纳米佐剂对树突状细胞活化效果的评估.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 8 期2023 年 8 月Vol.45，No.8Aug.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202211028纳米佐剂对树突状细胞活化效果的评估赵莹1，时洪艳2，李明蔚2，吴洋2，闫浩鑫1，郭龙军2*，冯力1,2*(1.黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆 163000；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨 150069)摘要：为评价新型纳米佐剂乳化抗原的免疫效果，本研究以FITC标记的卵清蛋白(FITC-OVA)为抗原，以新型纳米佐剂乳化制备OVA抗原(Nano-OVA)，并将ISA 201佐剂乳化制备OVA抗原(201-OVA)，抗原浓度均为100 滋g/mL。将10 滋L Nano-OVA和201-OVA分别加入小鼠骨髓源树突状细胞(DC2.4)中，2 h后收集细胞样品，利用流式细胞术检测各组DC2.4对OVA抗原的吞噬水平(FITC-OVA+%)及交叉递呈OVA抗原肽(SIINFEKL)水平(PE-25-D1.16+%)。将DC2.4分别与5 滋L Nano-OVA和201-OVA共孵育24 h后收集细胞样品，利用荧光定量PCR(qPCR)检测各组DC2.4共刺激分子CD86、细胞因子IL-12p40和IL-6 mRNA的转录水平。流式细胞术检测结果显示，与201-OVA组相比，Nano-OVA组DC2.4 FITC-OVA+%和PE-25-D1.16+%均极显著升高(0.001)，且均极显著高于对照组(0.001)。qPCR结果显示，Nano-OVA组DC2.4中IL-12p40 mRNA的转录水平极显著高于对照组(0.01)，显著高于201-OVA组(0.05)；Nano-OVA组DC2.4中CD86及IL-6 mRNA的转录水平极显著高于201-OVA和对照组(0.05)。将50 滋L Nano-OVA和201-OVA分别通过足垫皮下免疫BALB/c小鼠，12 h后剖杀各组小鼠分离其腘窝淋巴结，制备冷冻切片，利用免疫组化试验检测各组FITC-OVA在小鼠腘窝淋巴结中的分布，并利用Image J软件量化各组小鼠腘窝淋巴结FITC-OVA平均荧光强度。免疫组化试验结果显示，与201-OVA组相比，Nano-OVA组小鼠腘窝淋巴结FITC-OVA荧光分布更广；荧光强度观察结果显示，Nano-OVA和201-OVA组小鼠腘窝淋巴结中FITC-OVA的平均荧光强度差异不显著(0.05)，但均显著强于对照组(0.05)。上述结果表明，Nano-OVA可更高效地被DC2.4吞噬、交叉递呈以及促进DC2.4的活化，诱导机体产生更强的免疫应答及靶向淋巴结的能力。本研究初步评估了新型纳米佐剂对DC的活化效果及其向小鼠淋巴结靶向引流FITC-OVA抗原的效果，为其临床应用提供参考依据。关键词：纳米佐剂；交叉递呈；CD86；IL-12p40；IL-6中图分类号：S852.6文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)08-0853-06Evaluation of the activation efficacy of nano-adjuvanton dendritic cellsZHAO Ying1,SHI Hong-yan2,LI Ming-wei2,WU Yang2,YAN Hao-xin1,GUO Long-jun2*,FENG Li1,2*(1.College of Animal Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163000,China;2.Harbin Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150069,China)Abstract:To evaluate the immune efficacy of a new nano-adjuvant emulsified antigen,FITC-labeled ovalbumin(FITC-OVA)was selected as the tested antigen to prepare OVA antigen(Nano-OVA)with new nano-adjuvant emulsification,and the ISA 201收稿日期：2022-11-15基金项目：国家重点研发计划(2021YFD1801105)作者简介：赵莹(1998-)，女，吉林公主岭人，硕士研究生，主要从事动物病原分子生物学方向研究.*通信作者：E-mail：；*Corresponding authoradjuvant was emulsified to prepare OVA antigen(201-OVA),both with antigen concentration of 100滋g/mL.Nano-OVA and201-OVA with volume of 10滋L were separately added to mouse bone marrow-derived dendritic cells(DC2.4).After incubation for2 hours,cell samples were collected and flow cytometry was used to detect the phagocytic levels of OVA internalization(FITC-OVA+%)and cross-presentation of OVA antigen peptide(SIINFEKL)levels(PE-25-D1.16+%)by DC2.4 in each group.After co-incubation of DC2.4 with 5滋L Nano-OVA and 201-OVA for 24 hours respectively,the cell samples were collected,andthe transcriptional levels of costimulatory molecules CD86,cytokines IL-12p40 and IL-6 mRNA in each group were detected byfluorescent quantitative PCR(qPCR).The flow cytometry results showed that compared with 201-OVA group,FITC-OVA+%andPE-25-D1.16+%of DC2.4 in Nano-OVA group were significantly increased(0.001),and were significantly higher than those inthe control group(0.001).The qPCR results revealed a significant upregulation level of IL-12p40 mRNA transcription in DC2.4treated with Nano-OVA compared to untreated controls(0.01)or those treated with 201-OVA(0.05).Furthermore,thetranscriptional level of CD86 and IL-6 mRNA in Nano-OVA group were significantly higher than those in 201-OVA and controlgroup(0.05).BALB/c mice were immunized subcutaneously with 50滋L of Nano-OVAand 201-OVA through foot pad,respectively.After 12 hours,the popliteal lymph nodes of each group were isolated,and frozensections were prepared to examine the distribution of FITC-OVA by immunohistochemical method and to quantify the averagefluorescence intensity of FITC-OVA by Image J software.The results of immunohistochemistry showed a wider distribution in thepopliteal lymph nodes of mice in Nano-OVA group compared with the 201-OVA group,while there was no significant differencein the average fluorescence intensity of FITC-OVA between Nano-OVA and 201-OVA groups(0.05),but both weresignificantly stronger than the control group(0.05).These findings suggest that Nano-OVA can be more efficiently engulfed andcross-presented by DC2.4,resulting in enhanced activation capacity of DC2.4 and potentially leading to a robust immune responsein the body,particularly with advantages in targeting lymph nodes.This study preliminarily evaluated the activation efficacy of thenovel nano adjuvant on DC and its targeted drainage of FITC-OVA antigen to mouse lymph nodes,providing a reference for itsclinical application.Key words:nano-adjuvant;cross-presentation;CD86;IL-12p40;IL-6疫苗是预防多种传染病切实有效的方法之一，接种疫苗后能够增强机体的抗病功能，并为机体提供持久的免疫保护作用。灭活疫苗、mRNA疫苗、亚单位疫苗相对较安全，但它们的免疫原性较弱，通常需要配伍佐剂才能达到更好的免疫保护效果。佐剂不仅能够增强机体免疫反应的强度和持续时间，还能够改变免疫反应的类型1。根据抗原颗粒大小佐剂还能够靶向不同的树突状细胞(Dendriticcell，DC)亚群，且粒径越小，越易被淋巴结(LN)储留的CD8琢+DC所捕获，LN储留的CD8琢+DC是启动CD8+T细胞免疫反应的关键抗原递呈细胞(Anti-gen-presenting cell，APC)2。机体内的淋巴结是启动适应性免疫应答的核心部位，疫苗诱导机体产生有效的适应性免疫应答，需要经过以下几个步骤：抗原靶向淋巴结；抗原被淋巴结内不同APC吞噬；APC的成熟与活化；APC通过主要组织相容性复合体(MHC)中的MHC-类分子递呈抗 原至初 始CD4+T细胞，但其 能够通 过MHC-I类分子交叉递呈抗原至初始CD8+T细胞3。T细胞在不同的细胞因子微环境作用下分别向辅助性T细胞1(Th1细胞)、辅助性T细胞2(Th2细胞)、辅助性T细胞17(Th17细胞)、滤泡辅助T细胞(Tfh细胞)、细胞毒性T细胞(CTL细胞)分化，Th1及CTL细胞与机体的细胞免疫反应相关，Th2、Th17及Tfh细胞与机体的体液免疫相关4-6。APC包括DC、巨噬细胞、B细胞等，其中DC是功能最强大的APC，是连接先天性免疫与适应性免疫反应的桥梁。在外周组织器官中，DC发挥哨兵的作用，广泛分布于机体皮肤、粘膜表面。在大多数组织中，DC处于未成熟状态。未成熟DC具有较高的吞噬抗原的能力，但缺乏激活初始T细胞所需的共刺激分子，如CD40、CD80和CD86等。DC在摄取抗原后，可自发成熟，成熟的DC吞噬抗原的能力减弱，迁移能力增强，由外周组织向次级淋巴器官归中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年854巢，成熟DC表面高度表达共刺激分子和MHC等。DC通过增强T细胞、B细胞的增殖与分化，刺激机体的体液与细胞免疫应答4-7。本研究用到的佐剂为纳米级油佐剂，为了评估其对抗原的递呈、交叉递呈及对DC的活化效果，本实验通过流式细胞术检测新型纳米佐剂和ISA 201佐剂对小鼠DC2.4的吞噬及交叉递呈OVA抗原的影响；采用qPCR检测不同佐剂对DC2.4 CD86及细胞因子分泌水平的影响。比较Nano-OVA与201-OVA在小鼠腘窝淋巴结内的分布及荧光强度，分析纳米佐剂乳化的OVA疫苗(Nano-OVA)和201佐剂乳化的OVA疫苗(201-OVA)在活化DC2.4方面的差异，为全面评估该新型纳米佐剂增强疫苗诱导机体产生免疫应答的效果奠定实验基础。1材料与方法1.1主要实验材料小鼠DC2.4由本实验室保存；6周龄8周龄雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。RPMI 1640培养基、胎牛血清、青链霉素、胰酶购自Gibco公司；PE-25-D1.16单克隆抗体(MAb)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；总RNA提取试剂盒购自Axygen公司；反转录试剂盒购自海基生物科技有限公司；SYBR Green 荧光定量PCR(qPCR)试剂盒购自TaKaRa公司；FITC标记的卵清蛋白(FITC-OVA)购自深圳蛋白质科技有限公司；OTC包埋剂购自北京索莱宝科技有限公司；粘附载玻片购自世泰CITOGLAS公司；丙酮购自上海恒远生物公司；DAPI购自上海碧云天生物技术有限公司；ISA 201佐剂购自SEPPIC公司；本研究中新型纳米佐剂由中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所自主研发，为纳米级油佐剂，直径约200 nm，初步研究表明该纳米佐剂抗原一致性和稳定性均较好。Nano-OVA由中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所制备。1.2引物的设计与合成根据GenBank登录的鼠源CD86、IL-12p40、IL-6、茁-actin 的 基 因 序 列 信 息(GenBank号分别为：NM_019388.3、NM_001303244.1、NM_001314054.1、NM_007393.5)，采用Primer 5.0软件设计各分子基因的qPCR引物(表1)，引物均由吉林省库美生物科技有限公司合成。1.3不同佐剂介导DC2.4吞噬及交叉递呈OVA抗原水平的检测将DC2.4铺于6孔板中，待细胞生长至汇 合 度 约 80%后 将 10 滋L 浓 度 为 100 滋g/mL 的Nano-OVA和201-OVA分别加入无血清RPMI 1640培养的DC2.4中，对照组DC2.4加入等体积无血清RP-MI 1640培养基。2 h后，收集细胞样品，利用流式细 胞 术 检 测 不 同 DC2.4 对 OVA 抗 原 的 吞 噬 水 平(FITC-OVA+%)。同时，按照上述方法将Nano-OVA和201-OVA分别加入无血清RPMI 1640培养的DC2.4中，并设相同的对照组DC2.4。2 h后弃液，添加 无血清 RPMI1640 培 养 基 再 培 养 24 h。收 集 细 胞 样 品，与PE-25-D1.16 MAb(1颐100)室温孵育30 min，利用流式 细 胞 术 检 测 DC2.4 交 叉 递 呈 OVA 抗 原 水 平(PE-25-D1.16+%)。1.4不同佐剂对DC2.4中CD86、IL-12p40和IL-6转录水平影响的qPCR检测将5 滋L浓度为100 滋g/mL的Nano-OVA和201-OVA分别加至6孔板中无血清RPMI 1640培养的DC2.4，对照组DC2.4仅含等体积无血清的RPMI 1640培养基。2 h后弃液，各组添加无血清RPMI 1640培养基再培养24 h。收集各组细胞样品，提取细胞总RNA，反转录为cDNA作为模板，采用表1中相应引物，利用qPCR分别检测DC2.4共刺激分子CD86及细胞因子IL-12p40和IL-6 mRNA的转录水平。反应条件为95 1 min；95 10 s、58 30 s、72 40 s，40个循环。通过2-驻驻CT法计算各基因的相对转录水平。1.5不同佐剂乳化抗原在小鼠淋巴结内的荧光分布及强度的检测将6周龄8周龄 BALB/c小鼠随机分为3组，每组3只。两组实验组分别将50 滋L浓度为100 滋g/mL的Nano-OVA和201-OVA经足垫皮下注射BALB/c小鼠，对照组(Mock)小鼠注射等剂量PBS。12 h后剖杀各组小鼠，分离其腘窝淋巴结，使用包埋剂包埋，-40 冷冻再切片，加入预冷的丙酮固表 1本研究用到的引物信息引物名称Primer nameCD86-FCD86-RIL12-p40-FIL12-p40-RIL-6-FIL-6-R茁-actin-F茁-actin-R引物序列(5-3)Primer sequence(5-3)TATCTGCCGTGCCCATTTACGTGCTCGTACAGAACCAACTCCTGTGACACGCCTGAAGAAGATGACTCTTGTGGAGCAGCAGATGTGAGTGTCCATCCAGTTGCCTTCTTGGGGCCTCCGACTTGTGAAGTGGTAGGCACCACACCTTCTACAATGAGGTACGACCAGAGGCATACAG赵莹，等.纳米佐剂对树突状细胞活化效果的评估第 8 期855定10 min。经DAPI(1颐100)染细胞核，通过免疫组化试验检测不同组小鼠腘窝淋巴结FITC-OVA荧光的分布，并利用Image J软件量化各组小鼠腘窝淋巴结FITC-OVA的平均荧光强度。1.6各组实验数据的处理与分析各组实验数据均以平均值依标准差(依)表示，利用Graphpad prism7.0软件处理各组实验数据，采用 检验法对各组数据进行统计学分析，ns：无显著差异，*：0.05，差异显著；*：0.01、*：0.001均表示差异极显著。2结果与讨论2.1不同佐剂介导DC2.4吞噬及交叉递呈OVA抗原影响的检测结果体内大多数DC处于未成熟状态，对抗原有较强的吞噬能力，淋巴结中的DC摄取抗原是诱导T细胞免疫应答的第一步4。为探究纳米佐剂与ISA 201佐剂对DC2.4吞噬OVA抗原的影响，本研究利用流式细胞术检测不同佐剂对DC2.4吞噬OVA抗原水平的影响。结果显示，Nano-OVA和201-OVA组DC2.4 FITC-OVA+%极显著高于对照组(0.001)，且前者DC2.4 FITC-OVA+%极显著高于后者(0.001)(图1A)。Zhang等利用流式细胞术检测经不同浓度枸杞多糖处理的DC2.4 FITC-OVA+%水平，结果表明100 滋g/mL的枸杞多糖促进DC2.4吞噬OVA抗原的效果最佳8-9。本研究结果也表明，与ISA 201佐剂相比，纳米佐剂可显著提高DC2.4吞噬OVA抗原的能力。外源性抗原被APC内化后通过MHC-II类分子递呈至CD4+T细胞为免 疫递呈，外 源性抗 原通过MHC-I类分子递呈至CD8+T细胞称为交叉递呈。当外源抗原被APC吞噬，进入细胞质后被蛋白酶处理，再被转运至 内质 网(ER)中，加工 成抗原 肽并与MHC-I类分子结合，进而转运至APC表面交叉递呈抗原至CD8+T细胞8。抗原的交叉递呈促进CD8+T细胞分化为CTL细胞，CTL细胞通过分泌穿孔素和颗粒酶清除受病毒感染的靶细胞，启动高效的细胞免疫应答10。为探究不同佐剂对DC2.4交叉递呈OVA抗原的影响，本研究利用流式细胞术检测不同组DC2.4通过MHC-I类分子H-2Kb交叉递呈OVA抗原肽(SIINFEKL)(PE-25-D1.16+%)的差异。结果显示，Nano-OVA和201-OVA组DC2.4 PE-25-D1.16+%均极显著高于对照组(0.001)，且前者DC2.4 PE-25-D1.16+%极显著高于后者(0.001)(图1B)。结果表明，纳米佐剂能够更有效地促进DC2.4通过MHC-I类分子交叉递呈OVA抗原。已有研究表明，与未经处理的OVA抗原相比，介孔二氧化硅纳米颗粒包封的OVA抗原能够更好地由MHC-I类分子交叉递呈，并诱导更强的细胞免疫应答4。结合本实验结果推测，本研究制备的Nano-OVA也能够诱导机体产生较强的细胞免疫应答。2.2不同佐剂对DC2.4中CD86、IL-12p40和IL-6转录水平影响的qPCR检测结果DC的成熟对激活初始T细胞起关键作用，CD86主要在APC表面表达，通过与CD28结合驱动T细胞的活化，因此CD86的高表达是DC成熟的标志之一11。为了探究不同佐剂乳化抗原对DC2.4成熟的影响，本研究利用qPCR方法检测不同组DC2.4 CD86 mRNA的转录水平。结果显示，Nano-OVA组DC2.4 CD86 mRNA转录水平极显著高于201-OVA和对照组(0.05)(图2A)。表明Nano-OVA能够显著促进DC2.4 CD86的转录。提示纳米佐剂乳化抗原能够更高效地促进DC2.4的成熟。有研究将志贺毒素衍生物SxtB1作为OVA佐剂，通过qPCR方法检测其诱导小鼠骨髓分化的树突状细胞(BMDC)CD86的转录水平分析该佐剂对BMDC活化的影响，结果证实该佐剂对启动机体适应性免疫应答起到了协助作用12。本研究采用该方法检测到Nano-OVA能够更显著促进DC2.4 CD86mRNA的转录，提示其能够有效促进DC2.4的活化，诱导下游T、B细胞产生适应性免疫应答。DC为T细胞分化提供不同的细胞因子微环境。中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年856图1不同佐剂介导DC2.4吞噬(A)及交叉递呈(B)OVA抗原的检测结果AB432101.00.80.60.40.20201-OVANano-OVAMock*201-OVANano-OVAMock*:0.001*:0.05;*:0.01.The same as below.图2不同佐剂对DC2.4 CD86(A)、IL-12p40(B)和IL-6(C)转录水平影响的qPCR检测结果赵莹，等.纳米佐剂对树突状细胞活化效果的评估第 8 期857不同类型的细胞因子可通过介导初始T细胞向特定的T细胞亚群分化，行使不同的效应功能5。IL-12由两个共价连接的p35和p40亚基组成异二聚体(p70)发挥生物活性功能，两个亚基共表达为IL-12发挥生物学活性所必需13。IL-12主要由成熟的DC分泌，可诱导II型干扰素(IFN-酌)产生，是Th1细胞、CTL细胞分化的关键启动因子13-14。IL-6主要由单核-巨噬细胞、DC以及T细胞等分泌，可促进活化的B细胞分化为产生免疫球蛋白(Ig)的浆细胞，IL-6还可促进T滤泡辅助细胞(Tfh细胞)分化以及IL-21的产生，调节细胞Ig的合成14-15。为探究不同佐剂乳化抗原对DC2.4细胞因子转录水平的影响，本研究利用qPCR检测不同组DC2.4细胞因子IL-12p40和IL-6 mRNA的转录水平。结果显示，Nano-OVA组DC2.4 IL-12p40mRNA转录水平极显著高于对照组(0.01)，显著高于 201-OVA 组(0.05)(图2B)。Nano-OVA组DC2.4 IL-6 mRNA转录水平极显著高于201-OVA和对照组(0.05)(图2C)。Nano-OVA能够更有效地诱导DC2.4 IL-12p40、IL-6mRNA的转录，提示纳米佐剂乳化抗原能够显著刺激DC2.4的活化。研究证实猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型混合感染仔猪后，分离的仔猪肺泡巨噬细胞(PAM)IL-12p40 mRNA转录水平显著升高，并促进了PAM的活化及其的细胞免疫应答16。单纯疱疹病毒2型(HSV-2)通过诱导DC2.4分泌大量的IL-6，诱导宿主细胞产生了体液免疫应答17。本研究中IL-12p40、IL-6 mRNA转录水平的升高表明制备的纳米佐剂不仅能够刺激DC2.4的活化，还能够促进该细胞的体液免疫及细胞免疫应答。2.3不同佐剂乳化抗原在小鼠淋巴结内的荧光分布及强度的检测结果分别将Nano-OVA和201-OVA经足垫皮下注射BABL/c小鼠，12 h后采用免疫组化法观察并检测不同组小鼠腘窝淋巴结FITC-OVA的分布。结果显示，对照组小鼠腘窝淋巴结无荧光。与201-OVA相比，接种Nano-OVA小鼠的腘窝淋巴结FITC-OVA荧光分布更广(图3A)。采用Image J软件量化各组小鼠腘窝淋巴结的平均荧光强度。结果显示，接种Nano-OVA和201-OVA的小鼠腘窝淋巴结FITC-OVA平均荧光强度无显著差异(0.05)，但均显著强于对照组(0.05)(图3B)。抗原引流至淋巴结是启动机体适应性免疫应答的第一步3。本研究通过对不同佐剂组介导OVA抗原引流至小鼠淋巴结进行比较，结果显示，Nano-OVA和201-OVA组的绿色荧光为FITC-OVA引流至小鼠腘窝淋巴结产生的特异性荧光，并非是组织自发荧光。与201-OVA相比较，Nano-OVA在小鼠腘窝淋巴结内分布更广，但Nano-OVA和201-OVA在向小鼠腘窝淋巴结引流的抗原量方面无显著差异。Hong等利用免疫组化试验证实与未经处理的OVA抗原相比，在注射介孔二氧化硅纳米颗粒包封的OVA抗原后，其在小鼠腘窝淋巴结中的荧光更强，提示其在靶向引流淋巴结抗原数量的方面更具优势4。但本研究制备的Nano-OVA在提高靶向引流淋巴结抗原数量方面的作用并不明显。推测其可能并非通过靶向淋巴结的数量提高其对机体的免疫应答能力。108642086420151050nsnsnsABC*201-OVANano-OVAMock201-OVANano-OVAMock201-OVANano-OVAMock图3不同佐剂乳化抗原在小鼠腘窝淋巴结内荧光分布(A)及平均荧光强度(B)的检测结果1234567891011121314151617本研究分析了纳米佐剂和ISA 201佐剂对DC2.4吞噬及交叉递呈OVA抗原的影响，并检测Nano-OVA和201-OVA对DC2.4中CD86与细胞因子分泌水平的影响以及FITC-OVA在小鼠腘窝淋巴结中的分布及荧光强度，比较了Nano-OVA和201-OVA活化DC2.4的差异。结果表明，Nano-OVA可更高效地被DC2.4吞噬、交叉递呈以及刺激DC2.4的成熟与活化，虽然Nano-OVA在小鼠腘窝淋巴结内分布更广，但Nano-OVA和201-OVA在靶向引流小鼠腘窝淋巴结的抗原数量方面无明显差异。综上所述，该纳米佐剂可有效提高抗原的免疫原性。本研究为该新型纳米佐剂的推广应用及疫苗的研发提供了实验依据。参考文献：FIRDAUS F Z,SKWARCZYNSKI M,TOTH I.Developmentsin vaccine adjuvants J.Methods 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