复方精油吸嗅对睡眠剥夺小鼠的清醒维持作用及机制.pdf

香料香精化妆品FLAVOUR FRAGRANCE COSMETICS2024年4月第2期Apr.2024,No.2专 题15www.ffc-www.ffc-作 者江西中医药大学 现代中药制剂教育部重点实验室，江西南昌 330004 刘日群 刘小金 李字棋 郑 琴 徐焕华 肖淑华 胡鹏翼#复方精油吸嗅对睡眠剥夺小鼠的清醒维持作用及机制*摘 要探讨复方精油经鼻吸入对睡眠剥夺小鼠的清醒维持作用及机制。动物试验结果表明，复方精油不仅能显著提高睡眠剥夺小鼠自主活动（P0.01），显著缩短睡眠时间（P0.01），具有维持清醒的作用，还能使超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性及脑内多巴胺（DA）和谷氨酸（Glu）水平显著升高（P0.05，P0.01），且显著降低 5-羟色胺（5-HT）水平（P0.01）；细胞结果表明，复方精油组多巴胺转运蛋白（DAT）、五羟色胺 1A（5-HT1A）蛋白表达极显著降低（P0.01），5-羟色胺转运蛋白（SERT）、囊泡谷氨酸转运蛋白 1（VGLUT1）蛋白表达显著提高（P0.05，P0.01）。关键词复方精油 睡眠剥夺 提神醒脑 神经递质 传导 受体Effects and Mechanisms of Compound Essential Oil Sniffing on Wakefulness Maintenance in Sleep Deprived Mice*LIU Riqun LIU Xiaojin LI Ziqi ZHENG Qin XU Huanhua XIAO Shuhua HU Pengyi#(Key Laboratory of Modern Traditional Chinese Medicine Preparation of Ministry of Education,Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330004,Jiangxi,China)Abstract:To investigate the effect and mechanism of nasal inhalation of compound essential oil on awake maintenance in sleep-deprived mice.The results of animal experiments showed that the compound essential oil could not only significantly improve the spontaneous activity of sleep deprivation mice(P0.01),significantly shorten the sleep time(P0.01),and maintain awake,but also significantly increase the activities of superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase(GSH-Px)and the levels of dopamine(DA)and glutamic acid(Glu)in the brain(P0.05,P0.01),and significantly reduce the level of 5-hydroxytryptamine(5-HT)(P0.01).The cell results showed that the expression of dopamine transporter(DAT)and serotonin 1A(5-HT1A)protein in the compound essential oil group decreased significantly(P0.01),and the expression of serotonin transporter(SERT)and vesicular glutamate transporter 1(VGLUT1)protein increased significantly(P0.05,P0.01).作 者 简 介刘日群（1996），女，硕士研究生，主要从事中药新剂型与新技术的研究。#通信作者：胡鹏翼（1982），女，博士，副教授，主要从事中药新剂型的研究。联系电话：[phone]E-mail:专题“芳香类植物中药及单体治疗疾病进展”客座主编：董昌盛、韩睿钦、张弘一DOI:10.20099/j.issn.1000-4475.2023.0266*基金项目：国家中医药多学科交叉创新团队项目（编号ZYYCXTD-D-202207）；江西中医药大学重点领域科技创新团队（编号CXTD22006）；江西中医药大学校级研究生创新专项资金项目（编号JXYC22S71）收稿日期：2023-10-10；修回日期：2023-12-04专 题2024 年 4 月香料香精化妆品16www.ffc-www.ffc-睡眠剥夺（sleep deprivation，SD）是由多种原因所致睡眠缺失或睡眠时间严重不足，一般指在 24 h 内的睡眠小于 4 h。由于电子产品的普及，工作、生活、学习的压力使得许多人长期处于 SD状态，进而导致白天注意力涣散、工作效率低，影响正常的工作、生活1。另外，医护人员、飞行员等特殊人群时常处于 SD 状态，特殊的工作性质使得他们必须保持良好的警觉性、记忆力、反应能力。短期服用兴奋剂类药物如咖啡因、莫达非尼等可缓解疲劳困倦2，提高警觉性，但也会引起一系列的不良反应3。因此研究开发效果好、不良反应少的维持 SD 状态下清醒的产品显得尤为迫切。精油（essential oils，EOs）是一类具有芳香气味的物质，是植物次生代谢产物4。EOs 因其独特的芳香气味及多种生物活性，广泛应用于香疗、肤用化妆品、毛发用化妆品5-7等领域。研究发现，香附挥发油、柠檬精油、苏合香精油、薄荷精油等在动物试验中均能有效缓解躯体疲劳，提高自主活动能力，显著缩短大/小鼠戊巴比妥纳诱导的睡眠时间，表现出中枢兴奋和睡眠促醒的作用8-11，但其研究仅停留在药效上，作用机制并未明确。我们以芳香疗法理论为指导，选择具有芳香开窍作用的薄荷醇、丁香精油、青柠檬精油等调配而成的复方精油为研究对象，在该复方精油对正常小鼠有提神醒脑的作用基础上12，继续研究其对SD 小鼠的清醒维持作用及相关机制，为缓解精神疲劳产品的研究与开发提供数据支撑。1 材料1.1 动物雄性 KM 小鼠（SPF）体重为(202)g，购自江西中医药大学动物科学技术中心（许可证号：SCXK 江西 20220002），SPF 环境为相对湿度40%70%、恒温(222)，昼夜交替（12 h:12 h），饲养 1 周，正常饮水饮食。本试验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准文号：JZLLSC20210043）。1.2 药品及试剂澳洲尤加利、柠檬、椒样薄荷、粉葡萄柚、樟脑迷迭香、多香果、丁香、桉油醇迷迭香、肉桂叶、苏合香、乳香等精油，均由江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室提供；咖啡因（批号 PS11544），北京谱析科技有限公司；PBS 缓冲液，Solarbio 公司；多巴胺酶联免疫吸附测定试剂盒（批号 H170-1-2）、谷氨酸酶联免疫吸附测定试剂盒（批号 H168-1-2）、5-羟色胺试剂盒（批号H104-1-2)，Andygene 公 司；D1R 一 抗（多 巴 胺D1 受体，批号 ab279713）、5-HT1A 一抗（五羟色胺 1A，批号 ab85615）、DAT 一抗（多巴胺转运蛋白，批号 HA500007）、EAAT1 一抗（胶质细胞谷氨酸运载蛋白 1 抗体，批号 ET1704-54）、VGLUT1 一抗（囊泡谷氨酸转运蛋白 1，批号 HA601014）、SERT 一抗（5-羟色胺转运蛋白，批号 ER1916），Abcam 公司；戊巴比妥钠，Sigma-aldrich 公司；超氧化物歧化酶生化试剂盒（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶生化试剂（GSH-Px），南京建成生物工程研究所。1.3 仪器超声波雾化香薰机，深圳市康美泰实业有限公司；MS105Du 型十万分之一电子天平，梅特勒-托利多科技有限公司；纯水仪，美国 Millipore 公司；SMART3.0 小动物行为学记录分析系统，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；5250040 型酶标仪，Thermo Scientific Varioskan Flash 公 司；2K15C 型低温高速离心机，德国 Sigma 公司；A21K-R 型台式高速大容量冷冻离心机，上海碧云天生物技术有限公司。2 方法2.1 复方精油对睡眠剥夺小鼠的清醒维持作用2.1.1 复方精油配制分别精密称量冰片和薄荷醇，利用冰片和薄荷醇二者低共熔解特性，将薄荷醇和冰片按质量比 3:1 进行混合研磨成溶液。各物质的质量比为薄荷醇冰片共熔物:澳洲尤加利精油:柠檬精油:椒样薄荷精油:粉葡萄柚精油:樟脑迷迭香精油:多香果精油:丁香精油:桉油醇迷迭香精油:肉桂叶精油:苏合香精油:乳香精油=18:2:2:46:2:5:5:10:5:5:8:2。2.1.2 动物分组与给药参照中枢疲劳建模方法13，自制水上站立剥夺睡眠水箱（250 mm150 mm150 mm）。剥夺强度为 19 h/d，重复 2 次，睡眠剥夺 19 h 后，将Keywords:compound essential oil sleep deprivation refresh the mind neurotransmitter transporter acceptor第 2 期专 题刘日群，等：复方精油吸嗅对睡眠剥夺小鼠的清醒维持作用及机制17www.ffc-小鼠取出，风干毛发，放入有干燥垫料的笼中，给予小鼠足够的食物和水，休息 5 h 后继续睡眠剥夺。水箱置于平面上，向水箱中注入温水(253)，深度为 1.0 cm，并在水箱中放置支架。老鼠在水箱中自由摄食和饮水，清醒状态下，小鼠可以站立，当身体肌肉张力降低，肌肉放松时，小鼠落水，迫使小鼠保持清醒，如此反复，导致睡眠不足，形成中枢疲劳。将 32 只昆明雄性小鼠随机分为对照组、模型组、阳性药组（咖啡因）和复方精油组（5 10-7 mL/cm3）。对照组小鼠正常饲养不受任何干预，其他组连续给药 5 天，第 5 天给药结束后立即进行睡眠剥夺，睡眠剥夺期间继续给药。对照组每天雾化吸入等量蒸馏水，阳性药组灌胃咖啡因 57 mg/kg，复方精油用适量蒸馏水稀释后雾化吸入，吸入时间均为 15 min。其中，精油给药剂量=雾化器复方精油加入体积（mL）/动物香薰室空间体积（cm3）。2.1.3 复方精油对睡眠剥夺小鼠自主活动的影响睡眠剥夺 48 h 结束后，对照组和模型组小鼠继续雾化吸入蒸馏水，复方精油组小鼠吸入复方精油 15 min，休息 15 min 后进行旷场试验；咖啡因组灌胃 30 min 后进行旷场试验。小鼠适应环境 3 min，检测 5 min 内行为学参数包括运动距离（cm）、平均速度（cm/s）、休息时间占比（%）。2.1.4 复方精油对睡眠剥夺小鼠阈上睡眠诱导的影响旷场试验结束后，给药组小鼠按“2.1.1”继续睡眠剥夺 24 h，第 2 天给药结束后，均进行腹腔注射戊巴比妥钠，阈上值 55 mg/kg14，注射完药后及时记录各组小鼠的睡眠潜伏期（从腹腔注射完到翻正反射消失时间）及持续时间（翻正消失到恢复的时间）。2.1.5 复方精油对睡眠剥夺小鼠神经递质、SOD和 GSH-Px 的影响将 32 只昆明雄性小鼠按“2.1.2”分组及给药，连续给药 7 天，第 5 天给药后立即进行睡眠剥夺48 h，最后一天给药后，将各组小鼠进行摘眼球取血，然后颈椎脱位处死，取出完整脑组织，PBS缓冲液清洗，滤纸吸干。于室温静置 1 h 后，低温，离心，取上清液血清、脑组织于-80 冻存。用 Elisa 试剂盒检测小鼠脑组织中谷氨酸（glutamic acid，GLU）、多巴胺（dopamine，DA）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）含量，生化试剂盒检测小鼠血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平。2.1.6 复方精油对小鼠脑内神经递质转运及受体蛋白水平的影响另取一批昆明小鼠 32 只按“2.1.2”方法重复试验，于最后一天给完药后，后颈椎脱位处死，小鼠取全脑，PBS 溶液清洗后，在冰面上分别剥离海马、下丘脑、前额皮层和其他脑组织，锡箔纸包裹，暂存于-80。将冷冻组织（20 mg）在20 mmol Tris-HCl 缓冲液中匀浆，冰上孵育 15min，低温，高速离心，取上清液 BCA 试剂盒检测其蛋白质含量。通过体积分数 10%SDS-PAGE 凝胶电泳分离上清液，然后转移到 PVDF 膜上，加入一抗多巴胺 D1 受体（稀释体积比为 1:1 000）、抗5-HT1A（稀释体积比为 1:1 000）、抗 NMDAR1（稀释体积比为 1:1 000）、抗 DAT（稀释体积比为 1:1 000）、抗 EAATs（稀释体积比为 1:1 000）、抗 VGLUTs（稀释体积比为 1:1 000）、抗 SERTs（稀释体积比为 1:500），然后将膜与辣根过氧化物酶缀合的次级抗体（稀释体积比为 1:2 000）孵育。转移的蛋白质用增强化学发光（ECL）底物溶液孵育，并用图像 J 程序（Bio-Rad，Richmond，CA，USA）可视化。通过使用 Quantity One 软件（BioRad Laboratories）对相对水平进行密度量化，并根据GAPDH 的条参考带进行计算。2.2 统计学分析方法采用 SPSS Statistics 25.0 软件，对试验结果进行正态性检验、方差齐性分析，统计学显著性分析，检验结果以（均值 方差）（xs）表示，若数据结果服从正态性及方差齐性，则采用单因素方差分析分析，否则采用采用非参数检验（Kraskal walls test）及韦尔奇方差分析，P0.05 具有统计学意义。3 结果与讨论3.1 结果3.1.1 复方精油吸嗅对睡眠剥夺小鼠自主活动能力的影响图 1 显示，与对照组比较，模型组运动距离显著下降（P0.01），休息时间显著延长（P0.01），平均速度显著降低（P0.01），表明睡眠剥夺致小鼠自主活动能力下降，呈现中枢疲劳状态15。与模型组比较，复方精油组、阳性药组运动距离显专 题2024 年 4 月香料香精化妆品18www.ffc-www.ffc-著提高（P0.01），平均速度显著提高（P0.01），休息时间显著缩短（P0.01）。结果表明，复方精油吸嗅可促进睡眠剥夺小鼠的自主活动。3.1.2 复方精油吸嗅对睡眠剥夺小鼠的促醒作用图 2 显示，与对照组比较，模型组小鼠的睡眠时间显著延长（P0.01），睡眠潜伏期显著缩短（P0.01）。与模型组比较，阳性药组（咖啡因）和复方精油组睡眠潜伏期显著延长（P0.01），睡眠时间显著缩短（P0.01），表明复方精油吸嗅对中枢疲劳小鼠具有良好促醒作用。图 1 复方精油对睡眠剥夺小鼠自主活动能力的影响（xs，n=8）注：复方精油组的体积浓度为 510-7 mL/cm3；与对照组比较，*P0.05，*P0.01；与模型组比较，#P0.05，#P0.01，下同。图 2 复方精油对睡眠剥夺小鼠的促醒作用（xs，n=8）图 3 复方精油对小鼠血清中 SOD（a）和 GSH-Px（b）活性的影响（xs，n=8）3.1.3 复方精油吸嗅对睡眠剥夺小鼠 SOD 和GSH-Px 活性的影响图 3 显示，与模型组比较，复方精油组超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性均显著升高（P0.05，P0.01）。SOD 和 GSH-Px 是机体清除氧自由基的重要抗氧化酶，复方精油吸嗅可能使机体中 SOD 和 GSH-Px 酶活性水平提高，从而增强抗氧化能力，清除代谢产物，保护脑组织，对中枢疲劳小鼠发挥提神醒脑的作用。3.1.4 复方精油吸嗅对睡眠剥夺小鼠脑内神经递质的影响图 4 显示，与模型组比较，复方精油组显著提高睡眠剥夺小鼠脑神经递质多巴胺（DA）和谷氨酸（Glu）水平（P0.05、P0.01），显著降低 5-HT水平（P0.01），表明复方精油吸嗅对中枢疲劳的维持清醒作用可能是通过上调神经递质 DA 和 Glu水平，下调 5-HT 实现。3.1.5 复方精油吸嗅对睡眠剥夺小鼠脑内神经递质转运体、受体蛋白水平的影响图 5 显示，与模型组比较，复方精油组 DAT、5-HT1A 蛋白表达极显著降低（P0.01，P0.01），SERT、VGLUT1 蛋 白 表 达 显 著 提 高（P0.05，P0.01），复方精油组 EAAT1 蛋白表达存在下降趋势，但无统计学意义（P0.05）。复方精油吸嗅发挥提神醒脑的作用可能与上调 SERT、VGLUT1 蛋白表达，下调 DAT、5-HT1A 有关。（a）（b）1 00080060040020006420150100500403020100300200100043210100806040200运动距离/cm睡眠潜伏期/min睡眠时间/minSOD/（U mL-1）GSHS-PX（mol L-1）平均速度/（cm s-1）休息时间/%对照组对照组对照组对照组对照组对照组对照组模型组模型组模型组模型组模型组模型组模型组阳性药组阳性药组阳性药组阳性药组阳性药组阳性药组阳性药组复方精油组复方精油组复方精油组复方精油组复方精油组复方精油组复方精油组*#第 2 期专 题刘日群，等：复方精油吸嗅对睡眠剥夺小鼠的清醒维持作用及机制19www.ffc-图 4 复方精油对睡眠剥夺小鼠脑神经递质的影响（xs，n=8）3.2 讨论芳香疗法是以芳香精油为媒介的自然疗法，具有安全、经济、易操作等特点，广泛应用于生理、心理及精神健康各个方面。本文研制的复方精油通过吸嗅能显著提高 SD 小鼠的自主活动能力，显著缩短 SD 小鼠戊巴比妥钠睡眠诱导的睡眠时长，可有效维持SD小鼠清醒状态，缓解疲劳。大脑5-HT含量的增加会引起疲劳，从而对觉醒、嗜睡和情（a）对5-HT的影响（b）对DA的影响（c）对Glu的影响504030201002015105010864205-HT/(pg mL-1)Glu/(pg mL-1)DA/(pg mL-1)对照组对照组对照组模型组模型组模型组阳性药组阳性药组阳性药组复方精油组对照组DA1R5-HT1ADATEAAT1VGLUT1SERTGAPDHK1K2K3M1M2M3Y1Y2Y3Z1Z2Z3模型组阳性药组复方精油组复方精油组复方精油组#*图 5 复方精油对脑组织中 D1R（b）、5-HT1A（c）、DAT（d）、EAAT1（e）、VGLUT1（f）和 SERT（g）蛋白表达水平的影响（xs，n=3）（a）D1R、5-HT1A、DAT、EAAT1、VGLUT1和SERT蛋白表达（b）（e）（c）（f）（d）（g）32106420864200.100.080.060.040.020432100.050.040.020D1R 相对表达（D1R/PDH）EAAT1 相对表达（EAAT1/PDH）5-HT1 相对表达（D1R/PDH）VGLUT1 相对表达（VGLUT1/PDH）DAT 相对表达（D1R/PDH）SERT 相对表达（SERT/PDH）对照组对照组对照组对照组对照组对照组模型组模型组模型组模型组模型组模型组阳性药组阳性药组阳性药组阳性药组阳性药组阳性药组复方精油组复方精油组复方精油组复方精油组复方精油组复方精油组*#www.ffc-专 题2024 年 4 月香料香精化妆品20www.ffc-绪产生负面影响16。复方精油可能通过上调 DA、Glu 水平，下调 5-HT 水平缓解中枢疲劳，发挥提神醒脑作用。此外，复方精油吸嗅能显著提高中枢疲劳小鼠体内抗氧化酶 SOD、GSH-Px 活性，表明复方精油可能通过增强机体抗氧化能力，加强对自由基或其他代谢产物清除能力，从而缓解中枢疲劳。本文采用的为短期急性睡眠剥夺，由于睡眠剥夺时间较短，应激反应可能引起模型组小鼠D1R 蛋白水平提高，因模型组小鼠 D1R 受体已被激活，复方精油组与模型组对比，对 D1R 受体蛋白水平无显著性影响。有研究表明17-18，睡眠剥夺 24、48、72 h 后能使大鼠海马和纹状体区域5-HT1A mRAN 水平显著提高，因此模型组小鼠脑内 5-HT1A 蛋白水平显著提高，复方精油通过下调模型组小鼠 5-HT1A 蛋白水平，引起机体兴奋性，减少睡眠时间，发挥提神醒脑抗疲劳的作用。睡眠剥夺上调小鼠脑内 DAT，使得脑内 DA 水平降低，而复方精油可通过下调 DTA 蛋白水平，提高 DA 含量，促进睡眠剥夺小鼠的兴奋性。失眠通常会引起脑内 5-HT 水平的下降，镇静安神药可通过提高海马 5-HT 的含量，进而上调 5-HT 受体蛋白水平发挥抗失眠作用，因此复方精油通过上调 SERT 蛋白表达，促进睡眠剥夺小鼠 5-HT 转运体再摄取 5-HT 的功能，降低 5-HT 水平，从而抑制 5-HT1A 受体水平，发挥提神醒脑抗疲劳的作用。复方精油虽可下调 EAAT1 水平，但是与模型组对比也无显著性，表明 EAAT1 可能对短期睡眠剥夺引起的 Glu 水平变化的清除作用不变，因 EAAT2参与清除 90%的 Glu，故复方精油可能通过调控EAAT2 蛋白水平改变 Glu 清除率，发挥提神醒脑抗疲劳的作用。因睡眠剥夺应激刺激使得模型组VGLUT1 低表达，使胞质的 Glu 转入囊泡减少，进而会减少突触囊泡内 Glu 的胞吐释放，因此模型组 Glu 水平降低；复方精油能上调 VGLUT1 蛋白，使得突触前囊泡中Glu的摄取率及其释放增加，进而可能会增加胞外 Glu 的含量，发挥提神醒脑抗疲劳的作用。4 结论综上所述，复方精油对 SD 小鼠维持清醒的作用可能与下调 DTA 和 5-HT1A 蛋白水平，上调SERT 及 VGLUT1 蛋白水平，从而调控脑内神经递质 DA、5-HT 和 Glu 水平有关。开发的复方精油在一定程度能缓解精神疲脑，且为天然植物提取物，具有芳香性、性能平稳等优势，还为改善精神疲劳产品的研发提供理论基础。参考文献1 马文静,冯蓓蕾,延梦圆.睡眠剥夺与认知障碍研究进展 J.中国神经免疫学和神经病学杂志,2020,27(5):403-406.2 刘珺,杨晓明,邓略,等.莫达非尼在对抗飞行员睡眠剥夺和提高认知能力方面的应用 J.空军医学杂志,2021,37(1):75-79.3 刘萍,卢光照,鲁莹,等.莫达非尼的临床应用、作用机制和不良反应的研究进展 J.中南药学,2020,18(11):1869-1874.4 张勇,龚盛昭,徐梦漪.化妆品中精油及其载运系统应用研究进展 J.香料香精化妆品,2021(5):103-109.5 ABURJAI T,NATSHEH F M.Plants used in cosmetics J.Phytotherapy Research,2003,17(9):987-1000.6 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