茶树4CL基因家族的全基因组鉴定及表达分析.pdf

西北植物学报,2 0 2 3,4 3(9):1 4 5 9-1 4 6 9A c t a B o t.B o r e a l.-O c c i d e n t.S i n.d o i:1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 0-4 0 2 5.2 0 2 3.0 9.1 4 5 9 h t t p:/x b z w x b.a l l j o u r n a l.n e t收稿日期:2 0 2 3-0 4-0 6;修改稿收到日期:2 0 2 3-0 7-0 5基金项目:安溪茶叶重大科技创新专项(A X 2 0 2 1 0 0 1);福建农林大学茶产业链科技创新与服务体系建设项目(K 1 5 2 0 0 0 5 A 0 1);福建张天福茶叶发展基金会科技创新基金项目(F J Z T F 0 1)作者简介:任卫威(1 9 9 7-),男,硕士研究生,主要从事茶树栽培育种与生物技术研究。E-m a i l:2 2 6 9 3 6 4 0 1 7q q.c o m*通信作者:叶乃兴,教授,主要从事茶树栽培育种与茶叶品质化学研究。E-m a i l:y n x t e a 1 2 6.c o m茶树4 C L基因家族的全基因组鉴定及表达分析任卫威,高 婷,邵淑贤,侯炳豪,廖献盛,叶乃兴*(福建农林大学 园艺学院/茶学福建省高校重点实验室,福州 3 5 0 0 0 2)摘 要:4-香豆酸辅酶A连接酶(4 C L)是茶树苯丙烷代谢途径的核心酶,是类黄酮和木质素生物合成的关键酶,对茶树抗胁迫及茶叶品质形成有重要作用。研究通过生物信息学分析,从 黄棪 和 铁观音 茶树中分别鉴定出8个和9个4 C L基因家族成员,命名为HD-C s 4 C L 18和T G Y-C s 4 C L 19。系统发育分析将其分为A和B两组,A组中第亚家族的HD-C s 4 C L 3、HD-C s 4 C L 7、T G Y-C s 4 C L 2和第亚家族的HD-C s 4 C L 2、T G Y-C s 4 C L 5可能分别参与木质素和类黄酮合成。启动子顺式元件分析表明4 C L基因中存在大量与植物发育、激素和胁迫响应相关的顺式作用元件。不同组织转录组数据分析表明,C s 4 C L基因在茶树特定发育时期具有重要作用。实时荧光定量检测 表明,HD-C s 4 C L 6和HD-C s 4 C L 8在G A、M e J A、A B A、低 温和 干旱 处 理 下 表 达 量 均 显 著 上 调;HD-C s 4 C L 7在A B A处理和干旱处理下表达量上调,HD-C s 4 C L 2和HD-C s 4 C L 3在A B A处理下表达量上调。研究为进一步探究茶树4 C L基因家族参与响应多种环境的生物学机制提供参考。关键词:茶树;黄棪;铁观音;4 C L;胁迫;表达分析中图分类号:Q 9 4 3.2;S 5 7 1.1文献标志码:AG e n o m e-w i d e I d e n t i f i c a t i o n a n d E x p r e s s i o n A n a l y s i s o f 4 C L G e n e F a m i l y i n C a m e l l i a s i n e n s i sR E N W e i w e i,GAO T i n g,S HAO S h u x i a n,HOU B i n g h a o,L I AO X i a n s h e n g,Y E N a i x i n g*(C o l l e g e o f H o r t i c u l t u r e,F u j i a n A g r i c u l t u r e a n d F o r e s t r y U n i v e r s i t y/K e y L a b o r a t o r y o f T e a S c i e n c e a t U n i v e r s i t i e s i n F u j i a n,F u z h o u 3 5 0 0 0 2,C h i n a)A b s t r a c t:4-C o u m a r i c a c i d c o A l i g a s e(4 C L)i s t h e c o r e e n z y m e i n t h e p h e n y l p r o p a n e m e t a b o l i c p a t h w a y o f t e a t r e e,t h e k e y e n z y m e i n t h e b i o s y n t h e s i s o f f l a v o n o i d s a n d l i g n i n,a n d p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e r e-s i s t a n c e t o s t r e s s a n d t h e f o r m a t i o n o f t e a q u a l i t y.I n t h i s s t u d y,t h r o u g h b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s,8 a n d 9 4 C L g e n e f a m i l y m e m b e r s w e r e i d e n t i f i e d f r o m t h e C.s i n e n s i s H u a n g d a n a n d C.s i n e n s i s T i e-g u a n y i n,w h i c h w e r e n a m e d HD-C s 4 C L 1-8 a n d T G Y-C s 4 C L 1-9,r e s p e c t i v e l y.P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s c l a s s i f i e d t h e m i n t o t w o g r o u p s A a n d B.HD-C s 4 C L 3,HD-C s 4 C L 7,T G Y-C s 4 C L 2 o f s u b f a m i l y a n d HD-C s 4 C L 2,T G Y-C s 4 C L 5 o f s u b f a m i l y i n g r o u p A m a y b e i n v o l v e d i n l i g n i n a n d f l a v o n o i d s y n t h e s i s,r e-s p e c t i v e l y.A l a r g e n u m b e r o f c i s-a c t i n g e l e m e n t s r e l a t e d t o p l a n t d e v e l o p m e n t,h o r m o n e,a n d s t r e s s r e-s p o n s e w e r e f o u n d i n 4 C L g e n e s.A n a l y s i s o f t r a n s c r i p t o m e d a t a f r o m d i f f e r e n t t i s s u e s s h o w e d t h a t C s 4 C L g e n e s p l a y e d a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e s p e c i f i c d e v e l o p m e n t s t a g e o f t e a t r e e.R e a l-t i m e f l u o r e s c e n c e q u a n t i-t a t i v e d e t e c t i o n s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o n s o f HD-C s 4 C L 6 a n d HD-C s 4 C L 8 w e r e s i g n i f i c a n t l y u p-r e g u-l a t e d u n d e r GA,M e J A,A B A,4,a n d d r o u g h t t r e a t m e n t s.T h e e x p r e s s i o n o f HD-C s 4 C L 7 w a s u p-r e g-u l a t e d u n d e r A B A a n d d r o u g h t t r e a t m e n t s.T h e e x p r e s s i o n s o f HD-C s 4 C L 2 a n d HD-C s 4 C L 3 w e r e u p-r e g u l a t e d u n d e r A B A t r e a t m e n t.T h i s s t u d y p r o v i d e s a r e f e r e n c e f o r f u r t h e r e x p l o r i n g t h e b i o l o g i c a l m e c h-a n i s m o f t e a 4 C L g e n e f a m i l y i n v o l v e d i n r e s p o n d i n g t o v a r i o u s e n v i r o n m e n t s.K e y w o r d s:C a m e l l i a s i n e n s i s;H u a n g d a n;T i e-g u a n y i n;4 C L;s t r e s s;e x p r e s s i o n a n a l y s i s 茶树C a m e l l i a s i n e n s i s(L.)O.K u n t z e 是中国重要的叶用经济作物1,4-香豆酸辅酶A连接酶(4-c o u m a r a t e c o e n z y m e A l i g a s e,4 C L)是植物苯丙烷代谢途径中,类黄酮生物合成的第一步,同时也是木质素生物合成特异途径的关键酶2。p f a m数据库显示,它有AMP结合酶(P F 0 0 5 0 1)和AMP结合酶C端结构域(P F 1 3 1 9 3)2个保守域。此外,4 C L还存在2个高度保守的序列,分别是B O X(S S-G T T G L P K GV)和B O X(G E I C I R G),负责识别、结合和 催 化 反 应 底 物 形 成 相 应 的 辅 酶A3。对4 C L的研究从2 0世纪7 0年代初开始,近3 0年来植物4 C L基因已经被从水稻4、拟南芥5、烟草6、大豆7、杨树8、覆盆子9、桑树1 0、黑麦草1 0等4 0多种植物中相继克隆出来1 2。有研究表明拟南芥中A t 4 C L 1、A t 4 C L 2、A t 4 C L 4参与了木质素的合成5,A t 4 C L 3和水稻中的O s 4 C L 2参与了类黄酮的生物合成。类黄酮化合物是茶树重要的次生代谢产物,与茶叶品质形成密切相关1 4。朱晨1 5研究表明类黄酮与乌龙茶滋味密切相关,是茶叶苦涩味形成的主要原因;邵淑贤等1 6研究发现类黄酮含量较低是黄观音滋味醇和的重要原因;此外,类黄酮对提高植物胁迫的抗性具有重要作用;在茶树中,类黄酮具有清除自由基1 4、逆境胁迫响应1 7等作用。茶树品种 黄棪(C.s i n e n s i s H u a n g d a n)和 铁观音(C.s i n e n s i s T i e-g u a n y i n)原产于福建省安溪县,是乌龙茶类茶树育种的核心种质资源1 8。目前,乌龙茶品种 黄棪1 9和 铁观音2 0的单体型染色体级别基因组于2 0 2 1年5月和7月相继发布。前人已从福鼎大白茶2 1和舒茶早2 2茶树品种中克隆出4 C L基因,R a i n等研究发现C s 4 C L表达与类黄酮含量呈正相关2 3。但目前对4 C L基因参与茶树非生物胁迫响应的研究较少,因此本研究运用生物信息学,在全基因组水平上鉴定 黄棪 和 铁观音 茶树4 C L基因家族,系统分析茶树4 C L的基本结构特点及系统发育,并利用q R T-P C R技术研究茶树4 C L基因家族在GA、M e J A、A B A、低温和干旱处理下的表达模式,以期对茶树4 C L基因家族参与非生物胁迫响应的研究提供参考。1 材料和方法1.1 材料处理试验材料来源于福建农林大学教学茶场,选取长势基本一致盆栽 黄棪 茶树为试验材料。将环境温度下的茶树放入4 恒温培养箱进行模拟低温处理;将 黄棪 茶树从盆栽中拔出,根部洗净后放入1 0%P E G-6 0 0 0中模拟干旱处理。用配制好的1 0 0 m o l/L的GA、M e J A和A B A溶液进行激素喷施处理。收集5 种处理的0(对照组,C K),3,6,1 2,2 4 h后的茶树新稍顶芽下第二叶,每个处理设置3个生物学重复,用锡箔纸包裹放入液氮中固样,放入-8 0 冰箱中保存备用。1.2 茶树4 C L基因家族鉴定在p f a m(h t t p:/p f a m-l e g a c y.x f a m.o r g/)数据库中下载P F 0 0 5 0 1和P F 1 3 1 9 3的隐马可夫模型,分别从茶树 黄棪 和 铁观音 基因组数据库中下载蛋白序列,利用HMME R软件筛选出4 C L基因家族的候选序列,去除结构域不完整的基因序列,再利用S MA R AT(h t t p:/s m a r t.e m b l-h e i d e l b e r g.d e)和N C B I C C D(h t t p s:/www.n c b i.n l m.n i h.g o v/S t r u c t u r e/b w r p s b/b w r p s b.c g i)网站进行结构域验证,满足2个网站验证的为 铁观音 茶树和 黄棪茶树4 C L基因家族成员。将得到的 黄棪 和 铁观音4 C L基因家族成员序列,分别用WO L F P S O R T(h t t p s:/w o l f p s o r t.h g c.j p)网 站 和E x P A S y(h t-t p:/www.e x p a s y.o r g)网站进行亚细胞定位预测和蛋白理化性质进行分析。1.3 茶树4 C L家族成员染色体定位与系统进化树构建 利用T B t o o l s软件将基因文件中在染色体上的分布情况进行可视化处理。从N C B I蛋白数据库下载杨树、拟南芥、大豆、水稻、川桑、覆盆子及黑麦草的蛋白序列,利用M E G A 7.0软件,选择邻接法,校验值B o o t s t r a p设置设为1 0 0 0重复,构建进化树,利用c h i o p t(h t t p s:/w w w.c h i p l o t.o n l i n e)进行美化。1.4 茶树4 C L基因家族成员基因结构、保守基序分析及蛋白保守结构域分析 用 G S D S(h t t p:/g s d s.c b i.p k u.e d u.c n/)网站0641西 北 植 物 学 报 4 3卷分析茶树4 C L基因结构,将得到的茶树4 C L蛋白序 列 上 传 到MEME(h t t p:/m e m e-s u i t e.o r g/t o o l s/m e m e)预测其保守基序,利用D NAMAN软件和W e b L o g o(h t t p:/w e b l o g o.b e r k e l e y.e d u/l o-g o.c g i)网站进行多序列比对分析。1.5 茶树4 C L基因家族成员启动子顺式元件分析及组织特异性表达 用T B t o o l s提取茶树HD-C s 4 C L和T G Y-C s 4 C L基因转录起始位点上游2 0 0 0 b p序列,将得到的序列文件上传至P l a n t C A R E(h t t p:/b i o i n f o r m a t i c s.p s b.u g e n t.b e/w e b t o o l s/p l a n t c a r e/h t m l)网站预测启动子顺式元件。下载 黄棪 和 铁观音 的转录组数据,参照前人方法2 4,使用T o p H a t 2软件将转录组所有可用读数映射到茶树基因组,然后通过HT s e q软件计算HD-C s 4 C L和T G Y-C s 4 C L基因在芽、嫩叶、老叶、根和茎上的F P KM值,利用T B t o o l s软件绘制基因在茶树不同组织上的特异表达热图。1.6 实时荧光定量P C R分析根据基因组织特异性表达分析结果,选取在芽和嫩叶中高表达的基因,利用p r i m e r 3 p l u s网站上进行引物设计(表1),内参基因C s G A P DH登录号为G E 6 5 1 1 0 72 5。q R T-P C R反应在C F X 9 6 T o u c h荧光定量P C R仪上进行,反应体系参照T r a n s s t a r t T i p g r e e n q P C R s u p e r M i x试剂盒方法,反应程序为9 4 3 0 s;9 4 5 s;6 0 3 0 s;4 0个循环。使用2-CT方法计算基因相对表达量2 6,用p r i s m软件统计基因表达水平,用S P S S软件进行显著性分析(P0.0 5)。2 结果与分析2.1 茶树4 C L家族成员鉴定与蛋白理化性质分析通过 黄棪 和 铁观音 基因组数据库的比较鉴定,分别得到8条和9条4 C L基因家族成员,绘制其在1 5条染色体上的分布图(图1)。结果显示,HD-C s 4 C L在5条染色体上有分布,分别是C h r 0 2、C h r 0 4、C h r 0 7、C h r 1 3和C h r 1 5,其 中 在C h r 0 7和C h r 1 5上分布有2条基因,其余均仅有1条基因分布。T G Y-C s 4 C L 则分布在C h r 0 2、C h r 0 6、C h r 0 7、C h r 0 1 1、C h r 1 2、C h r 1 3、C h r 1 5这7条染色体上,其中在C h r 0 2和C h r 0 7上分布有2条基因,其余均仅有1条基因分布。根据 结果将上述 基因命名为HD-C s 4 C L 18和T G Y-C s 4 C L 19(表2)。表1 引物序列T a b l e 1 P r i m e r s e q u e n c e s基因名称G e n e s n a m e上游引物F o r w a r d p r i m e r(5 3)下游引物R e v e r s e p r i m e r(5 3)HD-C s 4 C L 2G C C A T T C C AAA G T C T C C T T C T GC T G C G GA C A T G G C T A G T T T GHD-C s 4 C L 3G C G G C A T AA C T AT T A C C A C A G CA T GA G T T T C G C C T T G GA T G CHD-C s 4 C L 4A C C AAAG C C G C A T C GAAA T CA C C AGA G T T T C T C C C A T T G C CHD-C s 4 C L 5G C GA T C AAAA C C C T C C C AA T T CT T T G C T T G C T C C G G T T G T T CHD-C s 4 C L 6G C T C T AA T G G T G T C T G C GAA T CG T C C AAA C A C A T GAAA C A T C G CHD-C s 4 C L 7T T C G C T C AA C T C G G T T T T G CA C AAA T G G C C C AA T C G T C A CHD-C s 4 C L 8AAAA C C A C G T C G C C T T C A T CT C A T G T GA G T GA T C T C G GA C T GC s G A P DHT T G G C A T C G T T GA G G G T C TC AG T G G GAA C A C G GAAA G CA.HD-C s 4 C L染色体定位;B.T G Y-C s 4 C L染色体定位。图1 C s 4 C L基因在茶树上的定位A.HD-C s 4 C L c h r o m o s o m e l o c a l i z a t i o n o n l i n e;B.T G Y-C s 4 C L c h r o m o s o m e l o c a l i z a t i o n o n l i n e.F i g.1 L o c a l i z a t i o n o f HD-C s 4 C L a n d T G Y-C s 4 C L g e n e s i n C a m e l l i a s i n e n s i s16419期 任卫威,等:茶树4 C L基因家族的全基因组鉴定及表达分析 茶树4 C L家族 的分子量在2 4.0 01 4 3.4 5 k D,等电点4.9 15.3 6,茶树4 C L蛋白的等电点小于7,表明该家族基因为酸性蛋白。茶树4 C L除HD-C s4C L2外均为亲水性蛋白。茶树4 C L 编码序列2 8 81 7 1 3 b p,编码氨基酸数目为5 4 25 7 8。亚细胞定位预测,有1 2个茶树4 C L家族成员定位在质膜上,3个成员定位在内质网上,细胞核和线粒体上分别定位有1个成员。可以看出,HD-C s 4 C L基因 定 位 于 线 粒 体、质 膜 和 细 胞 核 上,而T G Y-C s 4 C L基因仅定位质膜和内质网上。表2 茶树4 C L基因家族的序列特征T a b l e 2 S e q u e n c e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e C a m e l l i a s i n e n s i s 4 C L g e n e f a m i l y基因G e n e基因序列号G e n o m e I D编码序列长度C D S/b p开放阅读框长度O R F/a a分子量MW/k D等电点p I平均亲水G R AVY细胞定位S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o nHD-C s 4 C L 1HD.0 2 G 0 0 2 1 1 1 01 7 1 05 7 81 4 0.8 7 4.9 50.8 0 9质膜 P l a s m a m e m b r a n eHD-C s 4 C L 2HD.0 2 G 0 0 2 7 3 9 03 4 85 7 03 1.7 6 5.3 4-0.4 5 7线粒体 M i t o c h o n d r i o nHD-C s 4 C L 3HD.0 4 G 0 0 0 3 2 7 01 6 3 25 4 31 3 4.9 6 4.9 60.8 2 4质膜 P l a s m a m e m b r a n eHD-C s 4 C L 4HD.0 4 G 0 0 1 6 4 3 01 6 8 65 6 11 4 2.7 5 4.9 10.8 6 3质膜 P l a s m a m e m b r a n eHD-C s 4 C L 5HD.0 6 G 0 0 3 8 0 9 01 6 5 35 5 01 3 7.5 0 4.9 30.8 5 3质膜 P l a s m a m e m b r a n eHD-C s 4 C L 6HD.1 3 G 0 0 1 0 2 2 02 8 85 4 42 4.0 0 5.3 60.4 5 8细胞核 N u c l e u sHD-C s 4 C L 7HD.1 5 G 0 0 0 8 2 5 01 6 2 95 4 21 3 4.5 6 4.9 80.7 9 6质膜 P l a s m a m e m b r a n eHD-C s 4 C L 8HD.1 5 G 0 0 1 0 7 2 01 6 8 35 6 01 4 2.5 2 4.9 20.8 5 1质膜 P l a s m a m e m b r a n eT G Y-C s 4 C L 1C s T G Y 0 2 G 0 0 0 1 7 1 91 6 7 75 5 81 4 2.0 5 4.9 20.8 5 6质膜 P l a s m a m e m b r a n eT G Y-C s 4 C L 2C s T G Y 0 2 G 0 0 0 3 0 5 81 6 3 25 4 31 3 4.9 3 4.9 60.8 2 1质膜 P l a s m a m e m b r a n eT G Y-C s 4 C L 3C s T G Y 0 6 G 0 0 0 0 1 6 71 6 9 85 6 51 4 3.4 5 4.9 30.8 1 6内质网 E n d o p l a s m i c r e t i c u l u mT G Y-C s 4 C L 4C s T G Y 0 7 G 0 0 0 1 8 5 81 7 1 05 6 91 4 0.9 0 4.9 50.8 0 9质膜 P l a s m a m e m b r a n eT G Y-C s 4 C L 5C s T G Y 0 7 G 0 0 0 2 3 6 51 7 1 35 7 01 4 3.3 4 4.9 20.8 3 5内质网 E n d o p l a s m i c r e t i c u l u mT G Y-C s 4 C L 6C s T G Y 1 1 G 0 0 0 0 5 7 91 6 5 35 5 01 3 7.4 7 4.9 30.8 5 0质膜 P l a s m a m e m b r a n eT G Y-C s 4 C L 7C s T G Y 1 2 G 0 0 0 1 4 1 71 7 1 05 6 91 4 2.8 8 4.9 80.6 8 8质膜 P l a s m a m e m b r a n eT G Y-C s 4 C L 8C s T G Y 1 3 G 0 0 0 0 9 7 01 6 3 55 4 41 3 6.3 5 4.9 90.6 7 1内质网 E n d o p l a s m i c r e t i c u l u mT G Y-C s 4 C L 9C s T G Y 1 5 G 0 0 0 1 0 4 71 6 8 35 6 01 4 2.4 9 4.9 20.8 5 2质膜 P l a s m a m e m b r a n eA t.拟南芥;P t o.杨树;O s.水稻;Gm.大豆;N t.烟草;M n.桑树;R i.覆盆子;L p.黑麦草。图2 4 C L家族的系统进化树A t.A r a b i d o p s i s t h a l i a n a;P t o.P o p u l u s t o m e n t o s a C a r r i r e;O s.O r y z a s a t i v a L.;Gm.G l y c i n e m a x;N t.N i c o t i a n a;M n.M.n o t a b i l i s S c h n;R i.R u b u s i d a e u s L.;L p.L o l i u m p e r e n n e L.F i g.2 P h y l o g e n e t i c t r e e o f t h e 4 C L f a m i l y2.2 茶树4 C L家族成员系统发育与分类分析为确定茶树4 C L与其他物种4 C L基因之间的关系,选取拟南芥、水稻等植物构建系统进化树(图2)。结果显示,9种植物4 C L基因被分为A和B两组,A组中 黄棪 茶树有2个成员HD-C s 4 C L 3和HD-C s 4 C L 7、铁观音 茶树仅有1个成员T G Y-C s 4 C L 2和拟南芥A t 4 C L 1、A t 4 C L 2、A t 4 C L 4聚类,属于第亚 家族;2个 家族成员HD-C s 4 C L 2和T G Y-C s 4 C L 5与拟南芥A t 4 C L 3以及水稻O s 4 C L 2聚类,属于第亚家族;第亚家族只有单子叶植物水稻和黑麦草4 C L聚类,无茶树4 C L家族成员聚类。B组中其余茶树4 C L家族成员聚类在一起。2.3 茶树4 C L家族基因结构、保守基序与蛋白保守结构域比较 茶树4 C L基因结构图(图3)显示,除HD-C s 4 C L 2和HD-C s 4 C L 6外均含有内含子,其中HD-C s 4 C L 1基因组序列最长,超过2 2 k b,HD-C s 4 C L 2和HD-2641西 北 植 物 学 报 4 3卷C s 4 C L 6基 因 组 序 列 较 短,不 足1 k b。除HD-C s 4 C L 2(2个)、HD-C s 4 C L 6(1个)、HD-C s 4 C L 1和T G Y-C s 4 C L 4(4个)、HD-C s 4 C L 5、HD-C s 4 C L 7和T G Y-C s 4 C L 6(5个)外,其余基因 均有6个 外显子。茶树4 C L保 守 基 序 图(图4)显 示,HD-C s 4 C L 18和T G Y-C s 4 C L 19均含有m o t i f(11 3),B O X 存在于m o t i f 3中,B O X 存在于m o-t i f 5中,所有基因均含有这2个基序,m o t i f 1 6和m o t i f 2 0仅 存 在 于HD-C s 4 C L 2/3/7和T G Y-C s 4 C L 2/5;HD-C s 4 C L 2/6和T G Y-C s 4 C L 5/8含有m o t i f 1 4;m o t i f 1 6仅存在T G Y-C s 4 C L 1/3/9和HD-C s 4 C L 4中;m o t i f 1 7仅存在于HD-C s 4 C L 3/7和T G Y-C s 4 C L 2。结合系统发育分析结果,同一分支成员具有相似基序组成及排列顺序,这和系统发育分析结果一致。茶树4 C L结构域的多序列比对(图5)显示,HD-C 4 C L 2、T G Y-C s 4 C L 2、HD-C s 4 C L 3、T G Y C s 4 C L 5和HD-C s 4 C L 7这5条基因的蛋白包含保守结构域B O X(S S G T T G L P K GV)和B O X (G E I-C I R G),其他基因在B O X 和B O X 上均存在2个氨基酸突变。A.茶树4 C L家族系统进化树;B.茶树4 C L家族基因结构。图3 茶树基因家族结构A.P h y l o g e n e t i c t r e e o f t h e C a m e l l i a s i n e n s i s 4 C L f a m i l y;B.G e n e s t r u c t u r e o f C a m e l l i a s i n e n s i s 4 C L f a m i l y.F i g.3 C a m e l l i a s i n e n s i s t g e n e f a m i l y s t r u c t u r eA.茶树4 C L家族系统进化树;B.茶树4 C L蛋白保守基序。图4 茶树4 C L保守基序A.P h y l o g e n e t i c t r e e o f t h e C a m e l l i a s i n e n s i s 4 C L f a m i l y;B.C a m e l l i a s i n e n s i s 4 C L p r o t e i n c o n s e r v e s m o t i f o r d e r.F i g.4 C a m e l l i a s i n e n s i s 4 C L c o n s e r v a t i v e m o t i fA.利用D NAMAN软件对保守结构域进行对齐;B.序列保守性。图5 茶树4 C L结构域的多序列比对A.A l i g n c o n s e r v e d d o m a i n s u s i n g D NAMAN s o f t w a r e;B.S e q u e n c e c o n s e r v a t i s m.F i g.5 M u l t i s e q u e n c e a l i g n m e n t o f t h e C a m e l l i a s i n e n s i s 4 C L d o m a i n36419期 任卫威,等:茶树4 C L基因家族的全基因组鉴定及表达分析2.4 茶树4 C L家族基因启动子顺式元件分析对茶树4 C L基因家族启动子顺式元件进行分析,结果(图6)显示,参与光响应的有B o x 4(8 9个)、G-b o x(4 5个)、G T 1-m o t i f(2 7个)、GAT A-m o t i f(9个)和MR E(6个)等元件。脱落酸(A B R E,4 3个)、生长素(A u x R R-c o r e,1个;T GA-e l e m e n t,6个)、茉莉酸甲 酯(C G T C A-m o t i f/T GA C G-m o t i f,1 6个)、赤霉素(GA R E-m o t i f,4个;a s-1,1 6个;T AT C-b o x,7个)和水杨酸(T C A-e l e m e n t,1 1个)等激素响应元件。此外,还发现厌氧诱导(A R E,3 7个)、低温应答(L I R,5个)、干旱诱导(MB S,5个)、防御与应激(T C-r i c h r e p e a t s,1 0个)和机械损伤(WUN-m o t i f,1 9个)胁迫响应元件,与植物生长相关的元件有分生组织表达调控(C AT-b o x,5个)、玉米醇溶蛋白代谢调节(O 2-s i t e,5个)和胚乳表达调控(G C N 4-m o-t i f,5个)等。此外,4 C L基因中还存在大量的MY B响应元件。2.5 茶树4 C L家族基因组织特异性表达为探究茶树4 C L基因各成员在茶树不同组织中的作用,绘制出组织表达谱(图7)。如图7所示,HD-C s 4 C L 1、T G Y-C s 4 C L 4和T G Y C s 4 C L 9在 根中的表达量明显高于其他组织;HD-C s 4 C L 3、HD-C s 4 C L 7、T G Y-C s 4 C L 2和T G Y-C s 4 C L 8主要在茎中 表 达;HD-C s 4