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第 46 卷 第 3 期Vol.46 No.3 2024 年 3 月Mar.2024中 国 草 地 学 报Chinese Journal of Grassland美洲狼尾草 CCD基因家族全基因组鉴定及分析王净洁，阿布都沙拉木，祝诗词，叶歆雅，范欲航，黄琳凯*（四川农业大学草业科技学院，四川 成都 610000）摘要：鉴定美洲狼尾草（Pennisetum glaucum）中的类胡萝卜素裂解双加氧酶（Carotenoid cleavage dioxygenases，CCD）基因家族成员，为美洲狼尾草中 PmCCD 基因进一步的功能研究与遗传改良提供一定的理论依据。基于美洲狼尾草已公开的全基因组数据，成功鉴定了其中的 CCD成员，并预测了该家族成员的系统进化关系，此外，分析了这些成员的蛋白理化性质、功能结构以及保守基序，并深入研究了它们的启动子顺式作用元件等，最后结合转录组数据分析了 PmCCD 基因在组织中、高温胁迫和干旱胁迫下的表达模式。共鉴定出 13个 PmCCD 基因，分布于 5条染色体上，系统进化分类为 2个大类别，共计 6个亚家族，所鉴定出的成员均具备典型的 RPE65或 PLN 型蛋白结构域，其启动子区域有与逆境胁迫、激素响应以及生长发育等生物过程密切相关的顺式作用元件。转录组数据分析表明，PMccd-1、PMcccd-6、PMccd-7、PMccd-12基因在美洲狼尾草的穗组织中具有显著的高表达，在干旱与高温胁迫下，PmCCD 基因产生了显著的表达变化，且受胁迫影响根系中的表达差异高于叶片。综上结果表明在干旱诱导时，Pmccd-12、Pmccd-6 基因分别在叶片和根系中显著表达，可作为美洲狼尾草耐旱性的候选基因，在高温诱导时，Pmccd-6 基因在叶片中显著表达，可作为美洲狼尾草耐热性的候选基因，为美洲狼尾草后续的基因工程改良提供帮助。关键词：美洲狼尾草；类胡萝卜素裂解双加氧酶；基因家族；干旱和高温胁迫中图分类号：S544.9 文献标志码：A 文章编号：1673-5021（2024）03-0011-11美洲狼尾草（Pennisetum glaucum），隶属禾本科黍亚科，狼尾草属，为一年生禾本科牧草。其根系发达，为须根系，具直立茎，叶片数较多，分蘖能力强，再生性好，生长快，生物产量高，喜温暖湿润气候，耐旱，耐盐碱性强1。美洲狼尾草原产非洲，广泛分布于热带和亚热带，是世界上第六大禾谷类作物，为干旱地区一些国家的主要粮食和高产牧草24。在我国大部分地区，美洲狼尾草均适合栽培，主要作为饲草生产，亦可做粮食作物和能源牧草，随着我国农业结构调整，对美洲狼尾草的需求日益增加，供不应求2，5。类胡萝卜素是异戊二烯类化合物，存在多个共轭双键，在植物光合作用、抗氧化、抑制癌细胞生长与增殖等方面起重要作用68。类胡萝卜素是胡萝卜素裂解双加氧酶（Carotenoid cleavage dioxygenases，CCD）的反应底物，产物中的部分去辅基类胡萝卜素具备挥发性香味特性，它们积极参与植物果实色泽、风味及香气的形成过程。910。根据发育树和基因功能，将 CCD 基因家族分为 5 个亚家族分别为 CCD1、CCD4、CCD7、CCD8 和 NCED，这 5 个亚家族成员之间序列相似性较低，基因结构差异较大，作用底物和裂解双链的位置选择都存在较大差异1112。CCD1 酶活蛋白具有独特的裂解能力，能够精准地作用于类胡萝卜素中的双键，生成一系列芳香的挥发性萜类物质，其中包括-紫罗酮1314。研究发现，CCD4 基因与花器官、果肉的着色有关，柑橘中 Cc CCD4 过量表达，诱导柑橘果皮变红，杜鹃花 CCD4的缺失，可使花瓣由黄变白1516。CCD7与 CCD8共同参与植物激素独角金内酯的合成，能裂解类胡萝卜素产生该激素的前体物质，对植物侧枝和侧根的生长有重要影响1719。NCED亚家族与植物激素脱落酸的合成有关，能调节植物生长发育，如种子萌发、叶片衰老及各种环境胁迫的响应等20。美洲狼尾草是世界范围内最优质牧草资源之一，在中国应用前景广泛。已有研究表明，CCD 家族成员在调节植物生长发育和环境胁迫响应等方面发挥重要作用，但目前有关美洲狼尾草 CCD 基因家族的研究还未见报道。本研究旨在鉴定美洲狼尾草 CCD 基因家族成员并分析其表达规律，从而为深入探究 CCD 基因家族在美洲狼尾草生长发育与DOI：10.16742/j.zgcdxb.20230120*通信作者，E-mail：收稿日期：2023-05-02；修回日期：2023-09-04基金项目：四川省饲草育种攻关项目（2021YFYZ0013）；四川饲草创新团队建设项目（SCCXTD-2020-16）作者简介：王净洁（2001-），女，四川阆中人，在读本科生，主要从事牧草育种研究，E-mail：.11中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 3 期逆境响应中的生物学作用提供帮助。1材料与方法1.1鉴定PmCCD基因家族成员及预测其蛋白性质通 过 美 洲 狼 尾 草 全 基 因 组 数 据 库 下 载（http：117.78.45.2：91/home）PI537069 的全基因组数据、蛋白质序列和注释文件。参考倪子鑫等21、杨紫贻等22的研究，从 Pfam 数据库（http：pfam.xfam.org/）下载 CCD基因的保守结构域文件 RPE65（PF03055），运用 linux系统搜索含有相应结构域的候选序列；同时，通过BLASTP数据库，以拟南芥、水稻和玉米的 CCD 家族蛋白序列对比得到美洲狼尾草CCD 家族的候选成员，设置 E vaule参数为 0.001；然后，以 CCD 为关键字在美洲狼尾草全基因组数据库（http：117.78.45.2：91/search）检索获得 CCD 基因家族的候选成员。以上三步鉴定出的 CCD 基因成员通过整合、去重复、利用 NCBI CD-search在线工具（https：www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）去除无 RPE65（PF03055）结构域的蛋白质序列，最终得到美洲狼尾草的 CCD 基因。此外，借 助 在 线 工 具 EXPASy（https：web.expasy.org/protparam/）分析美洲狼尾草 CCD家族蛋白性质。1.2构建 PmCCD基因家族系统进化树运用 MEGA7 软件，采用 ClustalW 功能将拟南芥、水稻、玉米和美洲狼尾草的CCD家族蛋白序列进行多序列比对分析，构建 CCD 基因家族系统进化树（Maximum likelihood estimation），构建方法采用最大似然法，设定 Model/Method参数为“Possion model”，Gaps/missing Data Treatment 参 数 为“Partial deletion”，为确保结果的可靠性，校验参数为 Bootstrap重复 1000次，最终生成结果文件并运用 Figtree v1.4.4软件对其进行可视化、美化处理23。1.3分析 PmCCD基因启动子元件运 用 Linux 系 统 和 PlantCARE 网 站（http：bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），检索提取并分析美洲狼尾草 CCD 家族基因上游1500bp 的启动子序列，利用 GSDS 2.0 网站制作CCD 基因家族的顺式作用元件分析图，利用 Excel软件绘制柱状图，更清晰地呈现分析统计结果24。1.4分析 PmCCD 基因家族蛋白序列结构及转录本结构首先，通过 NCBI CD-search在线工具分析并获取所有 CCD 基因的蛋白保守结构域数据。接着，通过 Linux系统，检索来自于美洲狼尾草全基因组数据库中的 PI537069gff注释文件，提取出 CCD 基因的转录本结构数据。最后，运用 Tbtools 软件对 CCD 基因家族的以上两种数据进行共建分析，以期更全面地了解 CCD基因家族的结构与功能。1.5PmCCD 基因 motif 基序分析及染色体位置定位运用MEME软件，设置nmotif参数为10，minw参数为6，maxw参数为50，对美洲狼尾草CCD基因家族的保守基序深入分析，通过 Tbtools 软件的 MAST motif Pattern 工具，对分析结果进行直观的可视化显示。并从美洲狼尾草全基因组数据库提取 PI537069的 gff文件，利用 MG2C v2.1在线工具（http：mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/）对文件中的 CCD 家族成员染色体位置信息进行可视化显示，绘制染色体位置图。1.6分析 PmCCD基因家族表达规律利用 Tbtools 软件的 Heatmap 工具，对从美洲狼尾草全基因组数据库获取的 13个 CCD 基因在不同组织和胁迫条件下的表达量数据进行对数转化、标准化及聚类分析等可视化操作，以便更深入地了解这些基因的表达模式。2结果与分析2.1PmCCD基因的筛选及理化性质的预测分析基于美洲狼尾草全基因组数据，共鉴定出 13个美洲狼尾草 CCD 基因家族成员，命名为 PMccd-1至 PMccd-13。通过 EXPAsy 预测美洲狼尾草 13 个PmCCD 成员的理化性质，如表 1所示，PmCCD蛋白的氨基酸数目在 121643 之间，蛋白质的相对分子量在 13369.1169663.71Da 之间；理论等电点的范围是 5.799.19，其中 2个蛋白为碱性，11个蛋白为酸性；不稳定指数范围为 29.7252.42，PMccd-1、PMccd-5、PMccd-6、PMccd-8 和 PMccd-10 共 5 个蛋白为稳定蛋白，不稳定指数40；脂溶系数为73.5986.49；亲水性平均值变化范围在0.433至0.085之间，CCD家族成员均为亲水蛋白。2.2美洲狼尾草 PmCCD 基因家族成员进化关系分析将美洲狼尾草的 13个 CCD 基因家族成员与拟南芥的 12个 CCD 基因家族成员、水稻的 15个 CCD基因家族成员和玉米的 23个 CCD 基因家族成员构建了系统进化树分析（图 1），通过拟南芥的分组规律 进 一 步 将 CCD 基 因 家 族 分 为 6 个 亚 家 族，即12王净洁 阿布都沙拉木 祝诗词等 美洲狼尾草 CCD基因家族全基因组鉴定及分析CCD1 亚 族（PMccd-10）、CCD2 亚 族（PMccd-4）、CCD3 亚族（PMccd-1、PMccd-6、PMccd-7、PMccd-8、PMccd-11、PMccd-12、PMccd-13）、CCD4 亚 族（PMccd-3）、NCED1 亚 族（PMccd-2、PMccd-5）和NCED2亚族（PMccd-9），其中 CCD3亚族的 PmCCD成员最多，有 7个成员，其次是 NCED1亚族，有 2个成 员。通 过 对 树 图 的 分 支 规 律 分 析,发 现 仅 有NCED1 亚族的分支中没有拟南芥的成员，在这一表 1PmCCD基因家族蛋白理化性质Table 1Physicochemical properties of PmCCD gene family proteins基因名称Gene namePMccd-1PMccd-2PMccd-3PMccd-4PMccd-5PMccd-6PMccd-7PMccd-8PMccd-9PMccd-10PMccd-11PMccd-12PMccd-13基因编号Accession numberPMA2G03470.1PMA2G05820.1PMA3G01381.1PMA3G07244.1PMA4G00818.1PMA4G04709.1PMA4G04719.1PMA7G03968.1PMA7G06518.1PMA4G01000.1PMA6G05088.1PMA6G05086.1PMA6G05090.1氨基酸数量Number of amino acids615607628643615541121531578543606565578相对分子量Molecular weight69663.7165822.8169197.6769152.4865679.2160017.6013369.1159890.1262031.4161139.0066305.5662047.5962745.21理论等电点Isoelectric point6.126.089.196.485.966.855.896.265.965.797.946.666.74不稳定指数Instability index39.6340.3348.7845.3239.7732.5352.4238.1640.6229.7248.0443.7441.46脂溶系数Aliphatic index74.8079.1476.4273.5978.2886.4978.1883.9080.2878.8084.3679.7776.30亲水性平均值Grand average of hydropathicity-0.402-0.198-0.239-0.224-0.167-0.085-0.433-0.268-0.185-0.296-0.155-0.229-0.221图 1CCD基因的系统进化发育关系Fig.1Phylogenetic relationship of CCD gene13中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 3 期亚族中的 PMccd-2 和 PMccd-5 仅与同为禾本科的水稻和玉米划为一簇，这表明美洲狼尾草中演化出了禾本科特有的 CCD 结构，也说明了 PmCCD 在美洲狼尾草的演化过程中发生了特异的变化。2.3PmCCD启动子原件的预测与分析利用在线网站 PlantCARE 对 PmCCD 家族基因上游 1500bp 的启动子序列进行分析，结果表明，除传统核心启动子元件 TATA-box、CAAT-box外，CCD 基因家族中还存在 16 种顺式作用元件，按其功能大致分为光响应元件（f1）、植物生长元件（f3、f4、f7、f8、f9、f10、f11、f12、f13、f14、f15、f16）、胁迫响应元件（f2、f5、f6、f12）。其中，植物生长元件又可分为两类，植物激素响应元件（f3、f4、f7、f9、f14）和生长发育调控元件（f8、f10、f11、f13、f15、f16）。如图 2所示，光响应元件存在于每个 PmCCD 成员的启动子序列中且占比较大，其次是植物激素响应元件，茉莉酸与脱落酸的响应位点占据了该类型的大多数，每个 PmCCD 成员中均存在脱落酸响应元件，除PMccd-7 和 PMccd-13 外每个成员都含有茉莉酸响应元件。此外，胁迫响应元件中非生物胁迫类型的元件包括干旱与低温响应，13 个 PmCCD 基因中有8个成员的启动子区域含有低温响应元件，7个成员的启动子区域含有干旱响应元件。与生长发育相关的调控元件中，分生组织调控的作用位点占到了该类型的大多数，PMccd-4、PMccd-5、PMccd-11、PMccd-12和 PMccd-13中均含有与分生组织调控相图 a：PmCCD基因启动子元件位置分布；图 b：PmCCD基因启动子元件统计。f1：光响应；f2：干旱响应；f3：茉莉酸响应；f4：脱落酸响应；f5：厌氧诱导；f6：低温响应；f7：赤霉素响应；f8：-淀粉酶；f9：生长素响应；f10：分生组织；f11：细胞周期调控；f12：防御与应激响应；f13：代谢调控；f14：水杨酸响应；f15：昼夜节律调控；f16：种子特异性。Fig.a：Location distribution of promoter elements of PmCCD Gene；Fig.b：Statistics of promoter elements of PmCCD Gene.f1：Light responsive；f2：Drought responsive；f3：MeJA responsive；f4：ABA responsive；f5：Anaerobic induction；f6：Low-temperature responsive；f7：GA responsive；f8：Alpha-amylase；f9：IAA responsive；f10：Meristem expression；f11：Cell cycle regulation；f12：Defense and stress responsive；f13：Zein metabolism regulation；f14：Salicylic acid responsive；f15：Circadian control；f16：Seed-specific regulation.图 2PmCCD基因启动子元件预测及位置分布Fig.2Prediction and location distribution of promoter elements of PmCCD gene14王净洁 阿布都沙拉木 祝诗词等 美洲狼尾草 CCD基因家族全基因组鉴定及分析关的作用元件。从分析结果来看，PmCCD含有许多与植物生长发育以及外界刺激相关的调控位点，这说明PmCCD可能参与到植物的生命活动过程中。2.4PmCCD 家族的蛋白序列结构与转录本结构分析通过分析 PmCCD 家族基因的转录本数据与蛋白结构域数据显示（图 3，图 4），CCD 家族成员含有PLN02258、PLN02491、PLN02969、RPE65、RPE superfamily 5种蛋白保守结构域，PMccd-2、PMccd-3、PMccd-5、PMccd-9、PMccd-10、PMccd-11、PMccd-13序 列 含 有 UTR 非 编 码 区，PMccd-1、PMccd-4、PMccd-6、PMccd-7、PMccd-8、PMccd-12 序列仅含有 CDS 编码区。各成员外显子和内含子的数量和基因长度差异很大，PMccd-2、PMccd-4、PMccd-5、PMccd-9 仅含有 1 个外显子，PMccd-6、PMccd-11、PMccd-12含有 5个外显子和 4个内含子，PMccd-8、PMccd-14含有12个外显子和11个内含子，PMccd-10含有的外显子数量最多，有 14个。此外不含有内含子 的 PMccd-5、PMccd-2、PMccd-9 均 属 于 NCED亚族（NCED1、NCED2）。2.5PmCCD 的蛋白保守基序分析及染色体定位的预测通过对 PmCCD 基因家族成员的蛋白保守基序分析可得出 10个保守基序，不同成员所含的保守基序种类和数量存在差异。如图 5所示，PmCCD 基因整体的基序结构相似，在不同的亚族之间有着较小图 3美洲狼尾草 CCD基因家族结构分析Fig.3Analysis of CCD gene family structure of Pennisetum glaucum图 4美洲狼尾草 CCD基因家族转录本结构Fig.4Transcript structure of CCD gene family in Pennisetum glaucum15中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 3 期的差异，在 10个 motif结构中最为保守的是 motif2和motif7，他们均出现在除PMccd-7的所有成员结构中，且在基序中排列的位置也大致相同，其次是motif1与motif4结构，分别出现在 11个 PmCCD的氨基酸序列中。通过比较同一亚族内 PmCCD 的蛋白基序规律，结果表明同一亚族的基因具有结构上的一致性和特异性，例如 CCD3 亚族中的 PMccd-6、PMccd-11、PMccd-12 结构高度一致，均具有 motif6-motif7-motif8-motif1-motif2-motif10-motif3-motif4 的 结 构，而该片段中的 motif8 也是 CCD3 亚族特有的，此外同 一 亚 族 的 PMccd-13 也 具 有 该 片 段 结 构，只 是motif7 与 motif8 之间还存在一个 motif5。在 NCED亚族（NCED1、NCED2）中同样具有这样的规律，其成员均具有高度一致的基序结构。然而不同亚族之间的差异主要体现在 CCD 类型和 NCED 类型之间的差异，同为 CCD 类型的 CCD1 亚族和 CCD2 亚族却表现出相似性，这两个家族的成员均具有 motif6-motif7-motif9-motif5-motif1-motif2-motif4结构。通过MG2C 在线工具对 PmCCD 成员的染色体位置进行可视化分析，如图6所示，PmCCD成员只分布于美洲狼尾草的Chr2、Chr3、Chr4、Chr6、Chr7染色体上，每条染色体上均有 2至 4个 PmCCD 基因的定位。其中，4 号染色体上的 PmCCD 成员数量最多（PMccd-6、PMccd-7、PMccd-5、PMccd-10），其次是 6号染色体（PMccd-11、PMccd-12、PMccd-13），且 6 号染色体的基因均属于 CCD3亚族。2.6PmCCD家族转录表达上的组织特异性分析借助 tbtools将美洲狼尾草种子、茎秆、根系、叶片、分蘖组织和穗组织的 RNA-seq 数据进行了可视化。由图7可知，PmCCD基因在不同植物组织中的表达差异较为明显，穗组织中上调表达的 PmCCD基因数量最多（PMccd-1、PMccd-6、PMccd-7、PMccd-12），其 次 是 茎 秆 组 织（PMccd-2、PMccd-5、PMccd-8、PMccd-11），而 在 美 洲 狼 尾 草 的 种 子 中 并 没 有图 5CCD基因家族成员保守基序分布及 morif结构Fig.5Conserved motif distribution and morif structure of CCD gene family members图 6PmCCD基因家族染色体定位分析Fig.6Chromosome location analysis of PmCCD gene16王净洁 阿布都沙拉木 祝诗词等 美洲狼尾草 CCD基因家族全基因组鉴定及分析PmCCD 基因的差异表达。从不同亚族之间的差异来看，CCD3亚族的 PmCCD 基因主要在美洲狼尾草的 穗 中 表 达，其 中 PMccd-1、PMccd-6、PMccd-7、PMccd-8、PMccd-12在穗组织中显著上调，而NCED1与 NCED2 中的 PMccd-2、PMccd-5、PMccd-9 主要在茎秆和叶片组织中表达。此外大部分的PmCCD基因仅在1或2个组织中有显著的差异变化，而CCD3亚族的PMccd-13在茎秆、根系和分蘖组织等3个阶段中均呈现出显著的上调。通过分析美洲狼尾草不同组织中PmCCD基因的表达差异，结果表明该家族在植物生长的不同阶段会产生差异的表达模式，这说明PmCCD可能参与到植物的生长发育周期中。2.7PmCCD 基因两种逆境胁迫下的差异化表达分析为了深入探究 PmCCD 基因家族成员在面临干旱与高温逆境胁迫下的表达模式与规律，利用干旱与高温诱导处理下的 0144 h的 RNA-seq数据来进行了详尽的分析。如图 8所示，左侧为干旱诱导下的美洲狼尾草 PmCCD在根系与叶片中的表达热图，右侧为高温诱导下美洲狼尾草 PmCCD 在根系与叶片中 的 表 达 热 图。在 干 旱 诱 导 的 叶 片 中，有 7 个PmCCD 基因产生了显著的差异变化，其中有 2个成员表达上调，2个成员表达下调，3个成员表达趋势先上调再下调，其中差异变化较为显著的是 PMccd-12，其在干旱诱导 3 h后表达量显著上调随后又逐渐下调。在干旱诱导的根系中 PmCCD 基因的表达差异更为显著，共有 10 个 PmCCD 基因的表达发生差异变化，其中有 3 个成员表达上调，1 个成员表达下调，6 个 成 员 的 表 达 趋 势 为 先 上 调 后 下 调，其 中PMccd-6在根系诱导 144 h时表达显著上调，而在叶片中其整体的表达是下调的。根据根系与叶片中干旱诱导的表达差异变化，表明叶片中上调表达的事件集中在 1、3、7 h附近，而根系中上调表达的事件集中在 24、48、96 h 附近，这可能和叶片与根系应对干旱胁迫的敏感程度差异有关。在高温诱导的叶片中同 样 存 在 PmCCD 基 因 的 差 异 表 达，其 中 有 5 个PmCCD 基因上调表达，仅有 1 个 PmCCD 基因下调表达，该基因为 PMccd-12，其在未处理时的表达量显著高于处理后的表达量，其表达量在 7 h和 48 h时进行了两次上调，在 144 h后下调至低表达量。此外在高温诱导下的叶片中具有 2 个 PmCCD 基因呈现先上调再下调的表达趋势，其上调的胁迫时间同样为7 h和48 h。在高温诱导下的根系中本研究表明不同于叶片中的表达差异，其存在更多的表达下调和图 7PmCCD基因转录表达的组织特异性Fig.7Tissue specificity of transcriptional expression of PmCCD gene17中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 3 期更少的表达上调，根据图谱显示，在高温诱导下，根系中有 2 个 PmCCD 基因表达上调，3 个 PmCCD 基因表达下调。综上，根据 PmCCD在干旱与高温诱导下的表达差异变化，本研究表明该基因家族对干旱胁迫、高温胁迫具有一定的响应，其在不同胁迫类型与不同压力时间下的表达差异明显，这说明 PmCCD基因可能参与到了美洲狼尾草应对外界环境刺激的生命过程中，并在应对压力时行使一定的作用。3讨论CCD 基因家族，具有 RPE65 结构域所编码的蛋白质氧化裂解类胡萝卜素，产生挥发性香味物质和植物激素等衍生代谢产物，对植物的风味色泽、果肉花瓣颜色和抗逆性具有重要作用2527。CCD基因在自然界各物种中分布广泛，尤其是在植物中含有大量 CCD 基因，CCD 基因首次在玉米中被分离出来，随后陆续在其他物种中被鉴定出来28。例如：拟南芥中有 9 个 CCD 家族成员29，水稻中鉴定出 11个 CCD 家族成员30；石榴中鉴定出 22个 CCD家族成员27；番茄中鉴定出 9 个 CCD 家族成员31。本研究在美洲狼尾草全基因组中鉴定到 13 个 CCD基因家族成员，与拟南芥、水稻、番茄等植物中 CCD基因成员数量相近，与石榴中 CCD 基因成员数量差异较大，这可能是因为石榴中存在 4 对基因复制事件，基因复制推动了基因家族的扩张27。在 拟 南 芥 中，将 CCD 基 因 家 族 分 为 CCD 和NCED 两个亚家族，又进一步将 CCD 亚家族分为CCD1、CCD4、CCD7、CCD8四个小组，将NCED亚家族分为 NCED2、NCED3、NCED5、NCED6、NCED9 5个小组，总共 9组32。本研究将美洲狼尾草与模式植物拟南芥、水稻和玉米进行进化树构建分析，结果表明美洲狼尾草CCD基因家族可分为CCD1、CCD2、CCD3、CCD4、NCED1、NCED2 6 个亚家族，其中NCED1 亚族的分支中没有拟南芥的成员，在这一亚族中的 PMccd-2 和 PMccd-5 仅与同为禾本科的水稻和玉米划为一簇，这表明美洲狼尾草中演化出了禾本科特有的 CCD 结构，也说明了 PmCCD 在美洲狼尾草的演化过程中发生了特异的变化。本研究共鉴定到 13个美洲狼尾草 CCD 基因家族 成 员，其 中 12 个 家 族 成 员 编 码 氨 基 酸 长 度 在600aa左右，与其他物种中 CCD 基因编码长度一致，但是值得注意的是，PMccd-7 基因编码的氨基酸长L：叶组织；R：根组织；0144 h：胁迫处理的时间。L：leaves；R：root，0144 h：time for coercion treatment.图 8PmCCD基因干旱与高温胁迫下的表达差异Fig.8Differential expression of PmCCD gene under drought and high temperature stress18王净洁 阿布都沙拉木 祝诗词等 美洲狼尾草 CCD基因家族全基因组鉴定及分析度仅为 121aa，保守基序也只有 Motif2 和 Motif10，可能是因为在遗传过程中基因序列缺失导致。不同研究发现 CCD 基因对非生物胁迫具有重要作用，Iuchi 等33研究表明豇豆 VuNCED1 基因的表达受不同环境胁迫的影响，且该基因在高盐和干旱胁迫下被强烈诱导。干旱胁迫下 ABA 的积累与VuNCED1 基因表达模式一致，且脱水条件下 ABA水平显著上升，进一步证实了干旱对 VuNCED1 基因表达的强烈诱导作用。本研究对美洲狼尾草 CCD基因启动子序列分析，发现大量响应非生物胁迫的顺式作用元件，如与干旱胁迫相关的 f2，响应厌氧胁迫的 f5，与低温胁迫相关的 f6，响应防御与应激的f12 等。对美洲狼尾草受高温胁迫下的转录水平分析发现，根系与叶片中大部分成员均上调表达，干旱胁迫下上调更为显著，表明 CCD 基因对美洲狼尾草响应非生物胁迫具有重要作用。4结论综上所述，本文深入研究美洲狼尾草 CCD 基因家族特性，鉴定 CCD 基因家族成员、蛋白结构以及这些成员在多种组织和两种胁迫下的表达，其中PMccd-12、PMccd-6基因在干旱胁迫时显著上调表达，高温诱导时，PMccd-6 基因中显著上调表达，筛选出耐旱和耐热候选基因，以期为研究美洲狼尾草CCD 基因的干旱和高温迫响应机制提供基础，为美洲狼尾草后续的基因工程改良提供一些帮助。参考文献（References）：1 陈志彤，何水林，黄毅斌.狼尾草属牧草研究进展 J.草地学报，2010，18（5）：740-748.CHEN Zhitong，HE Shuilin，HUANG Yibin.Research progress of Pennisetum rich J.Acta Agrestia Sinica，2010，18（5）：740-748.2 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