名称序列基因编码产物2 7 FAG AG T T T G A T C C T G G C T C1 6 S r D NA1 4 2 9 RC G G C T A C C T T G T TA C G A C T Ti t u A FT G C C AG A C AG TA T GA G G C A Gi t uAI t u r i n Ai t u A RC A T G C C G T A T C C A C T G T GA Cb a m C FGAAG G A C A C G G C A GA GA G Tb a mCB a c i l l o m y c i nb a m C RC G C T G A T GA C T G T T C A T G Cm y c C FAA T C AA T T G G C A C GAA C C T Tm y cCM y c o s u b t i l i nm y c C RA T C G C C C G T T T T G TA C A T T Cf e n A FGA C AG T G C T G C C T G A T G AAAf e nAF e n g y c i nf e n A RG T C G G T G C A T G AAA T G TA C Gs r f AA FT C G G GA C AG G AA GA C A T C A Ts r fAS u r f a c t i ns r f AA RC C A C T C AAA C G G A T AA T C C T G Ab a c A FC AG C T C A T G G G AA T G C T T T Tb a cAB a c i l y s i nb a c A RC T C G G T C C T G AA G G G A C AAG1.2.5 盆栽防效测定 将土壤、蛭石和泥炭按321(V/V)混合均匀后装入蘑菇种植袋,每袋6 0 0 g.将7株拮抗能力较强的菌株分别接种于L B液体培养基中,2 8 振荡培养2 4 h.菌悬液8 0 0 0 rm i n-1离心1 0 m i n,沉淀用无菌水洗涤后再次离心,将细胞重新溶解于无菌水中,调节O D6 0 0为0.8,取1 0 m L上述菌悬液接种到种植袋中.将5棵发芽2 d的黄芪种子播种于种植袋中.5 d后,在种植袋中加入1 0 m L病原菌孢子悬浮液(1 05个m L-1).2 d后再向种植袋中接种1 0 m L菌悬液.97西 北 师 范 大 学 学 报(自然科学版)第6 0卷 J o u r n a l o f N o r t h w e s t N o r m a l U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e)V o l.6 0 以无菌水代替菌悬液作为对照,每个处理做1 0袋重复,所有处理放于玻璃温室培养.期间每隔3 d统计黄芪发病株数和2 0 d的病情指数,同时对植物株高、根长、干重和鲜重等指标进行测定.黄芪根腐病防治效果=(对照病情指数-菌液处理病情指数)/对照病情指数)1 0 0%.1.2.6 菌株A S 1对真菌孢子萌发的抑制 将菌株A S 1在L B培养基中培养至指数生长阶段,调整菌悬液浓度为1 08 C F Um L-1.将等体积的细菌悬液和真菌孢子悬液(1 06孢子m L-1)混合,以不接菌的L B培养基和孢子悬液混合作为对照,每个处理重复3次.孢子在2 5 黑暗环境下萌发1 0 h,显微镜下统计同一个视野中萌发的孢子数量,计算萌发抑制率:孢子萌发抑制率=(对照组萌发孢子数-处 理 组 孢 子 萌 发 数)/对 照 组 萌 发 孢 子 数)1 0 0%.1.2.7 菌株A S 1抗菌物质编 码 基 因 检 测 如1.2.4所述提取菌株D NA,参照Z h u等1 6的方法对菌株可能的抗菌物质编码基因进行扩增(表 1),P C R产物送北京擎科生物技术公司测序,在N C B I以B L A S T n进行比对.1.2.8 植物诱导性系统抗性测定 将6 0 0 g基质(土壤、蛭石和泥炭按321混合)装入蘑菇种植袋并种植催芽的黄芪种子.当黄芪生长1个月后将1 0 m L O D6 0 0为0.8的A S 1菌悬液接种于黄芪根周围,以添加等量无菌水作为对照.分别于接菌后8,2 4,4 8,7 2,1 2 0和1 6 8 h后采集植物,分别取1 g接种A S 1和无菌水的黄芪根(每个处理3个重复),加入2 m L 0.1 m o lL-1P B S缓冲液置于冰上研磨.匀浆液在1 4 0 0 0 rm i n-1条件下离心2 0 m i n,根据试剂盒说明书取上清液对苯丙氨酸解氨酶(P A L)、多酚氧化酶(P P O)、过氧化物酶(P O D)、脂氧合酶(L O X)、几丁质酶(c h i t i n a s e)酶活性和茉莉酸(J A)含量进行测定.1.3 数据分析采用S P S S 2 0.0和E X C E L 2 0 1 3软件对所得数据进行分析和处理.2 结果与讨论2.1 拮抗菌株筛选从黄芪根际和根共分离得到1 9 7株细菌,其中发病根中分离到1 0 4株,健康根中得到4 4株,发病植物根际土8株,健康根根际土4 1株.平板对峙试验结果表明,有2 0株细菌对F.o x y s p o r u m菌丝的生长有明显的抑制作用,占所有分离菌株的1 0.2%.进一步统计发现,从患病植物根和根际中分离得到拮抗菌株9株,从健康植物根和根际分离到拮抗菌株1 1株.此外,2 0株拮抗菌分别属于芽孢杆菌属、不动杆菌属和假单胞菌属等1 3个属,其中芽孢杆菌为优势属(7株).这可能是芽孢杆菌属细菌在不良环境中形成孢子,从而对干燥、辐射和渗透压具有比较强的抵抗能力.例如枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌等都被研制成生防菌剂并用于田间作物防病1 7-1 8.胡党振等1 9发现复合芽孢杆菌灌根处理能 沃柑根褐变减少、黄龙病的发病率降低约5 0%.通过对这2 0株拮抗菌的真菌菌丝抑制率计算发现,编号为A S 1,A S 1 1,A S 5 1,A S 5 6,A S 5,A S 4 2和A S 8 7的7株菌抑菌效率较高,每株菌的平均抑制率均超过3 5%(表2),故后续选择这7株拮抗菌进行下一步试验.表2 抑菌效果较好拮抗菌1 6 S鉴定及抑菌率T a b 2 1 6 S i d e n t i f i c a t i o n a n d p a t h o g e n i c g r o w t h i n h i b i t i o nr a t e o f s o m e a n t a g o n i s t i c b a c t e r i a菌株种属抑菌率/%A S 1 1P a e n i b a c i l l u s s p.4 7.3 70.1 7A S 5 1B a c i l l u s s p.3 8.9 50.8 1A S 5 6F r i g o r i b a c t e r i u m s p.4 3.1 60.1 1A S 5B a c i l l u s s p.4 5.2 60.2 9A S 1B a c i l l u s s p.3 6.8 40.0 4A S 4 2D e l f t i a s p.4 3.1 60.0 6A S 8 7R h i z o b i u m s p.3 6.8 40.1 52.2 拮抗菌对黄芪根腐病发病率的影响 通过盆栽试验评价了上述7株拮抗菌对黄芪根腐病 的 防 治 效 果,结 果 列 于 表3.菌 株A S 1 1,A S 5 6和无菌水处理植物在接种病原真菌孢子第5 d后开始出现发病症状.从接种病原菌第1 0 d开始,所有处理组都有植物出现发病症状,但A S 1和A S 4 2处理组的发病率明显低于其他组.随着培养时间的延长,A S 1处理组植物的发病率基本无太大变化并且发病率保持在较低水平,A S 4 2处理组植物的发病率开始逐渐增加,但低于除A S 1之外的其他处理组.本研究中,虽然菌株A S 1对病原真菌菌丝生长的抑制效率低于A S 5 6和A S 1 1,但盆栽试验条件下,A S 1处理黄芪在生长2 0 d后08 2 0 2 4年第2期 许磊磊等:黄芪根腐病拮抗菌的筛选及生防机制 2 0 2 4 N o.2S c r e e n i n g o f a n t a g o n i s t i c b a c t e r i a a n d b i o c o n t r o l m e c h a n i s m o f a s t r a g a l u s r o o t r o t的发病率和死亡率分别比对照降低了3 4.4%和5 9.0 6%,其防病效果明显高于A S 1 1和A S 5 6.这可能是由于A S 1属于贝莱斯芽孢杆菌,其在土壤中的生存能力要优于其他属的菌株,所以A S 1能更好的在黄芪根际或根内定殖,进而发挥防病功能.表3 拮抗菌对黄芪根腐病发病率的影响T a b 3 T h e e f f e c t o f a n t a g o n i s t i c b a c t e r i a o n r o o t r o t d i s e a s e i n c i d e n c e o f p l a n t生长时间/d接种菌株A S 5 6A S 1A S 1 1A S 4 2A S 5A S 8 7A S 5 1C o n t r o l55.8 90.4 405.5 70.4 200004.7 60.5 41 05 2.7 10.6 3 4 5.4 30.2 8 8 3.5 71.6 6 5 2.3 80.5 0 4 9.9 61.9 4 6 2.2 71.1 7 7 1.3 50.6 9 7 6.3 02.1 51 57 0.9 31.7 1 5 0.2 21.9 5 8 3.5 71.6 6 5 7.3 71.5 2 6 4.3 21.4 4 6 8.3 81.4 0 8 5.7 52.2 6 7 6.3 02.1 52 07 0.9 31.7 1 5 0.2 21.9 5 8 3.5 71.6 6 6 1.7 81.5 2 7 1.4 81.3 8 8 1.3 81.4 0 8 5.7 52.2 6 7 6.3 02.1 5 同时,从试验结果发现A S 1处理后大部分植物根部颜色呈白色,没有发现病斑,地上部分直立.空白对照组的大部分植物根部出现褐色病斑,根茎结合出长出大量白色菌丝,植物叶片枯萎,茎开始倒伏(图1).近年来,由一些病原真菌引起的作物土传病害在世界范围内造成了重大的经济损失2 0.而黄芪是我国一种重要的传统中草药,在长期的栽培过程中根腐病发病率较高.从植物根际分离有益微生物,用这些微生物制剂替代化学杀菌剂防治植物病害是作物病害防治的热点2 1.张妞等2 2从3 4株细菌中筛选出9株枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌,对马铃薯腐烂茎线虫病有较好的生防效果.许乐等2 3发现丹参内生细菌D S-R 5的发酵提取物对腐皮镰刀菌孢子萌发和菌丝生长有明显抑制作用.然而,要想在田间取得理想的防治效果,需要拮抗菌能够在植物根际或植物组织内定殖.所以研究者大都倾向于从根、茎、叶和种子中分离拮抗菌2 4-2 5.也有学者分离了针对黄芪根腐病的拮抗细菌和放线菌2 6-2 7,但在这些研究中只测定了菌株或发酵液对病原真菌菌丝生长的抑制作用,没有开展盆栽试验,所以这些拮抗菌株在实际中的效果并不清楚.本研究从黄芪根际和根内筛选的拮抗菌能更好的在根际繁殖并起到较好的生防效果.a 接种拮抗菌A S 1和病原真菌的黄芪地上部分表型,b 接种病原真菌的黄芪地上部分表型,c A S 1处理组黄芪根部表型,d 对照组黄芪根部表型.图1 菌株A S 1对植物根腐病的缓解F i g 1 E f f e c t s o f s t r a i n A S 1 o n t h e f u n g a l p a t h o g e n i n f e c t e d a s t r a g a l u s2.3 拮抗菌对黄芪根腐病发病的盆栽防治效果由于只有A S 1能显著降低植物的发病率,因此文中计算了温室盆栽条件下该株菌对黄芪根腐病的防治效果.由表4可以看出,植物接种病原真菌孢子2 0 d后,A S 1能很好的保护植物,其盆栽防效可达4 6.8 6%表4 菌株A S 1和A S 4 2对黄芪根腐病的防治效果T a b 4 C o n t r o l e f f e c t o f A S 1 a n d A S 4 2o n p l a n t r o o t r o t处理发病率/%病情指数防效/%无菌水7 6.2 61.7 0 6 8.3 00.9 8接种A S 1 4 5.4 30.2 8 3 6.2 90.7 4 4 6.8 61.0 218西 北 师 范 大 学 学 报(自然科学版)第6 0卷 J o u r n a l o f N o r t h w e s t N o r m a l U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e)V o l.6 0 2.4 菌株A S 1对植物的促生作用 既然拮抗菌A S 1能有效防治黄芪根腐病,本文研究也检测了这株菌是否具有植物促生能力.图2 菌株A S 1对植物生长的影响(*P0.0 5 T-t e s t)F i g 2 E f f e c t s o f s t r a i n A S 1 o n t h e g r o w t h o f a s t r a g a l u s如图2所示,接种A S 1能显著增加植株的根长和根高,与未接菌的对照相比,A S 1处理植株根长和根高分别增加了3 7.5 2%和1 2.7 8%.虽然接种A S 1植株的鲜重和干重与对照无显著差异,但接菌处理依然高于对照.2.5 菌株A S 1的鉴定菌株A S 1在T S A培养基的上单菌落呈现乳白色,表面粗糙,不透明,边缘不规则,以膜状附着在培养基表面.在光学显微镜下观察发现该菌体形态呈杆状,革兰氏染色呈阳性(图3 a,b).能以淀粉、柠檬酸为碳源生长,甲基红试验和接触酶试验呈阳性(表5).对菌株的1 6 S r D NA序列进行比对并构建 系 统 发 育 树,发 现 菌 株A S 1与B a c i l l u s v e l e z e n s i s C R 5 0 2更接近,其相似性为9 9.7 1%(图3 c).因 此,文 中 将 菌 株A S 1命 名 为B a c i l l u s v e l e z e n s s i A S 1.图3 菌株A S 1革兰氏染色(a)、菌落形态(b)和1 6 S系统发育树(c)F i g 3 G r a m s t a i n i n g(a),c o l o n y m o r p h o l o g y(b)a n d p h y l o g e n e t i c t r e e o f s t r a i n A S 1(c)表5 菌株A S 1的生理生化特征T a b 5 P h y s i o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c so f s t r a i n A S 1鉴定指标结果鉴定指标结果糖醇发酵试验+V-P反应+淀粉水解试验+H2S试验-硝酸盐还原反应+明胶液化试验-接触酶反应+氧化酶反应+甲基红试验-柠檬酸盐利用试验+2.6 菌株A S 1的防病机制2.6.1 菌株A S 1对病原真菌孢子萌发的抑制 如图4所示,将拮抗菌A S 1与病原真菌孢子在2 5 的黑暗条件下共培养1 0 h,不加拮抗菌对照组的大部分孢子开始萌发,然而A S 1处理组种只有少量真菌孢子有萌发.和对照相比,A S 1处理后的真菌孢子萌发率下降了7 4.4%,并且拮抗菌处理组的真菌菌丝明显要短于对照组.2.6.2 菌株A S 1抗菌物质编码基因 由于芽孢杆菌属 中 的 许 多 菌 株 都 能