花生KNOX基因家族的全基因组鉴定及组织表达分析.pdf

山 东 农 业 科 学():./.收稿日期:基金项目:潍坊市科技发展计划项目()潍坊市鸢都学者青年专家项目财政部和农业农村部:国家现代农业产业技术体系项目()潍坊市现代种业创新发展项目()作者简介:宋晓峰()男助理研究员主要从事花生抗逆遗传育种研究:.通信作者:付春()男副研究员主要从事花生遗传育种研究:.花生 基因家族的全基因组鉴定及组织表达分析宋晓峰鲁成凯董晓娜高晓东孙熙文付春(潍坊市农业科学院山东 潍坊)摘要:为研究花生 基因家族在生长发育以及非生物胁迫响应中的功能本研究采用生物信息学手段在栽培种花生基因组水平上对 基因家族成员进行鉴定并对其理化性质、基因结构、蛋白质保守结构域、系统进化、启动子顺式作用元件以及组织与逆境下的表达模式进行分析 结果显示:花生基因组中共有 个 基因家族成员分布在 条染色体上绝大多数编码酸性蛋白均为亲水性蛋白并全部定位于细胞核 系统发育分析可将花生 家族分为 和 两个亚家族并进一步分为 个亚组 启动子分析发现一些与生长发育、激素和胁迫响应相关的顺式作用调控元件 全生育期组织表达分析结果显示 类基因表达组织特异性明显主要在花、营养茎尖、生殖茎尖、果针等组织中高表达 类基因时空表达更广泛 在 种非生物胁迫处理下部分基因表达量变化较大其中 个基因响应特定胁迫 验证了 个特异性响应 胁迫的基因 本研究为进一步探究花生 基因在生长发育、逆境响应中的功能奠定了基础关键词:花生 基因家族全基因组鉴定生物信息学分析表达分析中图分类号:.:文献标识号:文章编号:()().同源异型盒基因家族()编码一类含有同源异型盒结构域的转录调控因子 同源异形盒基因首先在果蝇突变体研究中发现并命名随后发现该基因家族在动物、植物、真菌中广泛存在 同源异型盒基因的典型特征是含有一段高度保守的 序列长度约 其编码的 个氨基酸残基在三维空间上形成一个三螺旋区结构域 根据蛋白质的结构特征通常将植物同源异形盒蛋白分为 类其中()和 属于非典型同源异型盒蛋白其同源异型盒区的螺旋和螺旋之间多 个氨基酸残基()从而组成()同源异型盒蛋白超家族 基因广泛存在于植物中其编码的蛋白质具有四个结构域分别为、和 植物中第一个 基因()在玉米中发现起控制细胞分化作用 随后在玉米、水稻、拟南芥、小麦、棉 花、豆 科 植 物 等 中 发 现 大 量 基因 研究者根据基因家族成员所编码蛋白的结构域序列相似性及表达模式 将玉米中 基因家族分为两个亚家族 和 在表达模式上类 基因亚家族成员主要在分生组织中特异性表达通过参与调节细胞分化进而影响组织器官的形态建成及控制籽粒大小类 基因亚家族成员在各组织器官中普遍表达 拟南芥中 类基 因 有 个 包 括()、()、()、()其中 对茎尖分生组织的形成以及功能维持起重要作用 能够激活细胞分裂素的合成类 基因也有 个即()、()、()、()由于突变体表型缺乏对其功能研究相对较少我国是世界上最大的花生生产国花生单产是世界花生单产的.倍 花生是我国重要的油料作物总产居油料作物之首 鉴于花生基因组庞大遗传背景相对复杂其分子生物学研究相对滞后于其他豆科植物如大豆、蒺藜苜蓿等但随着栽培种花生基因组序列信息的公布这种局面正在改变 本研究在全基因组水平上对花生 基因家族成员进行鉴定并对其序列特征、进化关系和表达模式进行系统分析以期为解析花生 基因的重要作用提供参考 材料与方法.全基因组鉴定栽培种花生(.)参考基因组、蛋白序列及注释文件来自花生数据库(:/./)拟南芥(.)基因家族成员数据下载自 网站(:/./)以拟南芥的 条 蛋白序列(、)为种子序列利用 .软件的 命令()在全基因组水平检索花生蛋白数据库中候选 蛋白成员并删除冗余序列 为保证候选成员的真实性利用 和 在线工具进一步鉴定去除不包含结构域的序列利用 网站预测每个 成员的蛋白理化性质具体包括氨基酸()数、分子量、等电点和亲水性并在 网站上利用 .工具预测其亚细胞定位.基因结构与染色体定位分析利用 .的 ()工具对花生 家族成员进行基因结构分析 /山 东 农 业 科 学 第 卷工具进行染色体定位分析.基因家族成员蛋白保守基序与结构域分析利用 工具对花生 成员的保守基序进行在线预测设置基序数目为 其他参数为默认值蛋白保守基序和 预测的结构域利用 .的 ()工具绘制.基因家族成员系统发育分析利用软件 的“”程序对花生与拟南芥的 基因家族成员进行多重序列比对参数选择默认 并选择邻接法()构建系统发育树相关参数设置如下:计算距离的替代模型()选择泊松校验()次导出.文件利用 .软件进行美化并参考拟南芥 基因家族的分类系统划分亚家族和亚组.启动子顺式作用元件分析根据花生基因组数据提取 基因转录起始位点上游 的序列作为启动子区并递交至 数据库检索并筛选潜在的顺式作用元件并利用 .的 工具进行可视化.全生育期及非生物胁迫下表达模式分析从 下载花生 种不同组织的 数据()分析 基因的时空表达模式 基于非生物胁迫处理下的 数据()分析 基因逆境胁迫下的表达模式 具体处理如下:分别用 、/、/茉莉酸甲酯()、高温()以及低温()处理幼苗 数据通过、和 分析得到 值 将 值转化为()使用.制作表达谱的热图.在模拟干旱胁迫下的 验证根据转录组数据分析筛选 个显著响应 胁迫的 基因进行 分析 以潍花 号为试验对象 年 月 日催芽 月 日定植于水培盒利用 溶液在人工气候箱(上海一恒)中培养 月 日发育 至 三 叶 期 时 开 始 处 理 用 (/)做胁迫处理处理 后换回 营养液复水培养 对照组用不含 的 溶液培养 分别于处理、采集根液氮速冻后用于总 的提取 利用 试剂盒()提取 用 反转录试剂盒()获得 分析采用 ()在 平台上进行以 为内参基因利用 的 进行引物设计(表)每个样品 次重复 表 引物信息目的基因正向引物()反向引物()片段长度/.结果与分析.全基因组鉴定经过比对搜索在花生基因组数据库中共鉴定到 个 基因(表)理化性质预测结果显示 基因编码的氨基酸长度差异较大最短为 (.)最长为 (.)分子量对应为最小 .、最大 .除.编码的蛋白质等电点达到.外其余 蛋白等电点均低于 为酸性蛋白 所有编码的蛋白均为亲水性蛋白亚细胞预测分析表明所有编码蛋白均定位于细胞核符合转录因子细胞核定位的特征.基因结构与染色体定位分析对 在染色体上的具体分布进行可视化分析结果显示除、号染色体外 在其余 条染色体上均有分布(图)基因结构分析发现各成员基因含有的外显子数目范围为 个其中.的外显子最少为 个.含有的外显子最多达到 个(图)第 期 宋晓峰等:花生 基因家族的全基因组鉴定及组织表达分析 表 花生基因家族信息基因号染色体染色体位置氨基酸长度/分子量/理论等电点脂溶指数亲水指数亚细胞定位.图 花生基因在染色体上的分布及基因结构山 东 农 业 科 学 第 卷.系统进化分析利用拟南芥、花生的 氨基酸序列构建进化树 基因家族蛋白可以分为 和 两个亚家族每个亚家族又可分为 和 两个亚组(图)其中 个花生 蛋白与拟南芥、归为 组 个花生 蛋白与拟南芥、归为 组 个花生 蛋白与拟南芥 归为 组 个花生 蛋白与拟南芥、归为 组 所有花生 蛋白进化树末端的分支均有 个成员且一个来自染色体(四倍体 基因组)另一个来自染色体(四倍体 基因组)两者为直系同源基因关系图 花生与拟南芥 基因家族系统进化分析.基因家族成员蛋白保守基序与结构域分析利用 在线工具对 进行保守基序分析结果显示除.外其他 蛋白家族成员都含有 除.、.外其他 蛋白家族成员都含有、只在 亚家族中存在 只在 亚家族中存在 这可能说明不同分支的 基因在花生中发挥不同功能利用 工具检测保守结构域结果显示 条花生 蛋白有 条同时具有 个典型的结构域即、和 有 条具有 个结构域其中.、.、.、.缺少 结构域.缺少 结构域仅.只含有 和 两个结构域(图)第 期 宋晓峰等:花生 基因家族的全基因组鉴定及组织表达分析图 花生 基因家族成员蛋白保守基序与结构域.启动子顺式作用元件分析为了更好地研究 表达调控机制提取 家族成员上游 的基因组序列并预测可能的顺式作用元件 结果显示各成员的启动子区域均含有大量的顺式作用元件而且数量与种类存在明显差异(图)条 基因共预测到 种元件主要涉及植物生长发育及光、胁迫、激素响应四大类 其中光响应相关元件最多包含 、等 种其次为植物生长发育相关元件包括种子特异性元件()、胚乳表达元件()、(玉米醇溶蛋白代谢调节元件)、分生组织表达元件()等 种元件说明 基因广泛参与植物生长发育调控 激素响应相关元件包括脱落酸响应()、茉莉酸甲酯响应(、)、水杨酸响山 东 农 业 科 学 第 卷应()、生长素响应(、)、赤霉素响应(、)等 种元件 逆境胁迫相关元件包括(厌氧诱导)、(防御与胁迫压力)、(干旱诱导)、(低温响应)、(缺氧诱导)和(创伤响应)种元件推测部分 基因参与逆境胁迫响应图 花生启动子顺式作用元件分析.全生育期及非生物胁迫下表达模式分析利用 个花生组织转录组测序数据构建了 个 基因的 值热图如图 所示而.未检测到表达 与玉米研究成果相似 基因的表达模式与其蛋 第 期 宋晓峰等:花生 基因家族的全基因组鉴定及组织表达分析白质进化分类呈现出较强一致性 类基因主要在茎尖、果针等组织特异性高表达 同一个基因在营养茎尖、生殖茎尖表达丰度趋于一致入土前果针、入土后果针表达丰度趋于一致但.、.、.、.在茎尖、果针表达丰度差异较大推测这 个基因在花生果针与茎尖分生组织的形成以及功能维持上出现了 功 能 分 化.、.在花器官中表达丰度较高.、.、.、.在花生荚果发育初期表达丰度较高 类基因在不同组织及发育时期均有表达为探究不同非生物胁迫处理下 基因的表达模式利用、(模拟干旱)、低温、高温、过氧化氢、茉莉酸甲酯处理下花生幼苗期叶片和根组织转录组测序数据 采用 构建相对表达量的热图 结果显示部分基因受非生物胁迫影响表达量较对照变化较大(图)其中一些基因参与特定胁迫下的应答如.在盐和低温胁迫下的根中表达大幅上调.、.在干旱胁迫下的根中表达大幅上调.在 处理下的根中表达大幅上调.在高温胁迫下的根中表达大幅下调推测部分 基因参与花生抗逆响应:花生 基因在 个组织中的表达热图:种胁迫处理下花生幼苗 基因表达热图其中 指低温 指高温指过氧化氢处理 指盐胁迫 指 模拟干旱处理 指脱落酸处理 指茉莉酸甲酯处理图 花生基因表达热图山 东 农 业 科 学 第 卷.处理下表达分析基于转录组数据筛选得到两个能够特异性响应 处理的 基因(.和.)为探究其具体响应规律用的 处理 后复水 通过 分析其表达模式 结果(图)显示.和.均特异性响应 胁迫但响应模式不同.随着处理时间的延长表达量呈逐渐降低趋势复水 能够恢复到正常水平.的表达在处理 后下调处理 上调至.倍处理 表达量又下降但仍显著高于对照复水 后仍显著低于正常表达水平图 .()和.()在 处理下的表达分析 讨论与结论基因家族作为一类转录因子广泛参与植物生长发育调控 随着高通量测序技术的发展 转录因子家族已在多种植物中鉴定出来但目前尚未见对花生 基因的研究报道本研究第一次在花生全基因组水平上对 基因家族进行了鉴定并对其基因结构、蛋白质保守结构域、系统进化、基因表达模式进行分析可为进一步研究 基因的功能奠定基础本研究共鉴定出 个花生 基因家族成员数量与同为豆科植物的大豆(个)相近、远多于模式植物拟南芥(个)扩充了的 基因家族可以满足花生特有器官发育、复杂环境适应等其他功能的细化需求 对花生 蛋白保守结构域分析发现除 个 蛋白外其余 蛋白均含有 个典型结构域.仅含有 结构域和 结构域.缺少 结构域但两者在果针入土前后有较高的表达 果针为花生属特异性组织器官推测这两个基因在果针发育中发挥一定的功能具体机制有待进一步研究 在花生 个组织中的表达丰度分析显示 类基因主要在茎尖、果针等组织中表达其中 个与拟南芥 基因直系同源的基因在茎尖和果针处表达丰度差异较大 拟南芥中 在茎尖分生组织的形成以及功能维持中发挥作用进一步研究这 个 基因在花生茎、果针发育过程中的功能分化将有助于理解花生果针发育的特殊性植物 基因不仅调控生长发育还可以响应不同非生物胁迫 本研究对 家族成员的启动子顺式作用元件进行分析发现 基因除了有保守的光响应元件外还包含多种不同的逆境胁迫相关元件推测该家族基因在花生响应植物逆境胁迫中存在功能分化 利用 种非生物胁迫处理的花生转录组数据对 基因家族表达模式进行进一步分析发现有 个基因参与某特定胁迫下的应答如.和.特异性响应干旱胁迫 验证结果显示这两个基因在 处理及复水后表达均发生显著变化 这些基因在花生应对干旱胁迫中的具体作用有待进一步研究参 考 文 献:.第 期 宋晓峰等:花生 基因家族的全基因组鉴定及组织表达分析 .():.():.():.史晓渊王天琦刘紫雯等.基因生物学功能研究进展.山东农业科学():.():.():.赵亚平董玉惠周淑梅等.大蒜 基因的克隆及生物信息学分析.山东农业科学():.():.:.():.():.():.王纪良姬祥卓金兵兵等.玉米 基因家族鉴定及表达分析.分子植物育种():.():.宋宁宁梁慧慧安义伟等.小麦 基因家族鉴定与生物信息学分析.分子植物育种():.孙润润王园园郭新磊等.亚洲棉全基因组 基因家族鉴定及组织表达分析.中国棉花():.():.():.():.():.():.李春苑阮美煜贾海燕等.同源异型盒基因类 的表达调控及在植物形态建成中的作用.中国细胞生物学学报():.李东霞宋妍郑玉彩等.同源异形盒基因 调控植物器官形态建成的研究进展.植物生理学报():.王贺.基因调控小麦籽粒大小和株型的机理研究.泰安:山东农业大学.():.张怡王兆华.中国花生生产布局变化分析.农业技术经济():.:.():.:.():.:.李方正杨素欣吴春霞等.大豆 基因家族的结构和表达分析.植物学报():.赵长江宋巨奇都梦翔等.玉米 基因家族鉴定及组织和逆境表达分析.西北植物学报():.古丰玮.水稻 蛋白 在稻瘟病抗性与生长发育中的初步研究.广州:华南农业大学.山 东 农 业 科 学 第 卷