壳聚糖改性脂质体的制备与稳定性研究.pdf

石文等：壳聚糖改性脂质体的制备与稳定性研究第2期肇庆学院学报JOURNAL OF ZHAOQING UNIVERSITY第45卷 第2期2024年3月Vo1.45,No.2Mar.2024收稿编号：2023.05.24.0001基金项目：广东省普通高校青年创新人才项目（2020KQNCX097）作者简介：石文（1989-），男，湖北孝感人，肇庆学院食品与制药工程学院讲师，博士.脂质体的开发是当前传递体系研究的热点1，被广应运用于医药、食品、农业等学科2，市场规模也在不断增加3.常规脂质体由大豆卵磷脂与胆固醇组合而成，能延长被其包埋的药物降解时间，并且改良被包埋药物的药动学，使其毒副作用降至最低，提高药物在作用靶点的作用4.脂质体囊泡粒径的稳定性是重要考察指标.在储存过程中脂质体膜融合或聚集导致尺寸增大5，致被包覆药物发生泄漏，使得药物进入靶细胞的量减少.为提高常规脂质体的稳定性，非网状内皮系统的靶向性及其作用时间6，开发新型脂质体十分必要.增强脂质体稳定性常用方法有2种7：一种是利用具有聚集作用的官能团，例如加入甲基丙烯酸酯、乙烯基等类脂分子，制备出合成磷脂，能改善天然磷脂被空气氧化等缺陷，但其毒副作用等需要进一步观察8；第二种是改性脂质体，利用大分子多聚物与常规脂质体联络，制备出一种常规脂质体外型包覆多聚物形成包覆脂质体（CoatedLP）9，该方法能防止脂质体膜被氧化水解，减小胃肠道中低pH和酶解等因素影响，增强稳定性，延长被包埋物质的缓释时间10.实验采用乙醇注入法，先以大豆卵磷脂与胆固醇为原料制备常规脂质体，再制备羧甲基壳聚糖，进一步制备出包覆脂质体.以该方法制备的包覆脂质体增强了脂质体的稳定性，并且通过壳聚糖改性为羧甲基壳聚糖包覆脂质体，也克服了壳聚糖不溶于中性溶液的问题.1实验材料与仪器1.1 实验材料实验主要试剂见表1.1.2 实验仪器实验主要仪器见表2.壳聚糖改性脂质体的制备与稳定性研究石文，陈海洁（肇庆学院 食品与制药工程学院，广东 肇庆 526061）摘 要：实验通过乙醇注入法制备壳聚糖包覆脂质体.以粒径作为指标，通过单因素正交实验优化，确定关键工艺为：大豆卵磷脂浓度为10 mg/mL，壳聚糖浓度为150 mg/mL，剪切速度为7 000 r/min、剪切时间为2 min，超声时间为10 min，该工艺制备的脂质体粒径为711.38 nm.再考察酪蛋白酸钠、辛烯基酸琥珀酸酐、吐温20和吐温80 4种稳定剂（1%大豆卵磷脂质量比）对脂质体的影响表明，吐温80效果最佳.研究获得一种稳定性强，粒径较小的包覆脂质体.关键词：壳聚糖；脂质体改性；稳定性；粒径中图分类号：TS201.2文献标志码：A文章编号：1009-8445（2024）02-0029-09肇庆学院学报第45卷2实验方法2.1 羧甲基壳聚糖溶液和包覆脂质体的制备方法2.1.1 羧甲基壳聚糖的制备方法称取一定量的壳聚糖粉末，加入异丙醇20 mL，反应时间为34 h，再加入30%NaOH14溶液25 mL，置恒温水浴锅，设水浴锅温度为60加热，称取3 g氯乙酸在20 mL异丙醇中完全溶解，使用磁力搅拌器在搅拌条件下将其缓慢导入溶有壳聚糖的溶液中，使之在容器中充分反应12 h.随后将其放置常温待冷却分层，把上层溶液去掉，然后取50 mL蒸馏水加入其中，用磁力搅拌器搅拌5 min，用10%HCl调节pH为7，调好pH采用表1 实验试剂试剂壳聚糖大豆卵磷脂胆固醇乙醇无水乙醇氯乙酸酪蛋白酸钠辛烯基酸琥珀酸酐吐温20氢氧化钠异丙醇盐酸甲醇磷酸氢二钠磷酸二氢钠纯度分析纯食品级98%95%99.5%分析纯分析纯分析纯药品级分析纯分析纯优级纯分析纯分析纯分析纯生产厂家上海麦克林生化科技有限公司河南新百维食品科技有限公司上海麦克林生化科技有限公司广东广试试剂科技有限公司天津市富宇精细化工有限公司上海麦克林生化科技有限公司上海麦克林生化科技有限公司上海麦克林生化科技有限公司上海麦克林生化科技有限公司广东广试试剂科技有限公司天津市百世化工有限公司广东广试试剂科技有限公司广东广试试剂科技有限公司广州化学试剂厂天津市福晨化学试剂厂表2 实验仪器与设备仪器名称高速分散器超声波清洗器数显恒温水浴锅低速台式大容量离心机纳米激光粒度仪集热式恒温磁力搅拌器电子分析天平紫外可见分光光度计pH计型号XHF-DY2300THHH-4TDL-400LS13 320DF-101SATY-124T6PHS-3C生产厂商宁波新芝生物科技股份有限公司上海安谱实验科技股份有限公司常州智博瑞仪器制造有限公司上海安亭科学仪器厂美国贝克曼库尔特有限公司巩义市予华仪器有限责任公司岛津菲律宾工厂北京普析通用仪器有限责任公司上海议电科学仪器股份有限公司30石文等：壳聚糖改性脂质体的制备与稳定性研究第2期离心去除不溶物，上清液用甲醇充分沉淀，再次离心，之后加入无水乙醇洗涤沉淀，最后再离心得羧甲基壳聚糖溶液.羧甲基壳聚糖溶液制备流程如图1.2.1.2 包覆脂质体的制备方法大豆卵磷脂和胆固醇分别称取所需用量，使大豆卵磷脂与胆固醇分别溶解于温度为50的热乙醇中，启动高速分散器将混合液进行初阶分散，7 000 r/min均质2 min，使之成乳得到脂质体的混悬液静置之后过滤沉淀.在50水浴条件下，超声10 min即得常规脂质体.将已制备好的常规脂质体缓慢倒入到2.1.1制备好的羧甲基壳聚糖溶液中，把其混合液放置磁力搅拌器中，温度调至50，速度以20 r/min水浴搅拌1 h，采用间断超声处理10 min（工作2 min，停止2 min）得到羧甲基壳聚糖包覆脂质体.包覆脂质体制备流程如图2.2.2 脂质常规体与羧甲基壳聚糖包覆常规脂质体单因素实验2.2.1 大豆卵磷脂浓度单因素实验大豆卵磷脂和胆固醇分别称取所需用量，使大豆卵磷脂与胆固醇分别溶解于温度为50的热乙醇中，设大豆卵磷脂浓度分别为2.5 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL，胆固醇浓度为大豆卵磷脂浓度的1/511，启动高速分散器将混合液进行初阶分散，7 000 r/min均质2 min，使之成乳得到脂质体的混悬液，静置之后过滤沉淀.在50水浴条件下，超声10 min即得常规脂质体.置于4下待用，测定粒径12.2.2.2 剪切速度单因素实验大豆卵磷脂和胆固醇分别称取所需用量，使大豆卵磷脂与胆固醇分别溶解于温度为50的热乙醇中，大豆卵磷脂浓度为10 mg/mL，胆固醇浓度为2 mg/mL，启动高速分散器将混合液进行初阶分散，均质2 min，设剪切速度分别为5 000 r/min、7 000 r/min、9 000 r/min、11 000 r/min、13 000 r/min，使之成乳得到脂质体的混悬液，静置之后过滤沉淀.在50水浴条件下，超声10 min即得常规脂质体.置于4下待用，测定粒径.2.2.3 超声时间单因素实验大豆卵磷脂和胆固醇分别称取所需用量，使大豆卵磷脂与胆固醇分别溶解于温度为50的热乙醇中，大豆卵磷脂浓度为10 mg/mL，胆固醇浓度为2 mg/mL，启动高速分散器将混合液进行初阶分散，7 000 r/min均质2 min，使之成乳得到脂质体的混悬液，静置之后过滤沉淀.在50水浴条件下，超声即得常规脂质体，超图1 羧甲基壳聚糖溶液的制备图2 包覆常规脂质体的制备31肇庆学院学报第45卷声时间分别为5 min、10 min、15 min、20 min、25 min.置于4下待用，测定粒径13.2.2.4 壳聚糖浓度单因素实验称取一定量的壳聚糖粉末，壳聚糖浓度为50 mg/mL、75 mg/mL、100 mg/mL、125 mg/mL、150 mg/mL，加入异丙醇20 mL，反应时间为34 h，再加入30%NaOH14溶液25 mL，置恒温水浴锅，设水浴锅温度为60加热，称取3 g氯乙酸在20 mL异丙醇中完全溶解，使用磁力搅拌器在搅拌条件下将其缓慢导入溶有壳聚糖的溶液中，使之在容器中充分反应12 h.随后将其放置常温待冷却分层，把上层溶液去掉，随后取50 mL蒸馏水加入其中，用磁力搅拌器搅拌5 min，用10%HCl调节pH为7，调好pH采用离心去除不溶物.上清液用甲醇充分沉淀，再次离心，之后加入无水乙醇洗涤沉淀，最后再离心得羧甲基壳聚糖溶液.利用羧甲基壳聚糖能溶解于中性溶液的原理制备包覆脂质体.将已制备好的常规脂质体缓慢倒入到羧甲基壳聚糖溶液中，把其混合液放置磁力搅拌器中，温度调至50，速度以20 r/min水浴搅拌1 h，采用间断超声处理10 min（工作2 min，停止2 min）得到羧甲基壳聚糖包覆脂质体.2.3 包覆脂质体的正交实验优化在4个单因素实验基础上，选取4因素4水平的正交设计表L16(44)进行实验优化,确定该实验最佳的实验配方，正交实验因素水平表见表3.2.4 包覆脂质体储藏稳定性实验在包覆脂质体最佳的制备工艺基础上，分别采用添加辛烯基酸琥珀酸酐（OctenylSuccinicAnhydride，Osa)、酪蛋白酸钠（Sodium caseinate）、吐温20、吐温80等4种稳定剂（1%大豆卵磷脂质量比）进行包覆脂质体储藏的稳定性实验12.常温下储藏半个月，按实验所需设置时间梯度测定脂质体的粒径（实验采用第1 d、第2 d、第3 d、第6 d、第10 d、第15 d分别测定不同稳定剂脂质体的粒径），以便选出本实验最优的稳定剂.2.5 脂质体粒径的检测方法测定脂质体的粒径，实验分别采用2种方法测定粒径.第一种为牛国琴等15研究出紫外吸收度测定：用ShimadzuUV-2401PC分光光度计，1 cm光程比色皿，于波长436 nm处测定各脂质体样品吸收度A436 nm值，其回归方程为：lgA436nm=1.118 8lgD-3.073，R2=0.989 3.另外一种方法为运用纳米激光粒度仪对脂质体的粒径进行精确检测，设备每个样液测3次，最后取3次的平均值作为该样液的粒径数.3实验结果与讨论3.1 常规脂质体单因素实验结果3.1.1 大豆卵磷脂浓度对常规脂质体粒径的影响由图3可知，大豆卵磷脂浓度对常规脂质体粒径具有显著的影响16.在其他条件不变的前提下，大豆卵磷脂的浓度在2.5 mg/mL30 mg/mL范围内逐渐加大时，粒径也随着浓度的提高而增大，在大豆卵磷脂浓度为2.5 mg/mL时粒径是最小的，为373.94 nm.在大豆卵磷脂浓度为30 mg/mL时粒径上升到760.15 nm.可能是因表3 脂质体壁材的正交实验因素水平表水平1234A 大豆卵磷脂浓度/（mg mL-1）2.551020B剪切速度/（r min-1）5 0007 0009 00011 000C超声时间/min10152025D壳聚糖浓度/（mg mL-1）7510012515032石文等：壳聚糖改性脂质体的制备与稳定性研究第2期为达到了大豆卵磷脂在乙醇溶解的最大限度，剩余未被溶解的大豆卵磷脂残留在乙醇中，使得所制备出的常规脂质体粒径大且不稳定.粒径细小的脂质体的稳定性较好，而且粒径缩小还能使得药物的溶解性提升17.在实验过程中发现，当大豆卵磷脂浓度在2.5 mg/mL、5 mg/mL和10 mg/mL的常规脂质体粒径均在350 nm450nm之间，为了提高产量，总结得出选用10 mg/mL完成后续的实验，此时粒径为423.84 nm.3.1.2 剪切速度对常规脂质体粒径的影响由图4可知，剪切速度对常规脂质体粒径的影响明显18.在其他条件不变的前提下，粒径在高速分散器剪切速度在5 000 r/min13 000 r/min范围内变化，常规脂质体粒径呈先下降后上升的趋势，其中在7 000 r/min时为最小，粒径为420.73 nm；但随着剪切速度增加粒径也逐渐增大，很可能是由于高速分散设备的运行时长的延长导致设备温度上升，引起大豆卵磷脂发生了聚集.所以选用7000 r/min完成后续的实验.3.1.3 超声时间对常规脂质体粒径的影响由图5可知，超声时间对常规脂质体粒径具有显著的影响19.在其他条件不变的前提下，粒径在所设超声时间525 min范围内波动，脂质体的粒径先下降后上升，其中粒径最小的超声时间为10 min，粒径为403.74 nm，此时制备脂质体的成效良好，后随超声时间加长常规脂质体粒径成线性上升.实验证明，超声时间对脂质体的粒径也有作用，时间过短不能使脂质体分散到粒径足够小且均匀，时间过长则易破坏脂质体结构20.此外，超声时间过长会造成已经分散的脂质体发生聚集，故选用超声时间为10 min完成后续实验.3.1.4 壳聚糖浓度对包覆脂质体粒径的影响由图6可知，壳聚糖浓度对脂质体的粒径是很大的影响因素.在其他条件不变的前提下，随着壳聚糖浓度的增加，粒径先减小后增大，其中在壳聚糖浓度125 mg/mL时粒径最小为 711.38 nm，此时脂质体制备成效良好；在壳聚糖浓度150 mg/mL时，包覆的脂质体粒径达到最大，为1 051.24 nm.这是由于继续提高羧甲基壳聚糖的量会降低脂质体的包图3 大豆卵磷脂浓度对常规脂质体粒径的影响图4 剪切速度对常规脂质体粒径的影响图5 超声时间对常规脂质体的影响图6 壳聚糖浓度对常规脂质体粒径的影响33肇庆学院学报第45卷埋率，这时有太多的羧甲基壳聚糖包埋在脂质体周围，造成脂质体双分子层的排布21.也有可能是由于脂质体从包埋层中渗漏使得检测结果偏倚，故选用壳聚糖浓度125 mg/mL为最佳的实验条件.3.2 包覆脂质体正交实验结果分析以包覆脂质体的粒径作为选优指标，在单因素实验的基础之上，最终确定选择大豆卵磷脂浓度、切剪速度、超声时间、壳聚糖浓度4个因素进行正交实验，实验结果见表4.由表4极差可知，通过对比极差R值大小可见，各个因素在实验中所起的作用各有所异，对比均值K大小，可知各因素对包覆脂质体粒径的影响大小：大豆卵磷脂浓度壳聚糖浓度超声时间剪切速度，得到的最优因素水平方案为为A3D3C1B2，符合本实验方案，即大豆卵磷脂浓度为10 mg/mL，壳聚糖浓度125 mg/mL，超声时间为10 min，剪切速度为7 000 r/min得到的羧甲基壳聚糖包覆常规脂质体粒径最小，该条件的实际粒径是711.38 nm.经过验证实验得出的最优方案与正交设计表理论结果相符合，证明利用正交实验设计优化包覆脂质体粒径方案可行，最终选用该方案为后续的稳定性实验.常规脂质体样品见图6，未搅拌的羧甲基壳聚糖与常规脂质体混合液（左）和搅拌后的羧甲基壳聚糖包覆脂质体（右）样品见图7.表4 包覆脂质体正交实验设计与结果实验号12345678910111213141516K1K2K3K4k1k2k3k4极差R因素主次优方案A11112222333344441 245.912 053.862 955.752 454.87311.47513.46738.93613.71427.46ADCBA3D3C1B2B12341234123412342 165.42 377.191 991.952 175.85541.35594.29497.98543.9696.31C12342143341243212 502.482 034.231 693.642 480.04625.62508.55423.41620.01202.21D12343412432121431 716.512 174.552 650.162 169.17429.12543.63662.54542.29233.41空列11222211112222114 044.964 665.43001 011.241 166.3500155.11空列12122121212112124 688.464 021.93001 172.111 005.4800166.63空列12211221211221124 513.954 196.44001 128.481 049.110079.377 5粒径（nm)297.1224.49322.81401.51609.68703.07327.11414.00512.511 005.31789.95647.98746.11444.32552.08712.3634石文等：壳聚糖改性脂质体的制备与稳定性研究第2期3.3 包覆脂质体储藏稳定性实验结果本实验通过不同稳定剂进一步探究了脂质体在常温条件下储藏的稳定性.对于脂质体稳定性来说，稳定剂对脂质体的稳定性十分关键.应用酪蛋白酸钠、辛烯基酸琥珀酸酐、吐温20和吐温 80 等 4 种稳定剂（稳定剂添加量：1%大豆卵磷脂质量比）比较对脂质体壁材粒径的影响，进一步展开脂质体储藏的稳定性研究12.实验结果如图8所示，添加了酪蛋白酸钠的包覆脂质体粒径呈显著地增大，可能是由于酪蛋白酸钠的加入造成脂质体颗粒的聚拢，使之黏成团，导致颗粒变大；未添加稳定剂的包覆脂质体在常温下储藏10 d后纳米颗粒粒径在不断地变大，从9 447.65 nm变大到15 763.38 nm；添加辛烯基酸琥珀酸酐的包覆脂质体和未添加稳定剂的包覆脂质体粒径波动范围类似；添加吐温20和吐温80的样液，包覆脂质体纳米颗粒粒径从第1到第15 d随着储藏时间的延长吐温20的包覆脂质体粒径先增大后逐渐变小.而加入吐温80的样液随储藏时间的延长逐渐地变小，可能是由于表面活性剂能使乳滴表面的电荷密度变大，而且能使乳滴间的静电阻力作用增大，使得纳米颗粒粒径变小而且较稳定22-23.如图9所示，该图为添加稳定剂吐温80包覆脂质体粒径详细变化图，在储藏半个月的时间之内，添加该图6 常规脂质体样品图7 未搅拌羧甲基壳聚糖与常规脂质体混合液（左），搅拌后的包覆脂质体（右）样品图8 不同稳定剂对包覆脂质体粒径的影响图9 吐温80对不同时间包覆脂质体的粒径变化35肇庆学院学报第45卷稳定剂的粒径在650800 nm的范围之间波动，波动范围较其他3种稳定剂以及未加稳定剂的要小，经过实验证实添加吐温80稳定剂对脂质体稳定性较好.图10所示，为添加辛烯基酸琥珀酸酐、酪蛋白酸钠、吐温20及未添加稳定剂储藏15 d的包覆脂质体粒径占比范围图，共4个样品，该图所示储藏15 d的包覆脂质体粒径大且波动区间较大，主要在6 000 10 000 nm范围波动.图11为添加吐温80储藏15 d的脂质体粒径占比范围图，该图较图10而言粒径变化范围小，粒径小且波动的区间也小，主要在1 0002 500nm范围波动.4结论本实验以大豆卵磷脂和胆固醇制备常规脂质体，以粒径作为平衡指标，通过单因素实验和正交实验得出壳聚糖改性脂质体的最优配方，同时也选出储藏脂质体的最佳稳定剂.最优方案为：大豆卵磷脂浓度为10mg/mL，壳聚糖浓度为125 mg/mL，剪切速度为7 000 r/min，超声时间为10 min，粒径为711.38 nm.其中方案的因素主次为大豆卵磷脂壳聚糖浓度超声时间剪切速度，方差分析表明大豆卵磷脂对脂质体粒径影响最为明显.通过对比酪蛋白酸钠、辛烯基酸琥珀酸酐、吐温80、吐温20 4种稳定剂对包覆脂质体粒径稳定性影响，发现添加吐温80（1%大豆卵磷脂的质量比）能维持包覆脂质体粒径波动范围较少，在600800 nm波动，效果最好.本研究主要是用壳聚糖改性为羧甲基脂质体来包覆常规脂质体，克服了壳聚糖只能溶于中性溶液的问题，用羧甲基包覆脂质体也可增加脂质体的稳定，若脂质体包埋药物、活性肽、膳食补充剂等，可延长药物在体内的停留时间，提高药物的药效.参考文献：1BANGHAMAD,STANDISH M M,WATKINS J C.Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipidsJ.Journal of molecular biology,1965,13:238-252.2LASIC D D.Novel applications of liposomes J.Trends in biotechnology,1998,16(7):307-321.3金沙.脂质药物递送制剂体外释放方法开发及其机理研究 D.广州：华南理工大学,2019.4陈悦,王琨,张凌琳.壳聚糖包覆脂质体递药系统的研究进展J.中国现代应用药学,2021,38(10):1251-1256.图11 添加吐温80的储藏15 d脂质体粒径占比范围图10 添加不同稳定剂的储藏15 d后脂质体粒径占比范围36石文等：壳聚糖改性脂质体的制备与稳定性研究第2期5牛国琴,潘俊,陆伟跃.脂质体粒径的分光光度法检测J.药学学报,2003,38(7):547-551.6MARTIN C W,LASIC D 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min,and ultrasonic time is 10 min,and the particle size of lipo-somes prepared by this process was 711.38 nm.The effects of four stabilizers(1%,soybean lecithin mass ratio),such as sodium caseinate,octenyl succinic anhydride,Tween 20 and Tween 80,etc.,on the particle size of lipo-some wall materials were compared,the result of which showed that Tween 80 offered the best effect.In thisstudy,a kind of coated liposome with high stability and small particle size was obtained.Keywords:Keywords:chitosan;liposome modification;stability;particle size（责任编辑：张宝杰）37