piR-823在宫颈鳞癌中的表达及对侵袭、转移的影响_仇姝.pdf

pi823 在宫颈鳞癌中的表达及对侵袭、转移的影响1225000扬州市妇幼保健院病理科2225000扬州大学医学院病理教研室3通讯作者，E-mail:chwang yzueducn225000江苏扬州扬州大学附属医院扬州市妇幼保健院妇产科仇姝，陆红梅1，王成海2，3【摘要】目的探讨宫颈鳞状细胞癌(CSCC)中 PIWI 相互作用 NA(pi)-823 的表达、与临床病理特征的关系及对侵袭、转移的影响。方法收集 2019 年 1 月至 2021 年 12 月 95 例 CSCC 手术切除标本及配对癌旁组织。采用 piNA 表达谱芯片技术获取 5 例 CSCC 中差异表达的 piNA 表达谱。在宫颈癌细胞株 C33A 和 HeLa 中分别转染 pi-823-mimic 质粒(pi-823 过表达组)、阴性对照质粒(对照组)、si-pi-823 质粒(pi-823 干扰组)和 si-对照组质粒(si-对照组)。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPC)检测 pi-823 表达水平，Transwell 小室实验检测 piNA-823 对 CSCC 细胞侵袭的影响。生物信息学预测pi-823 下游靶基因，采用 qPC 和 Western blotting 检测 pi-823 表达水平对靶基因 mNA 和蛋白表达的影响。裸鼠肺转移成瘤实验观察 pi-823 对 CSCC 细胞肺转移的影响。结果CSCC 的 piNA 表达谱中符合条件且表达上调的 piNA 共有 5 个，在 95 例 CSCC 组织中 pi-823 和 pi-37390 表达上调得到了验证，选择上调倍数更高的 pi-823 作为研究对象。pi-823 表达与 CSCC 病理分级和淋巴结转移有关(P0.05)，而与年龄、HPV 感染、肿瘤大小和 TNM 分期无关(P0.05)。Transwell 小室实验显示，过表达 pi-823 能促进 CSCC 细胞的侵袭，而干扰 piNA-823 表达能抑制 CSCC 细胞的侵袭(P0.05)。qPC 和Western blotting 检测显示，过表达 pi-823 抑制了其下游靶基因磷酸甘油酸脱氢酶(PHGDH)的 mNA 和蛋白表达，而干扰pi-823 表达则提高了 PHGDH 的 mNA 和蛋白表达(P0.05)。裸鼠肺转移成瘤实验表明，干扰 pi-823 表达后肺转移瘤数目明显减少(P0.05)。结论在 CSCC 组织中 pi-823 表达水平上调。pi-823 可能通过抑制 PHGDH 的 mNA 和蛋白表达，从而促进了 CSCC 细胞的侵袭和转移。【关键词】宫颈鳞状细胞癌;PIWI 相互作用 NA-823;迁移;转移;磷酸甘油酸脱氢酶中图分类号:737.33文献标识码:A文章编号:10090460(2023)03020007The expression of pi823 in cervical squamous cell carcinoma and its impact on invasion and metastasisQIU Shu，LU Hongmei，WANG Chenghai Department of Obstetrics and Gynecology，Yangzhou Maternity andChild Health Hospital，Affliated Hospital of Yangzhou University，Yangzhou 225000，ChinaCorresponding author:WANG Chenghai，E-mail:chwang yzueducn【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of PIWI interacting NA(pi)-823 in cervical squamous cell carcinoma(CSCC)，its relationship with clinicopathological features and its influence on invasion and metastasis MethodsFrom January 2019to December 2021，95 cases of CSCC tissues and matched adjacent tissues were collected The piNA expression profile differentiallyexpressed in 5 CSCC tissues was obtained using piNA expression profile microarray technology The pi-823-mimic plasmid(pi-823overexpression group)，negative control plasmid(control group)，si-pi-823 plasmid(pi-823 interference group)and si-controlgroup plasmid(si-control group)were transfected into cervical cancer cell lines C33A and HeLa，respectively The expression level ofpi-823 was detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(qPC)，and the effect of piNA-823 on theinvasion of CSCC cells was detected by Transwell chamber assay Bioinformatics predicted the downstream target gene of piNA-823，and qPC and Western blotting were used to detect the effect of pi-823 on target gene mNA and protein The effect of pi-823 onlung metastasis of CSCC cells was observed in nude mice esultsThere were 5 qualified and up-regulated piNAs in the expressionprofile of CSCC piNA The up-regulation of pi-823 and pi-37390 in 95 CSCC tissues was verified The higher up-regulation of pi-823 was selected as the research object The expression of pi-823 was correlated with pathological grade of CSCC and lymph nodemetastasis(P0.05)，but not with age，HPV infection，tumor size and TNM stage(P0.05)Transwell chamber assay showed that002临床肿瘤学杂志 2023 年 3 月第 28 卷第 3 期Chinese Clinical Oncology，Mar 2023，Vol28，No3the overexpression of pi-823 could promote the invasion of CSCC cells，while interference with pi-823 expression could inhibit theinvasion of CSCC cells(P0.05)qPC and Western blotting showed that the overexpression of pi-823 inhibited the mNA andprotein expression of its downstream target gene phosphoglycerate dehydrogenase(PHGDH)，while interference with the expression ofpi-823 increased the mNA and protein expression of PHGDH(P0.05)The experiment of tumorigenesis in nude mice showed thatthe number of lung metastases decreased significantly after interfering with the expression of pi-823(P0.05)ConclusionTheexpression of pi-823 is up-regulated in CSCC pi-823 may promote the invasion and metastasis of CSCC cells by inhibiting themNA and protein expression of PHGDH【Key Words】Cervical squamous cell carcinoma;PIWI interacting NA-823;Migration;Metastasis;Phosphoglyceratedehydrogenase宫颈癌位居女性恶性肿瘤发病率的第二位，根据世界卫生组织(WHO)的数据，每年新增病例 53万，约 25 万女性死于宫颈癌，其中发展中国家占全球的 80%1。宫颈癌最常见的病理类型为鳞状细胞癌(CSCC)。与其他癌症一样，宫颈癌不良预后与转移、耐药和复发有关，也是宫颈癌患者死亡的主要原因2-3。PIWI 相互作用 NA(piNA)是一类小的非编码蛋白 NA。目前研究表明，piNA 参与了人类肿瘤的发生、发展4-5，但 piNA 在 CSCC 中的作用仍然知之甚少。在本研究中，为探讨 piNA 在 CSCC中的作用，我们采用 piNA 表达谱芯片技术在 5 例CSCC 及配对 5 例癌旁组织中进行 piNA 表达谱的差异性分析，其中 piNA-823 呈高表达水平，并且在95 对 CSCC 组织中得到了验证。为此本研究将在CSCC 中进一步探讨 piNA-823 表达的临床病理意义及其对 CSCC 细胞侵袭和转移的影响。1资料与方法1.1一般资料95 例 CSCC 及配对的癌旁宫颈组织来源于 2019 年 1 月至 2021 年 12 月扬州大学附属医院妇产科手术切除标本，均经病理确诊。年龄3572 岁，中位年龄 55 岁。所有患者手术前均未接受抗肿瘤治疗。本研究经扬州大学附属医院伦理与道德委员会批准(2019-21-006)，并与患者签署科研知情同意书。收集患者的临床资料，包括年龄、人乳头瘤病毒(HPV)感染、肿瘤大小、病理分级、淋巴结转移和 TNM 分期。新鲜组织采集后放入液氮罐里储存。1.2细胞和主要试剂宫颈癌细胞株 C33A 和HeLa 购自中国科学院上海生科院细胞资源中心，胎牛血清(FBS)和 DMEM 培养基购自美国 HyClone 公司，双抗青霉素-链霉素购自美国 Invitrogen 公司，pi-823-mimics 及对照质粒、pi-823 小干扰及对照质粒均购自重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司，Trizol 试剂和Lipofectamine2000 试剂购自美国Invitro-gen 公司，miScript 逆转录(T)试剂盒购自德国Qiagen 公司，FastKing T Kit 购自北京天根生物公司，Green qPC Master Mix 购自美国 Bimake 公司。1.3方法1.3.1piNA 的表达谱检测提取 2019 年 1 月至2021 年 12 月 5 对 CSCC 组织和癌旁组织的总NA，由上海康成生物科技公司进行 CSCC ArraystarnrStarTMpiNA PC Arrays 表达谱分析，并提供 pi-NA 表达谱结果和相关图像采集。1.3.2细胞培养与转染用含 10%FBS 的 DMEM培养基孵育细胞，培养基中添加双抗青霉素-链霉素。将细胞置于 37、5%CO2细胞培养箱中培养。使用 Lipofectamine2000 试剂将 pi-823 mimics 或小干扰序列等转染至 CSCC 细胞。实验分组:pi-823过表达组(转染 pi-823-mimic 质粒)及对照组(转染阴性对照质粒)、pi-823 干扰组(转染 si-pi-823质粒)和 si-对照组(转染 si-对照组质粒)。1.3.3实时荧光定量聚合酶链反应(qPC)根据试剂说明书使用 Trizol 从 CSCC 冷冻组织中提取总 NA，总 NA 通过 Nanodrop 2000 定量。cDNA使用 miScript 逆转录试剂盒生成。使用 miScriptSYB 进行 qPC，以 U6 为内参。使用 FastKing TKit 提取 cDNA，Green qPC Master Mix 进行 qPC，以 GAPDH 为内参。所有 PC 反应在 Applied Bio-systems 7500 PC 仪器上进行。反应条件:预变性95 30 s，95 5 s60 45 s，共计40 个扩增循环。实验数据均与内参对比后再进行统计学分析。见表 1。1.3.4Transwell 小室实验将 200 l DMEM 培养基滴加在 Transwell 小室的上室(上室覆有直径 8 mm102临床肿瘤学杂志 2023 年 3 月第 28 卷第 3 期Chinese Clinical Oncology，Mar 2023，Vol28，No3表 1qC 相关引物序列基因引物序列(53)pi-823AGCGTTGGTGGTATAGTGGTU6正向CTCGCTTCGGCAGCACA反向AACGCTTCACGAATTTGCGTGAPDH正向TATGACAACAGCCTCAAGAT反向AGTCCTTCCACGATACCA磷酸甘油酸脱氢酶(PHGDH)正向GCAGAACCTTAGCAAAGAGG反向TCTTTCAGGAGGCCGACAAT的膜)，加入已转染的各组细胞，数目约 2105个，实验设有 3 个复孔。在 Transwell 小室的下室加入含有 10%FBS 的 DMEM 细胞培养液。将 Transwell 小室置于下室，放入 37 温箱，孵育 2448 h。用棉签去除 Transwell 小室上室腔里多余的细胞，使用甲醛固定，对小室上腔底部反面的细胞使用 0.1%结晶紫溶液进行细胞染色，高倍光学显微镜下随机选择 5 个观察视野，计算侵袭细胞数目，并拍照和统计。1.3.5生物信息学预测通过 http:/pirnabankibabacin/和 https:/blastncbinlmnihgov/Blast 在线网站对 pi-823 的下游靶基因进行预测。1.3.6Western blotting 检测宫颈癌细胞中加入含 1%PMSF 的 IPA 液，冰上裂解 30 min，4 下12 000 g离心 15 min，吸取上清、分装，以 BCA 法测定蛋白浓度。运用 SDS-PAGE 凝胶电泳。将 2 Loading Buffer 添加到蛋白溶液中，在 100 中孵化5 min。每个上样孔中分别加入 30 g 蛋白样品，使用 70 V 电泳，在染料到达分离胶后调整电压为100 V，观察溴酚蓝到达凝胶下端后终止电泳。取出凝胶裁剪 PVDF 膜，在转移缓冲液中浸泡备用。设置 200 mA 恒流、冰上转膜 50 min。把 PVDF 膜置于5%牛血清蛋白内，室温孵育 2 h。将一抗溶液放入PVDF 膜，4 孵化 12 h。用二抗工作液浸泡 PVDF膜，37 结合2h。按显色后蛋白条带的灰度值计算蛋白表达量。内参为-actin。1.3.7裸鼠肺转移成瘤实验实验组(30 只，雄雌各 15 只)和对照组(30 只，雄雌各 15 只)BALB/C-nu/nu 裸鼠来源于扬州大学动物实验中心。裸鼠均为 8 周龄，重量 2327 g，饲养在 SPF 级动物培养箱内。第 4 天于裸鼠尾静脉注射宫颈癌细胞 2107个左右。接种 2 个月后处死裸鼠，完整剥离肺组织，并于每张切片 5 个低倍镜视野观察转移瘤数目并统计。动物实验获得扬州大学附属医院动物实验伦理委员会批准。1.4统计学分析采用 SPSS16.0 版软件处理数据。计数资料以百分比数据描述，组间比较行2检验;符合正态分布的计量资料以“?xs”描述，两组间比较用 t 检验，多组间比较用单因素方差分析。以P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1CSCC 组织中 piNA 表达谱分析利用 Array-star nrStarTMpiNA PC Arrays 表达谱芯片检测 5例 CSCC 组织和 5 例癌旁组织的 piNA 表达谱。结果显示，分层聚类分析(图 1A)显示数百个上调和下调表达异常的 piNAs。在 CSCC 和癌旁组织之间进行火山图筛选差异表达的 piNAs(图 1B)，阈值倍数变化2.0，且差异均有统计学意义(P0.05)。A:分层聚类分析;B:差异表达 piNAs 的火山图(水平绿线表示0.05 的 P 值，垂直绿线分别对应上下 2.0 倍，“红点”为高表达，“绿点”为低表达)图 1Arraystar nrStarTMpiNA 芯片中 CSCC 的piNAs 表达谱2.2CSCC 组织中 piNAs 验证本研究选择表达上调的 piNAs，并设置筛选条件为 log2FC 大于 3、P值小于 0.01 和对照_CPM 大于 5。筛选结果显示，CSCC 与癌旁组织之间有 5 个上调的 piNAs(表2)。qPC 检测的 95 对 CSCC 和癌旁组织中，只有202临床肿瘤学杂志 2023 年 3 月第 28 卷第 3 期Chinese Clinical Oncology，Mar 2023，Vol28，No3pi-823 和 pi-37390 表达上调(图 2)。根据此结果，选择上调倍数更高的 pi-823 作为实验对象。表 2CSCC 中表达上调的 piNAs序号上调的 tF tiNAs倍数变化1pi-8236.1282pi-16244.4023pi-19667.8814pi-373906.2525pi-223668.0261:pi-823;2:pi-1624;3:pi-1966;4:pi-37390;5:pi-22366;与NC 比较，*P0.05;NC:阴性对照图 25 个上调的 piNAs 的 qPC 验证2.3CSCC 组织中 pi-823 表达水平及与临床病理特征的关系按 pi-823 在 CSCC 与癌旁组织中的表达水平分为两组:高表达组(CSCC 中表达量高于癌旁组织，n=73)和正常或低表达组(CSCC 中表达量等于或低于癌旁组织，n=22)。pi-823 表达与CSCC 病理分级和淋巴结转移有关(P0.05)，而与年龄、HPV 感染、肿瘤大小和 TNM 分期无关(P0.05)。见表 3。2.4pi-823 表达与 CSCC 细胞侵袭的关系在HeLa 细胞中，与对照组(38.66.46)个相比，pi-823 过表达组侵袭数目增多，达到(81.67.24)个(P0.001);与 si-对照组(42.46.41)个相比，pi-823 干扰组的侵袭细胞数目明显减少，为(21.823.48)个(P=0.007)。在 C33A 细胞中，与对照组(40.955.26)个比较，pi-823 过表达组侵袭细胞数目增多，达(76.67.91)个(P=0.023);与 si-对照组(37.655.22)个比较，pi-823 干扰组的侵袭细胞 数 目 明 显 减 少，为(18.86 3.41)个(P=0.026)。见图 3。2.5pi-823 下游靶基因的预测及调控生物信息学预测到 pi-823 的下游靶基因包括 ATP8B1、TSC1、PHGDH、LIMA1、APBB2、PPP25C、NUMB、表 3CSCC 组织中 pi-823 表达与临床病理特征的关系临床病理参数高表达组(n=73)正常或低表达组(n=22)P年龄(岁)0.19755379553613HPV 感染0.145有295无4417肿瘤大小(cm)0.5123341233910病理分级0.024+3316406淋巴结转移0.003有435无3017TNM 分期0.103+3214+418EDC3、CTNNA3 和 OGDH。为了缩小靶基因的范围，本研究设定了相关条件:两者结合点基因序列为互补关系、总分45 分、E 值0.001，因此得到 4个靶基因:ATP8B1、TSC1、PHGDH 和 APBB2。进一步进行 qPC 和 Western blotting 检测，观察改变pi-823 的表达对 4 个靶基因的影响，结果显示，过表达 pi-823 后 PHGDH 的 mNA 和蛋白表达水平降低，反之干扰 pi-823 表达后 PHGDH 的表达水平升高(P 0.05);而 改 变 pi-823 的 表 达 后，ATP8B1、TSC1 和 APBB2 的 mNA 和蛋白表达水平未见明显变化(P 均0.05)。对 95 例 CSCC 组织中PHGDH 的表达水平进行 qPC 检测，结果显示，与癌旁组织比较，CSCC 组织中 PHGDH mNA 的表达水平下调，两组差异有统计学意义(P=0.001)。见图 4图 6。2.6裸鼠肺转移成瘤实验为了进一步研究 pi-823 促进 CSCC 转移的作用，本实验建立了裸鼠实验性肺转移瘤模型。pi-823 在 CSCC 组织中呈高表达水平，因此选择转染 si-pi-823 的 C33A 细胞观察对肺转移瘤的影响。结果显示，与 si-对照组(8.251.26)个相比，pi-823 干扰组的肺转移灶数目显著减少，为(1.480.32)个(P=0.041)。见图 7。302临床肿瘤学杂志 2023 年 3 月第 28 卷第 3 期Chinese Clinical Oncology，Mar 2023，Vol28，No3A:细胞侵袭实验的记录图;B:各组细胞侵袭数目比较;与对应项比较，*P0.05图 3pi-823 对 CSCC 细胞侵袭的影响A:pi-823 与 TSC1 的结合位点;B:pi-823 与 ATP8B1 的结合位点;C:pi-823 与 PHGDH 的结合位点;D:pi-823 与 APBB2 的结合位点图 4生物信息学预测 pi-823 的下游靶基因及结合位点A:qPC 检测;B:Western blotting 检测;与对应项比较，*P0.05图 5pi-823 表达对下游靶基因的影响3讨论宫颈癌是妇科肿瘤的常见类型。子宫颈癌来源于宫颈移行带交界处的鳞状上皮细胞及宫颈管内的柱状上皮细胞1。近二十年，随着宫颈细胞学涂片早癌筛查在我国的普遍应用，宫颈癌及其癌前病变能被早期发现和治疗，使宫颈恶性肿瘤的发病率和死亡率已有明显的下降态势6。探索宫颈癌402临床肿瘤学杂志 2023 年 3 月第 28 卷第 3 期Chinese Clinical Oncology，Mar 2023，Vol28，No3与癌旁组织比较，*P0.05图 6CSCC 和癌旁组织中 PHGDH 的表达水平发生进展过程中的信号通路和发生机制，对于子宫颈癌诊断、治疗和预后判断都具有非常重要的临床价值。A、D:生物发光裸鼠图;B、E:剥离肺组织标本(箭头处为瘤体);C、F:常规病理染色(箭头处为肿瘤细胞，HE 100)图 7pi-823 对 C33A 细胞裸鼠肺转移成瘤的影响在非编码 NA 中有一类与 PIWI 蛋白相互作用的小分子 NA 被命名为 piNA7-8。研究表明，piNAs 通过 NA 干扰、NA 修饰和剪接体参与了基因调控，目前 piNA 对肿瘤发生、发展的影响已成为肿瘤研究的新热点，许多 piNAs 在肿瘤组织中表达异常，从而发挥肿瘤促进或肿瘤抑制的作用，对肿瘤细胞的增殖、凋亡、转移和侵袭产生了重要影响9-11。目前，piNA 对于宫颈癌细胞作用的研究尚未见报道。pi-823 位于人 19 号染色体，基因位点 63164175-63164206，基因序列为 AGCGUUG-GUGGUAUAGUGGUGAGCAUAGCUGC。目 前 研 究表明，pi-823 在多种肿瘤中表达水平异常。例如，与邻近组织比较，pi-823 在结直肠癌组织中的表达显著上调。降低 pi-823 表达能抑制结直肠癌细胞增殖，阻止细胞周期进入 G1期，并诱导细胞凋亡，而过表达 pi-823 则促进结直肠癌细胞增殖;机制上pi-823 通过上调 HSF1 的磷酸化和转录活性发挥肿瘤促进作用12。胃癌患者外周血中 pi-823 的水平明显低于健康对照组，pi-823 水平与淋巴结转移和远处转移有关13。Cheng 等14 发现，胃癌组织中 pi-823 的表达水平明显低于非癌组织，上调胃癌细胞中 pi-823 的表达水平后，细胞生长受到抑制。本研究通过 piNA 表达谱分析，发现 pi-823表达水平升高，并且在 95 例 CSCC 组织中也验证了pi-823 表达水平上调，提示并支持了 pi-823 可以作为促癌基因发挥作用，与 Cui 等13 研究中 pi-823 在结直肠癌组织中的表达显著上调发挥促癌作用的结论相一致。进一步分析 pi-823 表达水平与CSCC 临床病理特征的关系发现，pi-823 表达与CSCC 淋巴结转移和病理分级有关，而与年龄、HPV感染、肿瘤大小和 TNM 分期无关。这一结果表明，pi-823 在 CSCC 中表达水平越高，肿瘤分级越低，恶性程度越高，也越容易转移，提示 pi-823 也是一个促转移的癌基因，并在裸鼠肺转移瘤实验中得到了验证。本研究结果显示，pi-823 表达与 CSCC 淋巴结转移有关，而与 TNM 分期无关，这可能是 TNM分期包含的范围更广，即包括原发肿瘤大小、淋巴结转移和远处转移。本研究标本数量偏少，导致了与 TNM 分期无关。生物信息学预测 pi-823 下游靶基因包括ATP8B1、TSC1、PHGDH、LIMA1、APBB2、PPP25C、NUMB、EDC3、CTNNA3 和 OGDH。在设定相关实验502临床肿瘤学杂志 2023 年 3 月第 28 卷第 3 期Chinese Clinical Oncology，Mar 2023，Vol28，No3条件后得到的靶基因包括 ATP8B1、TSC1、PHGDH和 APBB2。进一步 qPC 和 Western blotting 实验发现仅有 PHGDH 基因随着 pi-823 表达水平的变化而变化。相关研究表明，PHGDH 在肿瘤组织中表达水平下调，比如，PHGDH 缺失会增强癌细胞的转移，PHGDH 的催化活性支持癌细胞增殖，但蛋白低表达无催化作用，会增强转移15。在CSCC 组织中，PHGDH 过表达，尤其是较大的肿瘤和晚期肿瘤，其表达与血清 SCC-Ag 水平呈正相关，表明 PHGDH 可能有助于宫颈癌的预后预测和治疗16。Jing 等17发现敲除宫颈癌 HeLa细胞中的 PHGDH 可显著抑制细胞增殖并增强顺铂化疗的敏感性，由此得出 PHGDH 可以成为一个新的抗癌靶点。本研究结果显示，在 CSCC 组织中 PHGDH 的表达水平低于癌旁组织，表明PHGDH 失活引发宫颈癌的进展。对于 PHGDH失活的原因，本研究认为可能是被 pi-823 直接抑制的结果，即 CSCC 组织中 pi-823 的高表达状态阻碍了 PHGDH 的表达，进而促进 CSCC 细胞的转移和恶性进展。这一调控机制尚未见文献报道，为宫颈癌的发生、发展机制添加了新的内容，也为今后开发针对 pi-823 的药物提供了一定的实验依据。综上所述，pi-823 高表达通过下调 PHGDH表达，促进宫颈癌的恶性程度升高和癌细胞的侵袭、转移。本研究为宫颈癌的诊治和预后预测提供了一定的理论依据。参考文献1Siegel 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