氯吡格雷及其非活性代谢物的比格犬体内药动学的分析研究.pdf

沈叼药科大学硕士学位论文摘 要摘 要氯口比格雷是一种用于治疗急性冠脉综合征的抗血小板药物，与阿司匹林相比，有着更好 的抑制血小板的效应，且能够显著的降低缺血事件的发生率，是减少心脑血管不良事件的重 要药物。在文献查询过程中发现，国内外对于氯毗格雷及其代谢物的非临床研究数据很少，不利于相关制剂的进一步发展，因此展开此非临床药物动力学研究，以对其新剂型的开发研 制提供更多的理论支持。本文采用液相色谱-串联质谱法，对受试制剂氯毗格雷片和参比制剂波立维进行比格犬 体内药物动力学及生物利用度对照研究。受试制剂和参比制剂中氯毗格雷的达峰时间Tma x分 别为 1.7 0.7 h 和 1.9 0.6 h,最大血药浓度 Cma x 分别为 1637.3 士 382.1 n g-mL-1 和 1663.0 i 472.2 n g-mL-1,血药浓度-时间曲线下面积 AUCo-t 分别为 7622.8 2548.2 n g-h-mL-1 7876.6 土 2562.0 n g h mL_1,AUCo。分另U为 8128.5 2664.9 n g h mL_1 和 8563.4 2679.6 n gh mL。以 AUCo.t计算，与参比制剂相比，受试制剂的相对生物利用度为99.3 25.5%。根据生物利用度 和生物等效性试验的要求，受试制剂与参比制剂波立维比较，AUCo-t、Cma x、Tma x符合生物 等效性要求，但个体差异很大。本文还建立了一种快速可靠的HPLC分析方法，对血浆内氯毗格雷较酸代谢物(CRCA)的含量进行定量测定，并进行比格犬体内药物动力学研究。本方法以唾氯匹定为内标物质，以KH2Po4-乙晴(80:20,v/v,pH=4.0)为流动相，检测波长220 n m,流速1.2 mLmi n,样 品分析时间约9mi n,线性范围在0.2-8(-0.99)，以6只比格犬为研究对象，进行了氯毗格雷的药物动力学研究。受试制剂和参比制剂中氯毗格雷蝮酸代谢物的达峰时间Tma x 分别为1.7 土 0.7 h和1.8 土 L2 h,最大血药浓度Cm”分别为4.1 土 1.5 pi gmL和5.0 1.6 Ng-mL/，血药浓度-时间曲线下面积AUCo“分别为13.4 5.2 ji gh mL和12.95.4 g h mL1,AUCo 分别为15.1 6.0 Rg4r mL-i和14.6 5.9 Rgh r n LL 结果显示，本方法灵敏度高，在 0.2-8 RgmL”范围内线性良好且重现性好，分析时间短，满足日常分析的需求。关键词：药物动力学；生物利用度；高效液相串联质谱法；高效液相色谱法；氯毗格雷；非活性代谢物1沈阳药科大学硕士学位论文ABSTRACTABSTRACTClo pi do gr el i s a n a n t i pla t elet pr o dr ug fo r t h e t h er a py o f a c ut e c o r o n a r y sy n dr o mes(ACS).Co mpa r i n g t o a spi r i n,c lo pi do gr el h a s h i gh er a n t i pla t elet efi ec t a n d c o uld dec r ea se t h e r i sk o f i sc h emi c even t s si gn i fi c a n t ly.S o i t h a s b ei n g wi dely used i n c li n i c t o r educ e a dver se even t s o f c a r di o va sc ula r t r ea t men t.Few st udi es h a ve b een r epo r t ed fo r i t s n o n-c li n i c a l ph a r ma c o ki n et i c s a n d a s a c o n sequen c e b ei n g a n o b st a c le o f n ew do sa ge fo r m develo pmen t.As a r esult,we per fo r m t h i s st udy,t o sa t i sfy t h e r esea r c h i n t er est a n d suppo r t fur t h er st udi es o f c lo pi do gr el.We per fo r m st udy o n ph a r ma c o ki n et i c s o f b ea gle do gs b et ween t est i n g dr ug c lo pi do gr el b i sulfa t e t a b let s a n d r efer en c e dr ug PLAVIX usi n g LC-MS/MS met h o d.Th e t i me t o pea k(Tma x)o f c lo pi do gr el i n t est i n g a n d r efer en c e pr epa r a t i o n s a r e 1.7 0.7 h a n d 1.9 0.6 h;Th e ma xi mum o f c o n c en t r a t i o n(Cma x)i n pla sma a r e 1637.3 382.1 n g mLa n d 1663.0 472.2 n g mL1.Ca lc ula t ed wi t h t r a pezo i da l r ule,t h e a r ea un der c o n c en t r a t i o n-t i me c ur ve(AUCo-t)a r e 7622.8 士 2548.2 n g h mLa n d 7876.6 2562.0 n g h mL;AUCy a r e 8128.5 2664.9 n g h mL_1 a n d 8563.4 2679.6 n g h-mL-1.Ca lc ula t ed wi t h AUCo-t t h e b i o a va i la b i li t y o f t est i n g dr ug i s 99.3 25.5%c o mpa r i n g t o r efer en c e dr ug.Ac c o r di n g t o t h e r egula t i o n s o f b i o a va i la b i li t y a n d b i o equi va len c e,we c o n c lude t h a t,c o mpa r i n g t o r efer en c e dr ug PLAVIX t h e b i o equi va len c e da t a(AUCo-t,Cma x a n d Tmax)o f t est i n g dr ug a r e a c c ept a b le,b ut h a ve si gn i fi c a n t di ffer en c e b et ween i n di vi dua ls.We h a ve a lso develo ped a sen si t i ve,si mple a n d r a pi d met h o d fo r det er mi n a t i o n o f c lo pi do gr el c a r b o xy li c a c i d met a b o li t e,a n d t h i s met h o d i s suc c essfully used t o st udy ph a r ma c o ki n et i c s o f b ea gle do gs b et ween t est i n g dr ug c lo pi do gr el b i sulfa t e t a b let s a n d r efer en c e dr ug PLAVIX.In t h i s Met h o d,we use t i c lo pi di n e a s i n t er n a l st a n da r d sub st a n c e,KH2POr a c et o n i t r i le(80:20,v/v,pH=4.0)a s mo b i le ph a se,wi t h UV det ec t i o n a t 220 n m.Th e flo w r a t e i s 1.2 mL-n i i n _1 a n d t h e t o t a l r un t i me o f a n a ly si s i s a b o ut 9 mi n.Th e met h o d i s li n ea r o ver t h e r a n ge o f 0.2-8 gg-mL-1(r 0.99).Do ub le ph a se c r o sso ver exper i men t b et ween t wo pr epa r a t i o n s i s desi gn ed,a n d si x b ea gle do gs a r e a dmi n i st er ed t o det er mi n e t h o se pla sma c o n c en t r a t i o n s in vivo.Th e t i me t o pea k(Tma x)o f c lo pi do gr el i n t est i n g a n d r efer en c e pr epa r a t i o n s a r e 1.7 0.7 h a n d 1.8 1.2 h;Th e ma xi mum o f c o n c en t r a t i o n(Cma x)i n pla sma a r e 4.1 1.5|i g mL-,a n d 5.0 1.6 gg r n L_1.Ca lc ula t ed wi t h t r a pezo i da l r ule,t h e a r ea un der c o n c en t r a t i o n-t i me c ur ve(AUCo-t)a r e 13.4 5.2|i gh mL“a n d 12.9 2沈阳药科大学硕士学位论文ABS TRACT土 5.4 gg-h-mL1;AUCo a r e 15.1 6.0 gg-h-mL-1 a n d 14.6 士 5.9 ji g h mL1.Th e met h o d we pr o vi de h a s h i gh sen si t i vi t y,go o d li n ea r i t y a n d r epr o duc i b i li t y,a n d t h a t i t c a n b e used fo r t h e r a pi d a n d r eli a b le det er mi n a t i o n o f c lo pi do gr el met a b o li t e i n pla sma i n ph a r ma c o ki n et i c st udi es.Key wor ds:ph a r ma c o ki n et i c s;b i o a va i la b i li t y;LC-MS;HPLC;c lo pi do gr el;i n a c t i ve met a b o li t e3沈阳药科大学硬十学位论文第一章结论第一章绪 论1.1 抗血小板药物简介急性冠脉综合征(Ac ut e Co r o n a r y S y n&o mes,ACS),是目前威胁人类生命的最重要病因，包括非S T段抬高的急性心肌梗死(NS TEMD、稳定型心绞痛(UP)和不稳定型心绞痛(UAP)、S T段抬高的急性心肌梗死(S TEMI),共同的发病原因是冠脉动脉硬化斑块不稳定。研究表 明，血小板在动脉硬化的发病、血栓形成的过程中起非常重要的作用。血栓形成缘于血管内 皮粥样硬化的斑块沉积，进而斑块表面糜烂或破裂造成血管内皮损伤，被激活的血小板在破 溃部位黏附、聚集最终形成白色血栓，这是NS TEMI与UAP的形成特点，治疗方法应当以 抗栓(抗血小板)和抗凝治疗为主；同时，被激活的血小板又释放多种物质为活化凝血因子 提供平台，凝血因子瀑布式(c a sc a de)活化，使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，网络红细胞等 形成红色血栓，这是S TEMI的形成特点，治疗方法以溶栓和经皮冠脉介入(PCI)为主”司。血小板的激活和聚集、各种血小板因子的释放是触发ACS的核心环节，故从不同水平和通路 全面强化抗血小板治疗是ACS现代治疗的基础1叫因此，抗血小板治疗已成为促进血小板 功能异常转阴，减少心脑血管不良事件的重要组成部分。抗血小板药可延长血栓性疾病患者 缩短了的血小板生存期并拮抗其聚集，有效控制其活化而阻止或延缓动脉血栓的形成，其在 动脉粥样硬化的抗栓疗法中已居重要地位，其疗效已得到国际各中心大量临床循证结果的肯 定。目前在临床上常用的抗血小板药物是阿司匹林和氯毗格雷。20世纪八九十年代的一系列 临床研究证实，对于不稳定心绞痛病人，使用阿司匹林可以显著降低50%-72%的病死率及心 肌梗死发生率，但随后人们提出了阿司匹林抵抗。为了临床的需要，S a n。行公司开发了氯毗 格雷，在1997年被美国食品药物管理局(FDA)批准用于治疗心肌梗死、脑卒中、血管性疾 病等。CAPRIE(Clo pi do gr el ver sus Aspi r i n i n Pa t i en t s a t Ri sk o f Isc h a emi c Even t s,氯毗格雷 与阿司匹林预防缺血事件比较研究试验)显示，氯毗格雷比阿司匹林更能显著的降低这些事 件的发生率，该试验还提示氯毗格雷组可降低一级终点的发生率。氯毗格雷组的总风险降低 率降低了 8.7%。此试验提示氯毗格雷比阿司匹林具有更好的抑制血小板的效应，同时表明氯 毗格雷能够使不良反应事件的危险性大大降低。4沈阳药科大学硕I学位论文第一章结论1.2 氯喷格雷的药理作用氯毗格雷属睡吩毗咤类衍生物，是新一代的血小板聚集抑制剂，本身不具有抗血小板活 性，它需经过肝脏酶系统细胞色素P450（CYP）氧化才能成为有活性的抗血小板物质，其活 性代谢产物可拮抗ADP所致的血小板聚集闾。其发挥作用的血浆药物浓度高峰水平约需0.7-1 h达到生物作用度50%o氯毗格雷为时间和剂量依赖型药物，血小板聚集抑制平台效应为 50-60%。如果没有负荷剂量（300 mg/d）用药，约需5 d才能达到最大的血小板抑制效应。其作用机制在于与血小板的ADP受体结合，选择性抑制ADP受体进而使ADP介导的血小板 表面糖蛋白GPlIb/IlIa复合物的活化受阻，从而抑制血小板的聚集。此外，氯毗格雷还可阻 断血小板激活后的级联放大反应，抑制非ADP激活剂诱导的血小板聚集。氯毗格雷的血小板 抑制作用在连续给药后3-7 d达到稳态，最大抑制作用可持续3个月以上，停药5 d后血小板 凝集、出血时间逐渐回归基线。诸多研究表明，氯毗格雷是强效血栓素合成酶抑制剂，与阿司匹林的作用机制相似，能 抑制TXA2生成，同时能促进具有抑制血小板聚集和血管扩张作用的前列腺素的生成，从而 能有效抑制凝血过程，并通过打破凝血平衡使已形成的血栓溶解。早期资料提示，氯口比格雷 可通过降低炎性因子如C反应蛋白和P选择素的作用来稳定粥样斑块，减少AID急性缺血性 事件的发生，可能具有抗炎作用叫1.3 氯喷格雷的临床研究及应用氯毗格雷在CAPRIE、CURE、PCICURE CREDO这些大型临床试验中被广泛的研究。CAPRIE 试验（Clo pi do gr el ver sus Aspi r i n i n Pa t i en t s a t Ri sk o f Isc h a emi c Even t s,氯毗格雷与 阿司匹林预防缺血事件比较研究试验）和CURE试验口5（Clo pi do gr el i n Un st a b le a n gi n a t o pr even t Rec ur r en t Even t s,不稳定型心绞痛中使用氯毗格雷预防再梗塞事件研究），其研究目 的是早期和长期氯毗格雷与阿司匹林联合治疗急性冠脉综合征患者较单纯阿司匹林治疗的有 效性和安全性；PCICURE 试验”（Per c ut a n eo us Co r o n a r y In t er ven t i o n-Clo pi do gr el i n Un st a b le a n gi n a t o pr even t Rec ur r en t i sc h a emi c Even t s,经皮冠状动脉介入治疗一氯n比格雷预防不稳定性 心绞痛再缺血事件）为CURE试验的亚研究，其研究目的是研究在经皮冠状动脉介入手术之 前，除阿司匹林之外加用氯毗格雷是否较安慰剂更为有效地预防主要缺血事件的发生；CREDO 试验02（Clo pi do gr el fo r t h e Reduc t i o n o f Even t s Dur i n g Ob ser va t i o n,随访期间氯毗格 雷减少临床事件研究），其研究目的是经皮冠脉介入后早期及长期双重方式口服抗血小板治沈m药科大学硕卜学位论文 第一章堵论疗。而在临床应用中，主要有以下几个方面。1.3.1 抗栓治疗基础研究表明“刃，缺血性脑血管病（ICVD）与血小板功能异常密切相关。而血小板的活 性和聚集在其发生和发展以及斑块破裂后的血栓形成过程中起重要作用。抗血小板治疗可抑 制血小板功能，从而缩小梗死体积和预防复发性卒中。S a n o ssi a n将260例患者根据发病前服用和未服用抗血小板药物分为两组，抗血小板治疗 组92例和非抗血小板治疗组168例对比后得出结论，卒中发病前服用抗血小板药物,能降低 无卒中发生率或短暂性脑缺血发作患者的缺血性卒中严重程度，而无论发病前是否有脑血管 事件，却能增加出院转归良好的可能性。一般单剂量口服75 mgd-1,即可抑制血小板聚集,达到稳定的抗栓活性。随着剂量增大，出现出血时间的稳定延长。氯毗格雷治疗近期缺血性 卒中和短暂性脑缺血发作（TIA）高危患者的动脉粥样硬化性血栓形成（AT）研究中，将7599 例近期卒中或TIA患者随机分为氯毗格雷75mg-d/；氯毗格雷75 mgdi+阿司匹林75 mgdl 两组通过18随访，氯毗格雷组发生颅内出血25例，联合治疗组发生40例，两组致死性出血 风险发生率有显著差异。1.3.2 预防不良心脏事件（MACE）氯毗格雷治疗可显著减轻动脉炎症反应，抑制动脉粥样硬化的进展，进而改善急性冠脉 综合症的预后。陈玉国等“4】作了临床对比观察，A组58例单用阿司匹林，B组57例氯毗格雷+阿司匹林，用药30d后，MACE两组有显著差异（PV0.05）,病人血清高敏C反应蛋白（h s-CRP）和肿 瘤坏死因子a（TNF-a）浓度B组较A组下降更为显著（P 0.05）,心绞痛发作B组明显低 于A组（P25 mL100.04S t a n da r d so lut i o n 70.25 mL-10 mL25.03S t a n da r d so lut i o n 51.0 mL)TOmL10.02(QC1)S t a n da r d so lut i o n 51.25 mL-25 mL5.01S t a n da r d so lut i o n 50.2 mL-10 mL2.02.3.2 氯雷他定内标溶液的配置精密称取氯雷他定10.0 mg,置于10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配成 浓度为1000 Ng-mL”的储备液I；取0.25 mL储备液I,置于100 mL量瓶中，用甲醇稀释并 定容至刻度，获得浓度为2.5 NgmL的储备液II。取2.0mL储备液IL置于50 mL量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，获得浓度为100n g-mL的内标溶液，于4冰箱内保存备用。2.3.3 CRGA标准溶液的配置精密称取标准品3.73 1118（相当于61仄4.0011）,置于100mL量瓶中，用甲醇 溶解并稀释至刻度，摇匀，配成浓度为40 RgmL“的CRCA标准溶液7。以甲醇稀释标准溶液7,配制CRCA标准系列溶液，过程如表2-2所示，于4 冰箱内保 存备用。13沈阳药科大学顽卜学位论文第二章 第叱格工及其活性粉酸代谢物CRCA）的体内分析方法研究Ta b le 2-2 Pr epa r a t i o n o f CRCA st a n da r d so lut i o n set sS t a n da r d so lut i o n set sPr epa r a t i o nCo n c en t r a t i o n(gg r n L1)7S t a n da r d so lut i o n 7-40.06(QC3)S t a n da r d so lut i o n 7 7.5 mL-10 mL30.05S t a n da r d so lut i o n 7 5.0 mL*10 mL20.04(QC2)S t a n da r d so lut i o n 7 2.5 mL一 10 mL10.03S t a n da r d so lut i o n 4 5.0 mL-*10 mL5.02(QC1)S t a n da r d so lut i o n 3 5.0 mL10 mL2.51S t a n da r d so lut i o n 2 2.0 mL10 mL1.02.3.4 盐酸嘎氯匹定内标溶液的配置精密称取盐酸睡氯匹碇28.5 mg,置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配成浓度为2.5 mgmL”的储备液。取储备液250 rL,置于25 mL量瓶中，用甲醇稀释并定 容至刻度，摇匀，获得浓度为125 RgmL”的内标溶液，于4。冰箱内保存备用。2.4生物样品处理依据不同的分析目的，生物样品采取不同的处理方法。2.4.1 氯哦格雷血浆样品处理取血浆样品100 pL,分别加入内标溶液（100 n g mL氯雷他定）50 pL和IM Na OH溶 液100 rL,乙酸：正己烷（4:1）提取溶剂3 mL,涡流混合1 mi n,振荡10 mi n,离心5 mi n（3500 r pm）,分取上清液于另一个试管中，于常温下吹干，残留物加入200 rL流动相溶解，涡流混合，取20城 进行LC-MS/MS分析。2.4.2 CRCA血浆样品处理取血浆样品500 gL,加入内标溶液100叱 和300 mM的 KH2PO4 200 rL,涡流混合30 s,加入乙酸乙酯：二氯甲烷（80:20）的提取液2.5 mL,涡流混合5 mi n,4000 r pm离心10 mi n,14沈阳药科大学硕卜学位论文第二章 案:喉格雷及其让活性酸酸代谢物CRCA）的体内分析方法研究分取上清液另一试管中，加入1 mL饱和Na 2s。4溶液，涡流混合3 mi n,4000 r pm离心5 mi n,取上清液2 mL,于40。氮气流下吹干，残留物加入100 rL流动相溶解，涡流混合，进样25HL进行HPLC分析。2.5分析方法确证依据生物样品分析的有关国家规范卬-34，进行如下方法学的确证。2.5.1 方法专属性2.5.1.1 氯毗格雷分析方法的专属性氯唯格雷和内标氯雷他定在ES I电离方式下，主要生成M+H准分子离子，分别为m/z 322和*383。选择性对氯毗格雷和氯雷他定M+H进行产物离子扫描分析，氯口比格雷主 要生成m/z 212的碎片离子，氯雷他定主要生成m/z 267的碎片离子（见图2-1和图22）,分 别将m/z212和m/z 267作为定量分析时监测氯毗格雷和氯雷他定的产物离子。01#25-90 RT:0.22-0.61 AV:8 NL:1.24E7F:+c Full ms2 322.00(-20.00 50.00-400.00100q211.97SZBPUnqv aAUBox184.01152.00155-02 魁99,.一 1321.96209.38 233.60 261.90 305.18 352.84 389.24Fi g.2-1 Full-sc a n po si t i ve i o n ACPI pr o duc t i o n ma ss spec t r a o f c lo pi do gr el沈阳药科大学硕上学位论文第二章 氯喉格福及其能活性痰酸代谢物rCRCA）的体内分析方法研究lvlei-full_071125 123527 p 100-)05 RT.0.57-0.59 AV.3 NL.2.74E5F:+c Full ms2 383.00-30.00|50.00-400.00266.92O-二二O-二-O-二二O-二二O-二二O-二二O-二二O-二二O-二二O-二二O-09876543211-pirnqv aAPBS336.80258,93280.86382.7457,96M 八 n，T50160.9588,36 133.02 150j03|z，TrrrprrrF，T，个“M，+4+，T100 150186.64 228.01189.28 200250293.94311.23339.31t|372.90 395.27/;p*nTp-rrrirr|j(i n(i in(i rn .*rrr|m v 300 350 400m/zFi g.2-2 Full-sc a n po si t i ve i o n ACPI pr o duc t i o n ma ss spec t r a o f lo r a t a di n e(IS)分别取6只比格犬的空白血浆100 ML,除不加内标溶液外，其余按“血浆样品的处理”项 下操作，得色谱图2-3；将一定浓度的氯毗格雷标准溶液和内标溶液加入空白血浆中，同法操 作，得色谱图24,氯口比格雷的保留时间为5.28 mi n,内标氯雷他定的保留时间为4.81 mi n；取比格犬口服给药后的血浆样品，同法操作，得色谱图25。结果表明，在选定的检测条件下,氯毗格雷和内标氯雷他定分离效果良好，空白血浆中的内源性物质不干扰氯口比格雷和内标氯 雷他定的测定。16沈阳药科大学硕士学位论文第二章氯毗格雷及其让活性皎酸代谢物(CRCA)的体内分析方法研究gBpunqvio8RT.U.00100-211.50-212.50MS blankOlML:9.00E3TIC F+c SRM ms2 383.00-30.00NL:5.00E4 TIC F+c SRM ms2 322.00-20.00266.SO-267.50 MS blankOl0 1 2 3 4 5 6Time(min)Fi g.2-3 S RM c h r o ma t o gr a ph y fo r c lo pi do gr el a n d lo r a t a di n e fr o m a n a ly si s o f b la n k(dr ug a n d IS fr ee)b ea gle do gpla sma Qompunqv QVHTime(min)Fi g.2-4 S RM c h r o ma t o gr a ph y fo r c lo pi do gr el a n d lo r a t a di n e fr o m a n a ly si s o f zer o sa mple(dr ug 2.0 n g/mL spi kedwi t h IS 50.0 n g/mL)b ea gle do g pla smaPea k I-c lo pi do gr el,Pea k II lo r a t a di n e17沈印药科大学硕十学位论文第二章 疑暇格雷及其打活件残酸代谢物rcRCA）的体内分析方法研究RT 0.00-6.50 SM.15G 100-1wuepunqv-aouBpunql MqBoH1.15E5TIC F:+cSRM ms2383.00-30.00266 50-267.50MS 3-1-01Time(min)Fi g.2-5 S RM c h r o ma t o gr a ph y fo r c lo pi do gr el a n d lo r a t a di n e fr o m a n a ly si s o f No.3 b ea gle do g pla sma sa mplea ft er 0.5 h a dmi n i st er ed.Pea k I c lo pi do gr el,Pea k II-lo r a t a di n e2.5.1.2 CRCA分析方法的专属性取比格犬空白血浆500 pL,除不加内标溶液外，其余按“血浆样品的处理”项下操作，得 色谱图2-5-A；将一定浓度的CRCA标准溶液加入空白血浆中，除不加内标溶液外，其余按“血 浆样品的处理”项下操作，同法操作，得色谱图2-5-B,CRCA的保留时间为6.4 mi n；将一定 浓度的内标溶液加入空白血浆中，同法操作，得色谱图2-5-C,内标嚷氯匹定的保留时间为 7.9 mi n；取比格犬口服给药后的血浆样品，依同法操作，得色谱图2-5-D.结果表明，在选 定的色谱条件下，CRCA和内标璧氯匹定分离效果良好，空白血浆中的内源性物质不干扰 CRCA和内标堡氯匹定的测定。18沈阳药科大学硕士学位论文第二章定叱格甫及其疗活性废限代谢物CRCA）的体内分析方法研究0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 01234567 S 9 10 11 12 13 14 15时间Gain)时间(min)Fi g.2-5 HPLC c h r o ma t o gr a m o f CRCA a n d IS(A)dr ug a n d IS fr ee b ea gle do g pla sma;(B)pla sma spi ked wi t h dr ug;(C)pla sma spi ked wi t h IS;(D)No.2b ea gle do g pla sma sa mple a ft er 3 h o r a l a dmi n i st er edPea k 1-CRCA,Pea k 2-Ti c lo pi di n e(IS)19沈pn药科大学硕卜学位论文 第二章 氯叱格雷及其背活性酸酸代谢物CRCA）的体内分析方法研究2.5.2标准曲线与定量下限2.5.2.1 氯唯格雷标准曲线与定量下限取空白血浆100 rL,加入氯毗格雷标准系列溶液50 rL,配制成相当于氯毗格雷浓度为 2.0,5.0,10.0,25.0,100.0,400.0,1000,0 2000.0 n g-r n L1 的样品，按“血浆样品的处理”项下操作，每一浓度进行双样本分析，进样50rL,记录色谱图。以氯毗格雷浓度为横坐标，氯毗格雷与内标的峰面积比值为纵坐标，用加权（W=l/X2）最小二乘法进行回归运算，求得 的直线回归方程即为标准曲线，每天测定2条标准曲线，连续测定3天，要求相关系数尸0.99,每个计算浓度都必须与理论值的RS D在15%以内。三天方法确证的标准曲线回归方程见表2-3,标准曲线各浓度点测定结果见表2-4,第一 天方法确证的典型标准曲线见图26 标准曲线方程为A=297.3C+0.4764（尸0.99）。根据标 准曲线，氯毗格雷在浓度范围2.02000.0 n g-mL内线性良好。Ta b le 2-3 Ca li b r a t i o n c ur ve pa r a met er o f c lo pi do gr el fr o m a n a ly si s o f pla sma sa mple usi n g LC-MS/MS met h o dRunS lo pe r a t e(xlO-4)In t er c ept(x O2)Co r r ela t i o n c o effi c i en t(r2)1297.30.47650.99052329.93.99290.99043480.74.45680.992220沈阳药科大学硕士学传论文第二章策叱格雷及其酢活忸轸酸代谢物CRCA）的体内分析方法研究Clo pi do gr el c o n c en t r a t i o n i n pla sma(n g r n L-1)Run-Ta b le 2-4 Co n c en t r a t i o n o f ea c h po i n t i n c a li b r a t i o n c ur ve o f c lo pi do gr el fr o m a n a ly si s o f pla sma sa mple usi n g LC-MS/MS met h o d2.05.010.0251004001000200012.15.210.528.5106.5438.7891.61783.71.85.09.126.8100.5415.7962.41716.721.95.310328.6109.6420.6927.21756.61.95.79.225.7102.4379.0905.41863.42.04.89.424.8101.4414,1910.61773.72.05.510.425.4112.9457.2969.31790.3Mea n(n g-mL-1)2.05.29.826.6105.6420.9927.81780.7S D(n g-mL1)0.090.350.651.644.9826.3431.7248.32RS D(%)4.56.86.66.14.76.33.42.7.2WH 雷 器 dCfngmL1)Fi g.2-6 Ca li b r a t i o n c ur ve o f c lo pi do gr el fr o m a n a ly si s o f pla sma sa mple wi t h LC-MS/MS met h o d(fi r st da y o f met h o d va li da t i o n)取空白血浆100 rL,配制成氯口比格雷血浆浓度为2.0 的样品，在方法确证第三天进行6样本分析，并根据当日标准曲线计算每一样本测得浓度，要求定量下限的计算浓度与 正常值的偏差在20%以内。根据测得的数据（表2-5），求得氯毗格雷定量下限浓度的曰内精 21沈阳药科大学硕卜学位论文 笫一章 氯吐格雷及其甘活性卷酸代谢物(CRCA)的体内分柝方法研究密度(RS D)为10.0%,准确度(RE)为4.0%。结果表明所建立的LC-MS/MS法测定血浆 中氯毗格雷的定量下限可达2.0n g-mLLTa b le 2-5 Ac c ur a c y a n d pr ec i si o n o f c lo pi do gr el(2.0 n g-mL-1 i n pla sma)a n a ly zed wi t h LC-MS/MS met h o dClo pi do gr el c o n c en t r a t i o n i n pla sma(n g-mL-1)Run-