LHPP通过调控NOX2_SHP2通路活性抑制结直肠癌的增殖、侵袭和转移.pdf

论著 通过调控 通路活性抑制结直肠癌的增殖、侵袭和转移董青，郭浩，丁飞，李峰基金项目：年安徽省重点研究与开发计划项目（）作者单位：安徽 安庆，安庆市第一人民医院 消化内科第一作者：董青，男，本科，副主任医师，研究方向：消化道肿瘤和超声内镜诊治，：通信作者：李峰，男，硕士研究生，主任医师，研究方向：消化道肿瘤和超声内镜诊治，：【摘要】目的 探讨组氨酸磷酸酶（）通过氧化应激通路对结直肠癌增殖、侵袭和迁移的影响，并初步阐明其作用机制。方法使用 进行细胞转染操作。将质粒、和寡核苷酸片段、分别转染进 细胞中，通过 检测、的蛋白表达量；将质粒、组转染进 细胞中并同时使用 刺激，通过 检测、的蛋白表达量；将质粒、转染进 和 细胞中，并同时使用 刺激，通过划痕实验检测细胞的迁移距离，实验检测通过孔的细胞数量，克隆形成实验检测细胞的增殖能力。结果 细胞中 组 和 蛋白表达水平明显高于 组（），但 蛋白表达水平明显低于 组（）；细胞中 组 和 蛋白表达水平明显低于 组（），但 蛋白表达水平明显高于 组。与 组相比，细胞中 的 蛋白表达水平明显升高（），但、蛋白表达水平明显降低（），和 细胞迁移距离缩短、穿过孔的细胞数量减少和细胞克隆形成数量减少；加入 干预后，消除了 和 细胞中 组和 组在、的差异，也消除了细胞划痕、细胞侵袭和细胞增殖的差异。结论 通过促进氧化应激抑制、和 通路活性进而抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移的影响进而缓解结直肠癌的进展。【关键词】组氨酸磷酸酶；结直肠癌；信号通路；增殖；侵袭；迁移：文章编号：（），（，）：，：【】（），中国肿瘤外科杂志 年 月第 卷第 期 ，（），（），（），（），（），【】；结直肠癌（，）是世界范围内最为恶性的胃肠道肿瘤之一。尽管结肠镜检查技术的发展改善了 患者的预后，但在低收入国家，年相对生存率仍低于。年估计 新发和死亡病例分别为 万例和 万例，其中 岁的 患者数量尤其高。因此，迫切需要揭示结直肠癌的病理机制，开发新的治疗方法。磷脂磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶（）是一种组氨酸磷酸酶，的低表达可导致组氨酸磷酸化上调，促进肿瘤生长。是 号染色体编码的 的肿瘤抑制分子，高度保守，并且主要位于细胞质当中。在消化系统肿瘤中包括胃癌、肝癌、食管癌中呈现了低表达状态。通过 通路和 等通路发挥了重要作用。有研究表明，恶性肿瘤的恶性转化与慢性氧化应激有关，且恶性转化细胞中的活性氧（）水平急剧上升。也可以通过丝裂原活化蛋白激酶（）信号通路（是细胞中重要的信息传递通路）参与肿瘤的发生。可抑制 和 通路活性细胞内 的产生水平，与细胞死亡密切相关，虽然肿瘤细胞能够适应内源性和持续氧化应激的刺激，但一旦 水平超过一定阈值，仍会导致细胞死亡。促进 活性，可抑制 活性。通过调控侵袭和细胞凋亡被证明是一种促进肿瘤生长的基因，也是促进细胞增殖的基因。本研究探究 可通过调控氧化应激通路 通路进而对结直肠癌增殖、侵袭和转移的影响，作为结直肠癌氧化应激的新的调节通路，初步阐明具体作用和机制。材料与方法 实验材料人 细胞系 细胞和 细胞购自中国科学院（上海）细胞库，胎牛血清购自 公司，培养基、青霉素链霉素（）、无血清培养基（）、试剂和转 染 试 剂 均购自 ，逆转录试剂盒 和 （）均购自日本 公司，和 购于中国 公司，裂解液 和（抗氧化剂）均购自江苏碧云天生物科技有限公司，膜 购自美国 公司，蛋白质定量试剂盒 购自北京天根生化科技有限公司。抗体、抗体、抗体、抗体、抗 体、抗 体、抗体 和 抗体 均购自美国 公司，小室中国肿瘤外科杂志 年 月第 卷第 期 ，购自美国 公司，吉姆萨染液 购自北京索莱宝科技有限公司。细胞培养 细胞和 细胞培养在含有 和 抗生素的 培养基中，、的无菌培养箱中进行培养，换液、传代 次，取对数生长期细胞进行后续实验。细胞转染及分组转染前 天将 细胞接种于 孔板中，并加入 不含抗生素的完全培养基，使其转染时细胞密度达。在 无血清 中稀释 质粒 或供体，再加入脂质体悬液，室温下放置 ，使 结合在脂质体上。弃去旧液，无血清 洗细胞 次后弃去，向每孔中加入 和脂质体复合物，培养 。然后每孔中加入 的，继续培养 后，吸出 脂质体混合物后以 孔加入新鲜 的，培养 。消化后收集细胞，使用 将寡核苷酸和质粒转染到 细胞和 细胞中。将 细胞分为 组和 组、组和 组。将 细胞和 细胞分为 组：定义 为 组，组为 组，加入 干预为 组，加入 干预为 组。提取和定量 细胞系的总蛋白。使用含有蛋白酶抑制剂的 缓冲液进行裂解，以确保从各实验组获取的蛋白质样本完整无损。接着，运用 蛋白质定量试剂盒准确测定了蛋白浓度。通过 电泳系统，均一地分离了含量为 的总蛋白样本。随后，电泳分离的蛋白质被转移到 膜上，以进行下一步的免疫印迹分析。膜在 脱脂牛奶中封闭，避免非特异性结合后，于 条件下与目标抗体一夜之间孵育。具体目标抗体包括、磷酸化（）、磷酸化（）、磷酸化（）、以及加载控制。随后，室温下孵育了相应的二抗，最大限度降低了背景干扰。经过 缓冲液洗涤后，通过增强型的化学发光法（）检测了条带信号。借助 软件的先进图像分析功能，测定了条带的灰度值，以定量蛋白表达水平。细胞划痕将转染成功的 和 细胞接种至 孔培养板中，每孔含 个细胞。在 和 的培养箱内，细胞被培养 。经培养后，我们利用 吸头在细胞层上轻轻创造一条划痕并予以标记。随后，两次以磷酸盐缓冲液（）轻洗划痕，以去除松散细胞，再换入无血清的新鲜培养基。在培养初始（）和 后，我们利用倒置显微镜观察每组细胞的划痕愈合情况，并测量划痕宽度，最后进行拍照记录 侵袭实验 将转染的 和 细胞种植于装有无血清 的 小室，每孔种植 个细胞。下层小室中则加入 包含 胎牛血清的完全培养基。在 条件下孵育 后，我们使用棉签轻轻移除未能穿过孔隙的细胞。接着我们使用 戊二醛对迁移至下层的细胞进行固定（），之后用 结晶紫染色 ，完成染色后对细胞进行拍照和计数。我们选择 个不同的视野进行拍摄并计算平均值。克隆形成实验转染后的 和 细胞以每孔 细胞的密度种植在 孔板中，在、条件下继续培养。在预定时间点，用 洗涤 次，随后用多聚甲醛固定细胞。固定完成后，在室温下用吉姆沙染液染色 ，最后在显微镜下进行细胞克隆计数，并进行拍照存档。统计学方法实验数据的统计分析通过 软件执行。所有数据均以均数标准差（）表示。通过 检验对两组数据间的差异性进行分析，同时使用单因素方差分析（）评估多组间的差异。具有统计学意义的差异设定为 。结果 检 测 细 胞 中、蛋白表达情况 结果显示：细胞中 组 和 蛋白表达 水 平 明 显 高 于 组（），但 组 蛋白表达水平明显低于 组（）；组 和 蛋白表达水平明显低于 组（），但 组蛋白表达水平明显高于 组（）。实验结果表明 可促进 的表达量、抑制 蛋白表达量，见图。检 测 细 胞 中、蛋白表达情况 实验结果显示：组 中国肿瘤外科杂志 年 月第 卷第 期 ，蛋白表达水平明显高于 组（），但 组、蛋白表达水平明显低于 组（）；加入 干预后，组和 组 蛋白表达水平明显低于 组和 组（），两组间差异无统计学意义（），组 和 组、蛋白表达水平明显高于 组和 组（），组和 组差异无统计学意义（）。实验结果表明 可促进 的表达抑制、和 通路相关蛋白的磷酸化水平进而抑制 细胞的增殖、侵袭和迁移，见图。图 对 细胞中的 蛋白的影响 为 实验检测各组 细胞中、蛋白的表达情况；为各组 细胞中、蛋白表达水平统计图，图 对 细胞中的、和 通路相关蛋白的影响 为 实验检测各组 细胞中、等蛋白的表达情况；为各组 细胞中、蛋白表达水平统计图，中国肿瘤外科杂志 年 月第 卷第 期 ，细胞划痕实验检测各组 细胞和 细胞的迁移能力 细胞划痕实验结果显示：细胞和 细胞 组的细胞划痕之间的距离明显比 组宽（），组和 组的细细胞划痕之间的距离明显比 组和 组窄（），组和 组间差异无统计学意义（）。实验结果表明 通过氧化应激通路抑制 细胞和 细胞的迁移能力，见图。迁移实验检测各组 细胞和 细胞迁移能力 实验结果显示：组的细胞通过孔的细胞数量少于 组（），组和 组的细胞通过孔的细胞数量多于 组和 组（），组和 组的细胞差异无统计学意义（）。实验结果表明 通过氧化应激通路抑制 细胞和 细胞的侵袭能力，见图。图 通过氧化应激通路抑制 细胞和 细胞迁移能力 为细胞划痕实验检测各组 细胞迁移能力的情况；为细胞划痕实验检测各组 细胞迁移能力的情况；为各组 细胞划痕距离统计图，；为各组 细胞划痕距离统计图，图 通过氧化应激通路抑制 细胞和 细胞迁移能力产生影响 为 迁移实验检测各组 细胞侵袭能力；为 迁移实验检测各组 细胞侵袭能力；为各组 细胞迁移数目统计图，；为各组 细胞迁移数目统计图，中国肿瘤外科杂志 年 月第 卷第 期 ，克隆形成实验检测各组 细胞和 细胞增殖能力克隆形成实验结果显示：组的单克隆形成数量明显少于 组（），组和 组的单克隆形成数量明显多于 组和 组（），组和 组间的差异无统计学意义（）。实验结果表明 通过氧化应激通路抑制 细胞和 细胞的增殖能力，见图。图 通过氧化应激通路抑制 细胞和 细胞增殖能力 为克隆形成实验检测各组 细胞和 细胞单克隆形成数量；为各组 细胞和 细胞单克隆形成数量数目统计图，讨论 是全球第三大最常发现的癌症类型，也是导致癌症相关死亡的第二大常见原因。年的数据显示，有超过 万例 新发病例和 万例 死 亡 病 例，约 占 癌 症 死 亡 的 十 分 之一。近年来，有效的癌症筛查和预防措施的发展成功地改善了局部 治疗的结果，但远处转移到重要器官和术后复发是导致 死亡的主要原因。作为一种组氨酸磷酸酶，与蛋白质二聚体和无机焦磷酸酶活性相关。有研究发现，在 和 缺失产生的肝细胞癌（，）小鼠模型中观察到 的低表达。此外，的降低与 患者的肿瘤严重程度和总生存期减少有关。这些结果在子宫颈癌中也同样存在。上调 可通过调节 水平抑制宫颈癌细胞增殖、转移和促进凋亡，低表达的患者肿瘤大小明显增大。因此，可以作为肿瘤抑制因子来抑制肿瘤的发展。可促进 活性。有研究已验证了 信号通路和 之间的潜在相互作用，信号通路依赖基因的转录可影响肿瘤细胞中 的积累。促进 活性，可抑制 活性，可以通过生长因子或细胞因子的刺激而磷酸化，从而激活 信号通路。和 通路同时受到 调控。我们推测 可通过氧化应激抑制 活性，进而抑制 和 通路，抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移。本研究的重点是 在 增殖、侵袭和转移中的作用。信号通路是参与肿瘤发生的最经典通路之一。被胰岛素受体（）、表皮生长因子（）、相关的胰岛素样生长因子受体（）、血小板衍生生长因子受体（）等细胞外信号异常激活，在调节细胞增殖和维持恶性细胞的生物学特征方面起着极其重要的作用。通过对 细胞转染后进行不同干预并进行检测发现，组 和 蛋白表达水平明显高于 组，蛋白表达水平明显低于 组；组 和 蛋白表达水平明显低于 组，蛋白表达水平明显高于 组。组 蛋白表达水平明显高于 组，、蛋白表达水平明显低中国肿瘤外科杂志 年 月第 卷第 期 ，于 组，经 干预后，蛋白表达水平降低，、蛋白表达水平增加，并且 组和 组差异无统计学意义。结果表明，可在增加氧化应激、抑制、和 通路相关蛋白表达进而抑制 细胞的增殖、侵袭和迁移。通过细胞划痕实验、迁移和克隆形成实验，与 组相比，组 细胞和 细胞增殖能力和迁移能力、侵袭能力均有降低，干预后，组和 组的增殖能力、迁移能力、侵袭能力差异无统计学意义。说明 可抑制 细胞和 细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力。本研究表明，可通过促进氧化应激相关蛋白的表达、抑制、和 通路活性进而抑制 细胞的增殖、侵袭和转移。综上所述，通过促进氧化应激、抑制、和 通路活性进而抑制 细胞的增殖、侵袭和转移实现缓解 的进展。但对于 缓解 的作用值得进行进一步研究。参考文献：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（），：，（）：，（）：，：，（）：陈丽萍，籍强，陈艳红，等 非小细胞肺癌组织中、表达与上皮间质化相关性及临床意义 国际检验医学杂志，（）：，（），（）：，（）：，（），（）：，：，：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，：，（）：宋春灼 通过下调 磷酸化水平抑制肝癌细胞增殖及侵袭转移的机制研究 贵阳：贵州医科大学，：，（）：，修回日期：本文编辑：文心中国肿瘤外科杂志 年 月第 卷第 期 ，