盐胁迫下紫花苜蓿萌发期和幼苗期代谢组学分析.pdf

第 46 卷 第 2 期Vol.46 No.2 2024 年 2 月Feb.2024中 国 草 地 学 报Chinese Journal of Grassland盐胁迫下紫花苜蓿萌发期和幼苗期代谢组学分析段小兰1，朱建峰2，*，李伟1，王奎玲1，张翠萍1，*（1.青岛农业大学园林与林学院，山东 青岛 266109；2.中国林业科学研究院生态保护与修复研究所盐碱地研究中心，北京 100091）摘要：紫花苜蓿是盐碱地生物改良的优良植物材料，萌发期和幼苗期是其在盐碱地建植的关键时期，但目前对紫花苜蓿盐胁迫下萌发期和幼苗期进行代谢组学分析的研究较少。为全面深入地了解紫花苜蓿的耐盐代谢调控机制，设置 0（对照）、50、100、200、400 mmol/L NaCl胁迫，测定紫花苜蓿的出苗率、存活率、株高及根长，并利用高效液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）技术分析对照和 100 mmol/L NaCl胁迫下紫花苜蓿萌发期和幼苗期根系的代谢变化。结果表明：紫花苜蓿具有一定的耐盐性，在盐浓度100 mmol/L 时，紫花苜蓿出苗率和存活率与对照相比无显著差异。与对照相比，100 mmol/L盐胁迫下紫花苜蓿萌发期筛选出 205个差异代谢物，其中 48个差异代谢物富集到55个 KEGG 代谢通路，差异代谢物主要富集在 ABC转运蛋白、磷脂酰肌醇信号系统和氨基酸代谢等通路中，其通路中的差异代谢物肌醇和 L-酪氨酸显著上调；紫花苜蓿幼苗期筛选出 108个差异代谢物，其中 24个差异代谢物富集到37个 KEGG 代谢通路，差异代谢物主要富集在植物激素信号转导和其他次生代谢产物的生物合成等通路中，其通路中的差异代谢物吲哚-3-乙酸、L-酪氨酸和哌啶酸显著上调。关键词：盐胁迫；萌发期；幼苗期；代谢组；紫花苜蓿中图分类号：S541.1 文献标志码：A 文章编号：1673-5021（2024）02-0035-13我国盐碱地总面积约 1亿 hm2，约占全国土地面积的 1/10，其中内陆盐碱地约占 90%以上，严重制约当地的生态建设和经济发展1。盐渍土作为国家最重要的后备土地资源，其开发和利用对农业生产、经济发展和维持生态平衡等具有重要意义。生物措施改良盐碱地具有改良效果好、投入资金少、生态持续性好、对环境无副作用等优势，也被越来越多的国家和地区所采用2。紫花苜蓿（Medicago sativa）是盐碱地生物改良的优良植物，长期种植紫花苜蓿可以降低土壤中 NaCl含量，提高土壤有机质含量，改善土地盐碱化3。植物不同生长阶段耐盐性不同4，萌发期和幼苗期是植物适应盐胁迫的关键时期。针对紫花苜蓿萌发期和幼苗期耐盐机制进行研究，对耐盐品种的选育具有重要指导意义。代谢组学是研究内外因素共同影响下生物体内源代谢物种类、数量及其变化规律的一门学科。与转录组和蛋白组相比，代谢物是生物功能的最终产物，更接近生物表型，可通过研究代谢物种类和数量的变化规律，理解生物特定生理机制5。目前，代谢组学已经广泛应用在植物耐盐6、抗旱7、耐热8、耐低磷9、耐铝10等抗逆研究中，但同时对紫花苜蓿盐胁迫下萌发期和幼苗期进行代谢组学分析的研究鲜有报道，不利于对紫花苜蓿的耐盐分子机制的阐释和深入理解。为此，本研究在紫花苜蓿萌发期和幼苗期进行不同浓度盐处理，通过测定不同盐胁迫下的出苗率、存活率、株高及根长，研究盐胁迫对紫花苜蓿萌发期和幼苗期生长的影响，同时通过代谢组学分析，筛选获得紫花苜蓿萌发期和幼苗期分别响应盐胁迫的关键代谢物质和代谢途径，以期为紫花苜蓿代谢调控网络构建以及紫花苜蓿耐盐代谢机制研究提供理论参考。1材料与方法1.1试验材料与试验设计以紫花苜蓿品种中苜 1 号（Medicago sativa cv.Zhongmu No.1）为试验材料，在青岛农业大学园林与林学院温室内进行试验。挑选饱满、无病虫害、大小均匀的种子用于试验。从播种开始到幼苗出土、地上部分出现真叶，地下部分长出侧根以前的阶段为萌发期；从地上部分长出第一片真叶、地下部分出现侧根，到幼苗开始高生长的一段时期为幼苗期11。本研究中处理方式具体如下：DOI：10.16742/j.zgcdxb.20230080*通信作者，E-mail：；收稿日期：2023-03-28；修回日期：2023-07-17基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（CAFYBB2019MB008）作者简介：段小兰（1996-），女，山东乐陵人，硕士，主要从事园林植物种质资源与林木遗传育种等方面的研究，E-mail：.35中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 2 期萌发期：种子采用沟播的形式进行播种，将种子均匀撒播于草炭土蛭石=3 1（体积比）的带孔托盘（28 cm54 cm）上，每个重复 300粒种子，播种后立即浇灌对应浓度盐溶液进行盐胁迫处理，每日记录紫花苜蓿萌发出苗数量，待第 8 d 种子萌发出苗数量不再改变时进行采样和指标测定。幼苗期：种子采用点播的形式进行播种，将种子播种于草炭土 蛭石=3 1（体积比）的营养钵（9 cm9 cm）中，每个营养钵播 3 粒种子，待种子完全出苗后，去掉两株幼苗保留 1 株，播种 36 d 后，幼苗均已长出真叶、侧枝和侧根，且具备一定高度，选择长势较为一致的幼苗浇灌对应浓度盐溶液进行盐胁迫，每个重复 32株幼苗，处理 28 d后进行指标测定。试验设置 5个 NaCl处理，浓度分别为 0（对照）、50、100、200、400 mmol/L，每个处理设置 3 个平行重复。浇灌盐溶液，使培养基质在浇透（最大持水量）的条件下保持相应的盐浓度，培养容器下方垫有无孔托盘，若盐溶液渗出倒回原容器，以防止盐分流失。为避免盐冲击效应，400 mmol/L处理采用每天以 200 mmol/L递增的方式浇灌盐溶液。1.2生长指标测定萌发期计算出苗率，出苗率=出苗数/播种种子数100%。幼苗期计算存活率，存活率=胁迫后存活数量/胁迫前数量100%。将植物整株取出，垂直状态下用直尺测量植物基部至顶芽的高度记录为株高，基部到植物主根最底部的长度记为根长。1.3代谢物提取综合考虑盐胁迫下两个时期的生长情况，均选择100 mmol/L盐处理的根系进行代谢组学分析。将萌发期和幼苗期对照和100 mmol/L盐处理后紫花苜蓿整株取出，然后分别用自来水和蒸馏水冲洗根系，用吸水纸吸干水分，立即放入液氮冷冻，存入80 冰箱备用。取 100 mg 组织样品加入液氮研磨，而后加入500 L 80%甲醇水溶液，充分涡旋振荡后冰浴静置5 min，然后离心 20 min（4、15000 g），取上清并加水（质谱级）至甲醇含量为 53%，再次离心 20 min（4、15000 g），取上清为后续分析样本。数据质量控制（Quality control，QC）样本为试验样本的等体积混合样本，blank样本为 53%甲醇水溶液。1.4高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析采用赛默飞世尔科技公司的色谱仪（Vanquish UHPLC，Thermo Fisher）和 色 谱 柱（Hypesil Gold column，Thermo Fisher）进行色谱分析，柱温 40，流速 0.2 mL/min。正模式下，0.1%甲酸为流动相A，甲醇为流动相 B；负模式下，5 mmol/L 醋酸铵（pH=9.0）为流动相 A，甲醇为流动相 B。采用赛默飞世尔科技公司质谱仪（Q Exactive HF，Thermo Fisher）进行质谱分析，ESI源设置为喷雾 电 压（Spray voltage）3.5 kV，鞘 气 流 速（Sheath gas flow rate）35 psi，辅助气流速（Aux gas flow rate）10 L/min，离子传输管温度（Capillary temperature）320，离子导入射频电平（S-lens RF level）60，辅助气加热器温度（Aux gas heater temperature）350，扫描范围是 1001500 m/z。1.5数据处理生长指标采用 SPSS 25.0软件和 Excel 2016软件 对 数 据 进 行 统 计 分 析 和 作 图，利 用 One-way ANOVA进行方差分析和 Duncan氏多重比较检验。利用 CD 3.1 搜库软件对下机数据进行分析处理，从而得到代谢物鉴定和相对定量结果。通过KEGG、HMDB 和 LIPIDMaps 数据库进行代谢物注释。使用 metaX软件12进行 PCA分析和 PLS-DA13分析，获 得 代 谢 物 VIP（Variable importance in the projection）。利用 T-test 计算 P-value，并计算代谢物 在 两 组 间 的 FC（Fold change）。在 FC1.5 或FC0.667、P-value1.0 的条件下筛选差异代谢物。利用 KEGG Pathway分析盐胁迫下紫花苜蓿萌发期和幼苗期的差异代谢通路。KEGG Pathway是生物分子相互作用、反应和关系的网络路径图，可从分子水平解析生物系统功能，是生物代谢研究的重要工具1517。目前，KEGG Pathway 有 7 个一级分类，一级分类可进一步划分为二级分类，二级分类最终划分为具体的三级分类图。2结果与分析2.1盐胁迫对紫花苜蓿出苗率和存活率的影响如图 1 所示，盐浓度为 200 mmol/L 时紫花苜蓿萌发期出苗率为26.89%，并与对照差异显著；盐浓度为 400 mmol/L时出苗率为 0。盐浓度为 200 mmol/L时，紫花苜蓿幼苗期存活率为 62.50%，与对照相比差异显著（P0.05）；盐浓度为 400 mmol/L 时，存活率达到最小值 46.88%。紫花苜蓿出苗率和存活率在盐浓度为 50、100 mmol/L 时与对照相比无显著差异，说明紫花苜蓿具有一定的耐盐性。36段小兰 朱建峰 李伟等 盐胁迫下紫花苜蓿萌发期和幼苗期代谢组学分析2.2盐胁迫对紫花苜蓿株高和根长的影响如图 2所示，紫花苜蓿萌发期株高、根长均随着盐浓度的升高而降低。萌发期，盐浓度为 50 mmol/L时，株高和根长分别为 4.38 cm 和 4.74 cm，并与对照相比差异显著（P0.05）；盐浓度为 200 mmol/L 时，株高和根长达到最小值 3.12 cm 和 3.61 cm。幼苗期株高生长受到了盐胁迫的显著抑制，随着盐浓度的升高一直降低。幼苗期，盐浓度为50 mmol/L时株高为30.34 cm，并与对照相比差异显著（P0.05）；盐浓度为 400 mmol/L时株高达到最小值 21.12 cm。幼苗期A：萌发期；B：幼苗期。数据柱形标注不同小写字母表示差异显著（P0.05），下同。A：Germination stage；B：Seedling stage.Value columns with different small letters mean significant difference（P0.05）.The same as below.图 1盐胁迫对紫花苜蓿存活率和出苗率的影响Fig.1Effects of salt stress on emergence rate and survival rate of Medicago sativaA、C：萌发期；B、D：幼苗期。A，C：Germination stage；B，D：Seedling stage.图 2盐胁迫对紫花苜蓿株高、根长的影响Fig.2Effects of salt stress on plant height and root length of Medicago sativa37中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 2 期根长在各盐浓度下均未显著降低。综合分析表明，盐胁迫对紫花苜蓿幼苗期株高的抑制作用大于根长。2.3数据质控和总样本 PCA分析代谢组易受外界因素的影响发生变化，数据质量控制（QC）可以检测代谢组结果是否准确。利用代谢物相对定量值获得 QC 样本间 Pearson 相关系数，其 R2数值越接近 1，说明 QC 样本间相关性越好，表明检测过程稳定、数据可靠。本研究设置的 3个 QC 样本 Pearson 相关系数 R2均超过 0.98，表明试验代谢组数据准确。试验组各样本间的代谢差异及组内样本之间的变异度可以通过主成分分析（Principal component analysis，PCA）显示。由图 3所示，主成分 1贡献率在正、负离子模式下分别为 43.81%和 41.18%，主成分 2 贡献率在正、负离子模式下分别为 11.75%和15.53%。正、负离子模式下 QC 样本均聚在一起，表明检测过程稳定、数据质量高；萌发期（对照和胁迫处理组）与幼苗期（对照和胁迫处理组）表现出明显的分离趋势，其分离趋势较两个时期对照组和胁迫处理组间的分离趋势更为明显，说明生长时期不同造成的代谢物差异比胁迫处理引起的代谢物差异更大，且萌发期和幼苗期对照和胁迫处理组间也有分离趋势。综上所述，本研究代谢物检测过程稳定、数据准确可靠，试验样本组间存在明显分离趋势。2.4PLS-DA分析如图4所示，萌发期对照和胁迫处理组有明显的分离现象，幼苗期对照和胁迫处理组也表现出明显的分离现象，但其分离程度没有萌发期明显，表明盐胁迫下紫花苜蓿萌发期和幼苗期代谢调控均发生了改变，且紫花苜蓿不同生长时期代谢机制存在差异。对 PLS-DA 模型进行排序验证可以判别模型好坏，当 R2数值大于 Q2数值，且 Q2回归线与 Y 轴截距小于 0，则表明模型能较好地描述样本，后续可以此数据进行分析。如图 5所示，各试验样本组在正、负离子模式下建立的 PLS-DA 排序验证结果表明，R2均大于 Q2，且 Q2回归线与 Y 轴截距均小于 0，表明模型稳定可靠，能较好地描述样本。2.5差异代谢物筛选火山图直观显示差异代谢物的整体分布情况。如图 6所示，盐胁迫下萌发期处理与对照相比，共筛选出 205个差异代谢物。正离子模式下，分析出差异代谢物 141个，其中上调 86个，下调 55个；负离子模不同的数字代表不同的样本。Different numbers represent different samples.图 3正（A）和负（B）离子模式下总样本的 PCA得分Fig.3PCA score for the total sample in positive（A）and negative（B）ion modes38段小兰 朱建峰 李伟等 盐胁迫下紫花苜蓿萌发期和幼苗期代谢组学分析式下，分析出差异代谢物 64个，其中上调 18个，下调46个。盐胁迫下幼苗期处理与对照相比，共筛选出差异代谢物 108个。正离子模式下，分析出差异代谢物 75个，其中上调 40个，下调 35个；负离子模式下，分析出差异代谢物 33个，其中上调 15个，下调 18个。萌发期差异代谢物数量约为幼苗期的 2倍，表明盐胁迫下紫花苜蓿萌发期和幼苗期代谢调控均发生了改变，且紫花苜蓿不同时期代谢机制存在不同。2.6紫花苜蓿萌发期差异代谢物分析2.6.1差异代谢物 KEGG富集分析KEGG Pathway 分为新陈代谢、遗传信息加工、环境信息加工、细胞过程、生物体系统、人类疾病和药物开发 7 个一级分类，进一步划分为若干二级分类和三级分类。紫花苜蓿萌发期盐胁迫与对照相比，48 个差异代谢物富集到了 55 个 KEGG 代谢通路，将 KEGG 富集的代谢通路的 P-value 值由小到大进行排序，选取前 20 绘制气泡图（图 7）。如图 7-A 所示，正离子模式下，紫花苜蓿萌发期胁迫组与对照组相比，ABC 转运蛋白（与膜转运相关的KEGG 代谢通路）富集了 5 个差异代谢物；色氨酸代谢（与氨基酸代谢相关的 KEGG 代谢通路）富集了 3 个差异代谢物；磷脂酰肌醇信号转导系统（与信号转导相关的 KEGG 代谢通路）富集了 1 个差异代谢物。如图 7-B 所示，负离子模式下，紫花苜蓿萌发期胁迫组与对照组相比，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢（与氨基酸代谢相关的 KEGG 代谢通路）富集了 2 个差异代谢物；ABC 转运蛋白（与膜转运相关的 KEGG 代谢通路）富集了 2 个差异代谢物。这表明膜转运、信号转导、氨基酸代谢均参与了盐胁迫的应激反应，其中膜转运和信号转导属于一级分类环境信息加工，氨基酸代谢属于一级分类新陈代谢。A：萌发期正离子模式；B：萌发期负离子模式；C：幼苗期正离子模式；D：幼苗期负离子模式。不同的数字代表不同的样本。A：Positive ion modes at germination stage；B：Negative ion modes at germination stage；C：Positive ion modes at seedling stage；D：Negative ion modes at seedling stage.Different numbers represent different samples.图 4紫花苜蓿处理与对照样本 PLS-DA得分散点图Fig.4Scatter plot of PLS-DA between Medicago sativa treatment and control sample39中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 2 期2.6.2膜转运和信号转导通路中相关差异代谢物分析环境信息加工与植物感知外界环境变化进而做出适应性反应密切相关。ABC 转运蛋白通路属于二级分类膜转运相关，磷酸酰肌醇信号系统属于二级分类信号转导，膜转运和信号转导属于 KEGG Pathway 一级分类环境信息加工。本研究表明，正、负离子模式下，富集到 ABC 转运蛋白通路的差异代谢物共有 7个，分别是 L-苏氨酸（L-Threonine）、L-丝氨酸（L-Serine）、硫胺素（Thiamine）、L-组氨酸（L-Histidine）、肌醇（Inositol）、生物素（Biotin）和甜菜碱（Betaine）；富集到磷酸酰肌醇信号系统的差异代谢物只有 1 个肌醇。对 ABC 转运蛋白通路和磷酸酰肌醇信号系统中的差异代谢物分析表明，肌醇在盐胁迫后上调（图 8-A）。2.6.3氨基酸代谢相关差异代谢物分析植物可通过改变内部新陈代谢以适应外界环境变化。二级分类氨基酸代谢属于 KEGG Pathway一级分类新陈代谢，其三级代谢通路和差异代谢物均较多。正、负离子模式下，富集到氨基酸代谢通路的差异代谢物共有 16 个，分别是 N-乙酰鸟氨酸（N-Acetylornithine）、L-瓜氨酸（L-Citrulline）、4-氨基丁酸（4-Aminobutyric acid）、甜菜碱（Betaine）、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-糖精（L-Saccharopine）、L-组氨酸、组胺（Histamine）、L-酪氨酸（L-Tyrosine）、2-苯基乙酰胺（2-Phenylacetamide）、苯甲酸（Benzoic acid）、香草醛（Vanillin）、色胺（Tryptamine）、吲哚（Indole）和色氨酸（Tryptophol）。对氨基酸代谢通A：萌发期正离子模式；B：萌发期负离子模式；C：幼苗期正离子模式；D：幼苗期负离子模式。A：Positive ion modes at germination stage；B：Negative ion modes at germination stage；C：Positive ion modes at seedling stage；D：Negative ion modes at seedling stage.图 5PLS-DA排序验证Fig.5PLS-DA sequencing verification40段小兰 朱建峰 李伟等 盐胁迫下紫花苜蓿萌发期和幼苗期代谢组学分析路中的差异代谢物分析表明，L-酪氨酸和 2-苯基乙酰胺在盐胁迫后上调（图 8-B）。2.7紫花苜蓿幼苗期差异代谢物分析2.7.1差异代谢物 KEGG富集分析紫花苜蓿幼苗期盐胁迫与对照相比，24个差异代谢物富集到了 37 个 KEGG 代谢通路，用 KEGG富集的代谢通路的 P-value 值由小到大进行排序，选取前 20绘制气泡图。由图 9-A 可知，正离子模式下，紫花苜蓿幼苗期胁迫组与对照组相比，苯丙烷生物合成通路（与其他次生代谢产物生物合成相关的 KEGG 通路）上富集了 3个差异代谢物；赖氨酸降解通路（与氨基酸代谢相关的 KEGG 通路）上富集了 3个差异代谢物。由图 9-B 可知，负离子模式下，紫花苜蓿幼苗期胁迫组与对照组相比，异黄酮生物合成通路（与其他次生代谢产物生物合成相关的KEGG 代谢通路）上富集了 2个差异代谢物；植物激素信号转导通路（与信号转导相关的 KEGG 代谢通路）上富集了 1 个差异代谢物，ABC 转运蛋白通路（与膜转运相关的 KEGG 代谢通路）富集了 1个差异代谢物。这表明其他次生代谢产物的生物合成、氨基酸代谢、信号转导、膜转运均参与了盐胁迫的应激反应，其中信号转导和膜转运属于一级分类环境信息加工，其他次生代谢产物的生物合成和氨基酸代谢属于一级分类新陈代谢。A：萌发期正离子模式；B：萌发期负离子模式；C：幼苗期正离子模式；D：幼苗期负离子模式。A：Positive ion modes at germination stage；B：Negative ion modes at germination stage；C：Positive ion modes at seedling stage；D：Negative ion modes at seedling stage.图 6紫花苜蓿处理与对照样本火山图Fig.6Medicago sativa treatment and control sample volcano map41中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 2 期2.7.2膜转运和信号转导通路相关差异代谢物分析ABC 转运蛋白通路属于二级分类膜转运，植物激素信号转导属于二级分类信号转导。膜转运和信号转导属于 KEGG Pathway 一级分类环境信息加工，与植物感知外界环境变化相关。本研究发现，正、负离子模式下，富集到 ABC 转运蛋白通路的 差 异 代 谢 物 共 有 3 个，分 别 是 L-赖 氨 酸（L-Lysine）、奥利多霉素（Oleandomycin）和 L-丝氨酸；富集到植物激素信号转导的差异代谢物只有 1个吲哚-3-乙酸（Indole-3-acetic acid）。对 ABC 转运蛋白通路和植物激素信号转导中的差异代谢物分析表明，盐胁迫后富集到植物激素信号转导的差异代谢物吲哚-3-乙酸上调，富集到 ABC 转运蛋白通路的 3个差异代谢物的含量降低（图 10-A）。2.7.3其他次生代谢产物的生物合成相关差异代谢物分析正、负离子模式下，富集到其他次生代谢产物生物合成通路的差异代谢物共有 8 个，分别是 L-酪A：萌发期正离子模式；B：萌发期负离子模式。A：Positive ion modes at germination stage；B：Negative ion modes at germination stage.图 7萌发期正离子和负离子模式下紫花苜蓿处理与对照样本 KEGG代谢通路气泡图（top20）Fig.7Bubble plot of KEGG metabolic pathway in positive ion and negative ion mode of Medicago sativa treatment and control sample at germination stage（top20）A：膜转运和信号转导通路；B：氨基酸代谢通路。MC1R：萌发期对照；MC3R：萌发期 100 mmol/L NaCl处理。A：Membrane transport and signal transduction pathways；B：Amino acid metabolism pathway.MC1R：CK of germination stage；MC3R：100 mmol/L NaCl treatment in germination stage.图 8萌发期通路中差异代谢物的热图Fig.8Differential metabolite heat map in pathways at germination stage42段小兰 朱建峰 李伟等 盐胁迫下紫花苜蓿萌发期和幼苗期代谢组学分析氨酸、L-丝氨酸、香豆素（Coumarin）、咖啡酸（Caffeic acid）、福莫尼汀（Formononetin）、三叶草甜素（Trifolirhizin）、哌啶酸（Pipecolic acid）、L-赖氨酸。对其他次生代谢产物的生物合成通路中的差异代谢物分析表明，盐胁迫后 L-酪氨酸、福莫尼汀、三叶草甜素和哌啶酸上调（图 10-B）。3讨论3.1紫花苜蓿不同生长时期对盐胁迫的生长响应在植物的生活史中，种子萌发是植物成功建植的第一步18。植物种子萌发出苗是植物适应环境并建立种群的基础和能否获得竞争优势的关键19。与以往研究结果20类似，盐浓度100 mmol/L时，紫花苜蓿出苗率和存活率与对照相比无显著差异，这表明紫花苜蓿具有一定的耐盐性。盐胁迫抑制器官分化与组织生长，致使植物生长发育迟缓，对植物的抑制作用最突出的外在表现就是生长抑制21。与山 柿（Diospyros japonica）22和 甜 高 粱（Sorghum bicolor）23的研究结果类似，萌发期紫花苜蓿株高和根长随着盐浓度的升高而降低，盐抑制了紫花苜蓿萌发期的株高和根长的生长。幼苗期紫花苜蓿的株高受到盐胁迫显著抑制，而根长在各盐浓度下均未显著降低，株高受到的抑制作用大于根长，与棉花（Gossypium hirsutum）24的研究结果类似。A：幼苗期正离子模式；B：幼苗期负离子模式。A：Positive ion modes at seedling stage；B：Negative ion modes at seedling stage.图 9幼苗期正离子、负离子模式下紫花苜蓿处理与对照样本 KEGG代谢通路气泡图（top20）Fig.9Bubble plot of KEGG metabolic pathway in positive ion and negative ion mode of Medicago sativa treatment and control sample at seedling stage（top20）A：膜转运和信号转导通路；B：其他次生代谢产物的生物合成通路。S3C1R：幼苗期对照；S3C3R：幼苗期 100 mmol/L NaCl处理。A：Membrane transport and signal transduction pathways；B：Biosynthetic pathways of other secondary metabolites.S3C1R：CK of seedling stage；S3C3R：100 mmol/L NaCl in seedling stage.图 10幼苗期通路中差异代谢物热图Fig.10Differential metabolite heat map in pathways at seedling stage43中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 2 期3.2紫花苜蓿不同生长时期的耐盐机制紫花苜蓿具有较强的耐盐碱能力，但目前对于其萌发期和幼苗期的耐盐代谢机制所知甚少，探索紫花苜蓿萌发期和幼苗期的耐盐代谢通路及关键代谢物，对丰富紫花苜蓿耐盐代谢机制研究具有重要理论价值。本研究通过代谢组学分析发现，紫花苜蓿萌发期差异代谢物显著富集在 ABC转运蛋白、磷脂酰肌醇信号系统和氨基酸代谢通路，其通路中的差异代谢物肌醇和 L-酪氨酸显著上调；紫花苜蓿幼苗期差异代谢物显著富集在植物激素信号转导和其他次生代谢产物的生物合成，其通路中的差异代谢物吲哚-3-乙酸、L-酪氨酸和哌啶酸显著上调。表明这些通路和代谢物参与了紫花苜蓿萌发期和幼苗期响应盐胁迫的代谢生理过程，可能是调控紫花苜蓿萌发期和幼苗期耐盐性的关键代谢通路和代谢物。3.2.1紫花苜蓿萌发期耐盐机制ABC 转运蛋白是一种膜蛋白，利用 ATP 水解释放的能量进行植株细胞膜内外的物质运输，在植物细胞生命过程中发挥重要作用25。Larsen等26在研究拟南芥（Arabidopsis thaliana）根尖响应铝胁迫试验中发现，ABC 转运蛋白通过将铝螯合隔离起来提高拟南芥抗性。磷脂酰肌醇信号转换能使胞外信号转换为胞内信号，从而产生各种非生物胁迫响应27。例如：低温胁迫下枇杷（Eriobotrya japonica）磷脂酰肌醇信号系统基因上调表达27；棉花早期响应干旱胁迫过程中磷脂酰肌醇信号系统发挥重要作用28。肌醇又名环己六醇，在植物体内多以磷酸化形式存在，广泛参与了植物生长发育和胁迫响应等生物学过程29。外源添加肌醇可以缓解盐胁迫对海棠（Malus hupehensis）生长的抑制30，缓解盐胁迫对小麦（Triticum aestivum）种子发芽的抑制29。本研究发现紫花苜蓿萌发期差异代谢物富集到ABC 转运蛋白代谢通路和磷脂酰肌醇信号系统，其通路中的差异代谢物肌醇显著上调，这表明差异代谢物肌醇的积累可能影响了 ABC 转运蛋白代谢通路进行物质运输以及磷脂酰肌醇信号系统通路进行信号转导，这在提高紫花苜蓿萌发期的耐盐性方面发挥了重要作用。植物组织细胞在高盐状态下会受到渗透胁迫和离子毒害，为提高抗逆性植物会采取一系列措施，例如增强氨基酸代谢。氨基酸代谢有利于维持细胞膜的稳定性，降低氧化伤害和改善渗透调节能力31。氨基酸可以作为小分子物质降低细胞渗透势，平衡细胞质与外界溶液之间的渗透压，缓解渗透胁迫32。刘建新等33对盐碱胁迫下裸燕麦（Avena nuda）叶片进行代谢组学分析发现，氨基酸代谢增强降低了氧化伤害。L-酪氨酸是一种参与合成多酚类化合物的芳香族氨基酸，而多酚类化合物可以通过消除自由基活性，降低氧化对组织的伤害，因此，L-酪氨酸在提高植物抗氧化能力方面发挥着重要作用34。热胁迫处理下，枸杞（Lycium barbarum）L-酪氨酸含量升高35。本研究中紫花苜蓿萌发期差异代谢物富集到氨基酸代谢途径，其通路中的差异代谢物L-酪氨酸上调。差异代谢物 L-酪氨酸含量的积累可能影响了氨基酸代谢通路，降低氧化伤害，改善渗透调节能力，在提高紫花苜蓿萌发期的耐盐性方面发挥了重要作用。3.2.2紫花苜蓿幼苗期耐盐机制植物激素信号转导是植物感知外界环境胁迫的重要通路36。植物激素信号转导参与了凉粉草（Mesona chinensis）对干旱胁迫的响应37，参与了小麦对低温胁迫的响应38。吲哚-3-乙酸（IAA）具有促进茎细胞纵向生长、抑制根细胞横向生长的能力，是一种广泛参与植物生长发育和提高胁迫响应的植物生长素39。盐胁迫下 NHC牧草吲哚-3-乙酸含量显著提高40，外源施加吲哚-3-乙酸能缓解盐胁迫对番茄（Lycopersicon esculentum）生长的抑制41。本研究表明，盐胁迫条件下紫花苜蓿幼苗期差异代谢物富集到植物激素信号转导通路，其通路中的差异代谢物吲哚-3-乙酸上调，吲哚-3-乙酸的积累可能影响了植物激素信号转导通路感知外界环境变化，这可能提高了紫花苜蓿幼苗期的耐盐能力。次生代谢物的生物合成多在植物应对胁迫过程中发挥重要作用。例如，其他次生代谢物的生物合成参与了水仙（Narcissus）叶片响应热胁迫42，参与了西瓜（Citrullus lanatus）响应渗透胁迫43。哌啶酸在植物应对多种胁迫中发挥作用44。例如，哌啶酸在大麦（Hordeum vulgare）不同胁迫（干旱、盐、铝、镉、缺氮、缺磷、缺钾）条件下均表现为上调44。L-酪氨酸可以提高植物抗逆能力，枸杞在热胁迫处理下体内 L-酪氨酸含量升高35。本研究中，盐胁迫条件下紫花苜蓿幼苗期差异代谢物富集到其他次生代谢产物的生物合成通路，其通路中差异代谢物哌啶酸和L-酪氨酸上调，哌啶酸和 L-酪氨酸的积累可能影响了其他次生代谢产物的生物合成，这可能提高了紫44段小兰 朱建峰 李伟等 盐胁迫下紫花苜蓿萌发期和幼苗期代谢组学分析花苜蓿幼苗期的耐盐能力。4结论本研究表明，紫花苜蓿具有一定的耐盐性；盐抑制了紫花苜蓿萌发期株高和根长的生长，盐胁迫对紫花苜蓿幼苗期株高的抑制作用大于根长。盐胁迫下紫花苜蓿萌发期和幼苗期代谢调控均发生了改变，且两个时期响应盐胁迫的代谢调控机制存在差异。紫花苜蓿萌发期和幼苗期都通过 KEGG Pathway 一级分类环境信息加工感知外界环境变化，调控内部新陈代谢应对胁迫。在感知外界环境变化方面，紫花苜蓿萌发期差异代谢物富集到 ABC转运蛋白和磷脂酰肌醇信号系统，其通路中的差异代谢物肌醇显著上调；紫花苜蓿幼苗期差异代谢物富集到植物激素信号转导，其通路中的差异代谢物吲哚-3-乙酸上调。在调控内部新陈代谢方面，紫花苜蓿萌发期差异代谢物富集到氨基酸代谢通路，通路中的差异代谢物 L-酪氨酸上调；紫花苜蓿幼苗期差异代谢物富集到其他次生代谢产物的生物合成通路，通路中的差异代谢物 L-酪氨酸和哌啶酸显著上调。参考文献（References）：1 朱建峰，崔振荣，吴春红，等.我国盐碱地绿化研究进展与展望 J.世界林业研究，2018，31（4）：70-75.ZHU Jianfeng，CUI Zhenrong，WU Chunhong，et al.Research advances and prospect of saline and alkali land greening in China J.World Forestry Research，2018，31（4）：70-75.2 Han L，Liu H，Yu S，et al.Potential application of oat for phytoremediation of salt ions in coastal saline-alkali soil J.Ecological Engineering，2013，61：274-281.3 董晓霞，刘兆辉，李志禄，等.豆科牧草对滨海盐渍土壤盐分特性和肥力影响的研究 J.安徽农业科学，2008，36（14）：6060-6062.DONG Xiaoxia，LIU Zhaohui，LI Zhilu，et al.Effects of planting Legume forage on soil salinity characteristics and fertility in coastal saline soil J.Journal of Anhui Agricultural Sciences，2008，36（14）：6060-6062.4 陈托兄.不同生育时期紫花苜蓿秋眠型标准品种耐盐机制研究 D.北京：北京林业大学，2009.CHEN Tuoxiong.Study on salt tolerance at different growth periods in fall dormancy standard varieties of alfalfa（Medicago sativa）D.Beijing：Beijing Forestry University，2009.5 崔会婷，孙熙喏，马承泽，等.代谢组学在牧草与草坪草抗逆性中的研究进展 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