miR⁃138⁃5p靶向Nir1调控胶质瘤细胞的侵袭.pdf

循证医学2024年第24卷第1期The Journal of EvidenceBased Medicine，2024，Vol.24，No.1基金项目 山东省医药卫生科技发展计划项目（2019WS157）。作者简介 陈萍萍（1982-），女，山东日照人，副主任技师，医学硕士，主要研究方向为肿瘤病理。Email：。miR1385p靶向Nir1调控胶质瘤细胞的侵袭陈萍萍1，平勇2，赵一诺1，梁粉花1，宋佰慧2，王玲1，李慧玲1，孙树艳1（1.日照市人民医院病理科，山东日照 276827；2.日照市中心医院，山东日照 276899）摘要 目的探讨 miR1385p 与 PYK2 N 端结构域相互作用受体 1（PYK2 Nterminal domaininteractingreceptor 1，Nir1）之间的关系并判断其是否通过与Nir1结合影响胶质瘤的侵袭。方法比较不同胶质瘤细胞系中miR1385p表达水平及其对胶质瘤细胞U251和H4中Nir1蛋白的影响、转染后胶质瘤细胞侵袭能力，检测miR1385p能否与 Nir1 靶向结合。结果低侵袭人胶质瘤 H4 细胞中 miR1385p 的水平显著高于高侵袭性的胶质瘤 U251、LN229 和 U87细胞（P0.05）。miR1385p过表达组穿过基底膜小孔的U251、H4细胞数明显少于其对照组（P0.05）。miR1385p过表达显著降低Nir13UTR的荧光素酶活性。结论胶质瘤细胞中miR1385p与Nir1结合，可通过降低Nir1的翻译、减少Nir1蛋白的表达抑制胶质瘤细胞的侵袭能力。关键词 胶质瘤；侵袭；miR1385p；Nir1中图分类号 R739.41文献标识码 ADOI：10.12019/j.issn.16715144.2024.01.007miR1385p Promotes Glioma Cells Invasion by Targeting Nir1CHEN Pingping1，PING Yong2，ZHAO Yinuo1，LIANG Fenhua1，SONG Baihui2，WANG Ling1，LI Huiling1，SUN Shuyan1（1.Pathology Department，Peoples Hospital of Rizhao，Shandong Rizhao 276827，China；2.Rizhao Central Hospital，Shandong Rizhao 276899，China）Abstract：ObjectiveTo investigate the relationship between miR1385p and PYK2 Nterminal domaininteractingreceptor 1（Nir1）and determine whether miR1385p affects glioma invasion through binding with Nir1.MethodsTheexpression level of miR1385p in different glioma cell lines and its effect on Nir1 protein in glioma cells U251 and H4were compared，as well as the invasion ability of glioma cells after transfection，to detect whether miR1385p could targetNir1.ResultsThe level of miR1385p in lowinvasive human glioma H4 cells was significantly higher than that in highlyinvasive human glioma U251，LN229 and U87 cells（P0.05）.Thenumber of U251 and H4 cells in the miR1385p overexpression group passing through the small hole in the basementmembrane was significantly less than that in the miRNC group（P55Tumor size/（cm）22Histological graden125029332636Nir1+10462032535-2491211c20.1366.99840.112P0.7130.0080.01表1两组组化资料比较Tab.1Comparison of histochemical data between thetwo groups38A AB BC CD DE EF F图1低、高级别胶质瘤形态（20）Fig.1The morphology of low and high grade gliomas（20）注：A.Nir1低级别胶质瘤；B.Nir1高级别胶质瘤；C.低级别胶质瘤（HE）；D.高级别胶质瘤（HE）；E.低级别胶质瘤（GFAP）；F.高级别胶质瘤（GFAP）。Notes：A.Nir1 lowgrade glioma；B.Nir1 highgrade gliomas；C.lowgrade glioma（HE）；D.highgrade gliomas（HE）；E.lowgrade glioma（GFAP）；F.highgrade gliomas（GFAP）.U251 或 H4 细胞分 4 组：过表达对照组（miRnegative control，miRNC）：细胞瞬时转染含有一段乱码序列scramble1的质粒。过表达miR1385p组（miR1385p）：细胞瞬时转染具有目标片段5AGCUGGUGCCUUGUGAAUCAGGCCG3的质粒。miR424 抑制剂组（miR1385p inhibitor）：细胞瞬时转染含有 miR1385p 的反义序列的质粒。抑 制 组 的 对 照 组（inhibitor negative control，inhibitor NC）：细胞瞬时转染含有插入一段乱码序列scramble2的质粒。1.3.4蛋白质印迹提 取 转 染 后 细 胞 的 蛋 白，再 经 十 二 烷 基硫 酸 钠 聚 丙 烯 酰 胺（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）电泳处理、转膜、用5%脱脂奶粉进行封闭，滴加一抗，4 过夜反应、再加入二抗孵育 1 h，利用暗室显影。内参选用肌动蛋白（actin），通过目的条带与内参条带灰度值的比值计算得到目的蛋白的相对表达量。1.3.5RTPCR按照试剂MMLV说明书将提取细胞的总RNA反转录为cDNA。用双蒸水稀释ARK5和actin引物，参考 SYBR Premix（PerfectReal Time）试剂盒说明书（北京碧云天生物技术有限公司），进行RTPCR 扩增（两步法），先 20 s，95 预变性；然后95 反应5 s，60 反应30 s，循环40次。选用Antiactin为内参，采用Ct值计算得到各组细胞相对Nir1表达。1.3.6荧光素酶活性检测通过 TargetScan 软件对 miR1385p 调控 Nir1的靶位点进行预测。筛选得到Nir1的3端非编码区（3untranslatedregion，3UTR）存在1个非保守位点 5UUGGCUUUCCAAAGGCACCAGCU3。真核表达载体质粒pmiRGLO靶基因报告质粒和3UTR端突变报告载体构建于上海吉玛制药技术有限公司。pRLTK被选为标准内质控。以Lipofectamine2000说明书为依据，再根据实验分组，U251、H4细胞共转染荧光素酶报告载体与miR1385P及对照陈萍萍，等.miR1385p靶向Nir1调控胶质瘤细胞的侵袭39循证医学2024年第24卷第1期scramble1序列。转染4 h后换液培养48 h（37、5%CO2）。通过参考双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书（上海吉玛制药技术有限公司）检测细胞荧光素酶活性。1.3.7Transwell侵袭实验预先用Matrigel胶覆盖transwell小室（8 m滤膜）微孔。上室中加入转染后的细胞悬液（5105/mL），含10%胎牛血清的DMEM培养液加入下室，再5%CO2培养箱（37）中培养24 h，然后用4%多聚甲醛固定20 min，再用PBS冲洗，最后Giemsa染色20 min后用PBS冲洗晾干，镜下计数。1.4统计学方法用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析。用均数标准差（xs）表示计量资料，独立样本t检验用于比较两组数据之间的差异。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1miR1385p在不同胶质瘤细胞系中的表达RTPCR检测H4、U251、LN229、U87胶质瘤细胞中miR1385p的表达水平，结果显示低侵袭人胶质瘤 H4 细胞中 miR1385p 的水平显著高于高侵 袭 性 的 胶 质 瘤 U251、LN229 和 U87 细 胞（P0.05），见图2。2.2细胞中 miR1385p 的水平对 Nir1 蛋白表达的影响培养U251、H4细胞中分别转染过表达对照组（miRNC）、抑制组（miR1385p inhibitor）、抑制对照组（inhibitor NC）和过表达组（miR1385p），转染成功后western blot实验检测各组细胞中Nir1蛋白的表达量，结果显示miR1385p组U251、H4细胞中Nir1蛋白表达量较miRNC组降低；miR1385pinhibitor 组 U251、H4 细胞中 Nir1 蛋白表达量较inhibitor NC组升高（P0.05），见图4。2.4miR1385p对胶质瘤细胞侵袭能力的影响通过 Transwell 侵袭实验，检测 miR1385p 对胶质瘤细胞侵袭能力的影响，结果显示，miR1385p组穿过基底膜小孔的U251、H4细胞数明显少于miRNC组（P0.05，图5A、5B）。2.5Nir1是miR1385p的靶基因验证为 了 寻 找 miR 138 5p 的 靶 基 因，通 过TargetScan 靶 基 因 预 测 软 件 预 测，结 果 发 现miR1385p 与 Nir1 的 3UTR 区互补结合（图 6A）；荧光素酶报告基因检测结果显示，miR1385p 过表达的 U251、H4 细胞中 pGL3Nir13UTR 荧光素酶活性较其对应的对照组中降低显著（P0.05，图 6B）。3讨论众多研究证明，Nir1作为抑制恶性肿瘤侵袭转移的靶点，其表达与乳腺癌、肺癌等肿瘤的浸润、转移和预后密切相关5，1213。本课题组在前期对Nir1在胶质瘤细胞中的表达情况及与胶质瘤细胞的侵袭转移进行了相关性研究7，结果显示 Nir1表达降低后导致胶质瘤细胞中Akt的磷酸化能力和 Factin 聚合量的减少是胶质瘤细胞运动和侵 袭能力减弱的重要原因，上皮间叶细胞转化（epithelialtomesenchymal transition，EMT）相关蛋白检测结果显示 Nir1 蛋白是通过调节转录因子Snail诱导胶质瘤H4细胞向MT转化的。然而Nir1促进胶质瘤细胞的侵袭是否也受某种miRNA的调控尚未有研究，但有研究表明 1418，过表达miR1385p可抑制胰腺癌和膀胱癌的侵袭和转移，抑制胶质瘤细胞血管的生成能力，降低胶质瘤细胞的侵袭1.000.800.600.400.200.00Relative expression of miR1385pH4U251LN229U87H4U251LN229U87*图2H4、U251、LN229和U87细胞中miR1385p的表达水平Fig.2The expression of miR1385p in H4，U251，LN229 and U87cellsNote：*P0.05.40U2511.501.000.500.00Relative expression of Nir1 protein*miRNCmiR1385p inhibitorInhibitor NCmiR1385pmiRNCmiR1385p inhibitorInhibitor NCmiR1385p1.501.000.500.00Relative expression of Nir1 proteinH4*Nir1bactinU251miRNCmiR1385pinhibitorInhibitor NCmiR1385pNir1bactinH4miRNCmiR1385pinhibitorInhibitor NCmiR1385p图3U251、H4细胞中miR1385p的表达对Nir1的影响Fig.3Expression of miR1385p reduces protein expression in U251 and H4 cellsNote：*P0.05.1.000.800.600.400.200.00Nir1 mRNA fold increasedU251/miRNCU25/miR1385pH4/miRNCH4/miR1385p图4RTqPCR检测miR1385p过表达对Nir1 mRNA水平的影响Fig.4RTqPCR detected Nir1 mRNA afteroverexpression of miR1385p转移能力。因此我们使用 TargetScan 靶基因预测软件进行预测，发现 miR1385p 与 Nir1 的 3UTR区互补结合。本研究RTPCR实验检测结果显示，低侵袭人胶质瘤 H4 细胞中 miR1385p 的水平显著高于高侵袭性的胶质瘤 U251、LN229 和 U87 细胞；转染miR1385p、miR1385p inhibitor 及相应的阴性对照到 U251 细胞和 H4 细胞后，Western blot 实验检测结果发现，miR1385p过表达的U251细胞和H4细胞中 Nir1 蛋白表达量均降低，表明 miR1385p与Nir1的3UTR区互补结合具有抑制胶质瘤细胞的侵袭能力。Zhang等19的研究发现，miR138在临床胶质瘤组织样本中表达常下降，miR138上调对胶质瘤细胞具有显著的抗增殖和抗侵袭作用，可促进其凋亡。Jiang 等20的研究显示，Nir1在癌组织中的表达高于正常组织，可在恶性肿瘤中发挥促癌功能。本结果与两者研究结果均具有相似性，进一步证明了miR1385p与Nir1的3 UTR区互补结合对胶质瘤细胞侵袭的抑制作用。miRNA 与靶基因 mRNA 的 3 UTR 特异性结合，将直接导致靶mRNA降解或翻译抑制，下调转陈萍萍，等.miR1385p靶向Nir1调控胶质瘤细胞的侵袭41循证医学2024年第24卷第1期U251/miRNCU251/miR1385p80.0060.0040.0020.000.00Invading cells/field*U251/miRNCU251/miR1385pA AH4/miRNCH4/miR1385p50.0040.0030.0020.0010.000.000Invading cells/field*H4/miRNCH4/miR1385pB B图5miR1385p对胶质瘤细胞侵袭能力的影响（200）Fig.5The effects of miR1385p on the invasion of gliomas cells（200）注：A.miR1385p过表达促进了U251细胞的侵袭，并对侵袭能力进行了统计学分析（*P0.05）；B.miR1385p过表达促进H4细胞的侵袭，对其侵袭能力进行统计学分析（*P0.05）。Notes：A.miR1385p overexpression promotes the invasion of U251 cells and statistical analysis for the invasion ability（*P0.05）；B，miR1385poverexpression promotes the invasion of H4 cells and statistical analysis for the invasion ability（*P0.05）.录后靶蛋白的表达水平，从而达到调控靶基因表达的目的2122。为了证实这一机制，本研究通过RTPCR实验检测转染后各细胞中Nir1的mRNA的水平改变情况，结果显示miR1385p过表达的胶质瘤细胞中 Nir1 的 mRNA 水平无明显改变；细胞侵袭实验结果显示miR1385p过表达的胶质瘤细胞侵袭能力明显下降；荧光酶素基因报告显示miR1385p 过表达的胶质瘤细胞 pGL3Nir13UTR荧光酶素活性显著降低。说明miR1385p抑制 Nir1 蛋白的表达不是通过降低Nir1的mRNA起作用的，而是通过抑制 Nir1 翻译发挥作用的；miR1385p 能够显著抑制胶质瘤细胞的侵袭能力；Nir1 是 miR1385p的靶向基因。伍军等23的研究显示，miR223p与NLRP33UTR可通过直接结合抑制肿瘤发生，本研究结果具有相似性，进一步证实了miR1385p与Nir1的3UTR区互补结合。综上所述，高级别胶质瘤组织中Nir1蛋白表达水平高于低级别胶质瘤组织，胶质瘤细胞中miR1385p 与 Nir1 结合，可通过降低 Nir1 的翻译、减少 Nir1蛋白的表达抑制胶质瘤细胞的侵袭能力。miR1385p 有望成为抑制胶质瘤侵袭的新靶点，但 miR1385p 抑制 Nir1 蛋白翻译的分子机制需要进一步研究。参考文献1ROUSSEAU A，MOKHTARI K，DUYCKAERTS C.The 2007WHO classification of tumors of the central nervous systemwhathas changed？J.Curr Opin Neurol，2008，21（6）：720-727.2XU S，TANG L，LI X，et al.Immunotherapy for glioma：current management and future applicationJ.Cancer Lett，2020，476：1-12.3MILLER A M，SHAH R H，PENTSOVA E I，et al.Trackingtumourevolutioningliomathroughliquidbiopsiesofcerebrospinal fluid 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