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肇庆学院学报第45卷肇庆学院学报JOURNAL OF ZHAOQING UNIVERSITY第45卷 第2期2024年3月Vo1.45,No.2Mar.2024收稿编号：2023.03.27.0004基金项目：肇庆市科技项目（2021C001）；肇庆学院科研项目（QN202225）；肇庆学院大学生创新创业项目（X202310580122）作者简介：刘郁夫（1990-），男，广西贺州人，肇庆学院生命科学学院讲师，博士.一株PEDV广东流行株S1基因遗传进化分析及其在昆虫细胞中的表达纯化刘郁夫1，林晓慧1，谭银娟2，冯美莹1（1.肇庆学院 生命科学学院，广东 肇庆 526061；2.华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司，广东 肇庆 526238）摘 要：为了解猪流行性腹泻病毒广东流行株的S1基因流行变异情况，制备相应的诊断试剂，试验采用RT-PCR从猪流行性腹泻疑似发病仔猪的肠道内容物中扩增获得S1基因，利用生物信息学软件构建S1基因的遗传进化树.将S1基因克隆至杆状病毒穿梭质粒pFastBac1，转化至DH10Bac感受态细胞中，经抗生素筛选重组杆粒，把重组杆粒转染到昆虫细胞Sf9，盲传3代后进行间接免疫荧光试验和Western blot鉴定.结果表明：该猪流行性腹泻病毒广东流行株分布于GII-b分支，与国内猪流行性腹泻病毒分离株（HN-HB1-2018、HB-HA2015）的核苷酸相似性为98.0%98.3%，而与猪流行性腹泻病毒经典毒株CV777、DR13的核苷酸相似性仅为89.9%90.0%.且S1重组蛋白可在昆虫细胞Sf9中以细胞培养分泌上清的形式表达.本研究可为猪流行性腹泻病毒的流行现状研究提供参考，以及后续猪流行性腹泻病毒诊断制品的研发提供前期基础.关键词：猪流行性腹泻病毒；S1基因；遗传进化；昆虫细胞中图分类号：S855.3文献标志码：A文章编号：1009-8445（2024）02-0016-06猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科冠状病毒属成员，基因组大小约28 kb，是引起猪病毒性腹泻的重要病原1.PEDV几乎可感染所有年龄段猪，以急性肠炎、呕吐、水样腹泻和脱水为主要临床症状，7日龄以内的新生仔猪感染发病死亡率可高达100%，给养猪业造成严重经济损失2.PEDV S蛋白由大约1 383个氨基酸组成，位于病毒囊膜外层，通过弗林蛋白酶酶切位点划分成S1和S2亚基，其中S1亚基含有大多数受体结合位点，是诱导机体产生中和抗体的重要免疫原性蛋白3.PEDV的S1基因具有较高的遗传变异性，是病毒实现免疫逃逸主要方式，临床实践中常通过对PEDVS1基因序列进行测序，监测PEDV流行毒株的变异情况4-6.PEDV阳性病料来源于2020年12月广东省某规模化猪场的发病仔猪病料，经RT-PCR鉴定为PEDV阳性，TGEV、PDCoV和PRoV为阴性.本研究通过RT-PCR扩增出该流行毒株的S1基因片段，对S1基因进行测序分析，并将S1基因ORF全长克隆至pFastBac1质粒中，构建表达PEDVS1蛋白的重组杆状病毒，最后在昆虫细胞Sf9中实现S1重组蛋白的表达纯化.本研究可为PEDV的防控和流行现状研究提供参考，并为后续研制PEDV诊断制品提供基础.1材料1.1 样品PEDV阳性病料来源于2020年12月广东省某规模化猪场的发病仔猪病料，经RT-PCR鉴定为PEDV阳刘郁夫等：一株PEDV广东流行株S1基因遗传进化分析及其在昆虫细胞中的表达纯化第2期性，TGEV、PDCoV和PRoV为阴性，由农业部动物疫病防控生物技术与制品创制重点实验室鉴定保存.1.2 主要试剂pFastBac1质粒和Sf9昆虫细胞由岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心保存；Trizol试剂购自赛默飞世尔科技（15596018）；EasyQuick RT MasterMix 购自康为世纪（CW2019），Ex Taq PCR 酶（RR001B）、PrimeSTAR GXL DNA聚合酶（R050A）、BamHI和HindIII限制性内切酶和T载体试剂盒（3271-C1）均购自宝日医生物技术（北京）有限公司；质粒小量提取试剂盒（D6943）、胶回收试剂盒（D2500）、BAC/PAC DNA小量提取试剂盒（D2156）购自OMEGA公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（P0012A）、硝酸纤维素膜（FFN02）、BeyoECL Plus（P0018S）购自上海碧云天生物技术有限公司；DH5感受态细胞（C1100）、DH10BAC感受态细胞（C1480）、青链霉素混合液（P1400）、Anti-His鼠源单抗（K200060M）、FITC标记的羊抗鼠二抗（SF131）、羊抗鼠酶标二抗（SE131）购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清（31985088）、Sf-900 III昆虫细胞培养基（12658035）、脂质体转染试剂Cellfectin II（10362100）、Opti-MEM减血清培养基（31985088）购自Gibco公司.2方法2.1 引物设计与合成根据NCBI网站上公布的PEDV基因序列，设计PEDVS1基因的扩增引物S1-F/R.S1-F:5-ccggaattcatgaagtctttaacctacttctggttg-3，S1-R:5-ccgggatccagaatggtagaagaaaccaggcaac-3，预测扩增片段大小为2 214 bp，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成.2.2 RNA提取和RT-PCR扩增将肠道内容物加入PBS制备悬浮液，离心取上清按照Trizol试剂（Thermo fisher，15596018）提取总RNA，经反转录试剂（康为世纪，CW2019）反转录后合成cDNA，置于-20冰箱保存备用.以cDNA为模板，S1-F/R引物对为上下游引物进行PCR扩增.PCR反应体系为：5PrimeSTAR GXL Buffer 10 L，dNTP Mixture 4L，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1 L，ddH2O 33 L，cDNA 1 L，上下游引物各1 L.PCR反应程序为：98 预变性3 min；98 变性10 s，60 退火15 s，68 延伸2 min，循环34次；68 终延伸5 min.2.3 S1基因的序列分析将PCR扩增的S1基因片段切胶回收，连接进T载体，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5，将PCR检测阳性的单菌落送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，利用DNAStar软件对测序结果进行拼接整理.从NCBI 网站上下载PEDV 参考毒株的S1基因序列，利用DNAstar 软件进行序列比对，利用Mega6软件，通过Neighbor-Joining法构建遗传进化树，bootstrap值重复1 000次，进行遗传进化分析.2.4 S1重组杆粒的制备首先以引物的形式将S1基因的信号肽序列替换成蜂毒素信号肽序列（MKFLVNVALVFM VVYISYIYA），并在S1基因的5 端设计kozac序列（GCCACC），在S1基因的3 端设计6His标签，并以柔性linker（G4S）3与目的基因相连.将设计改造好的S1基因片段克隆至杆状病毒供体质粒pFastBac1中，测序验证没有移码和突变，命名为pFastBac1-S1.构建重组杆状病毒质粒Bacmid-S1，将构建好的杆状病毒供体质粒pFastBac-S1转化进DH10Bac感受态细胞中，并在含卡那霉素50 g/mL、四环素10 g/mL、庆大霉素7 g/mL、IPTG 125 g/mL、X-gal 100 g/mL的琼脂平板中进行蓝白斑筛选，通过PCR对显白色的单菌落进行鉴定.根据BAC/PAC DNA小量提取试剂盒17肇庆学院学报第45卷（D2156）说明书抽提重组S1蛋白的杆状病毒杆粒Bacmid-S1，检测核酸浓度后置于-20 冰箱保存备用.2.5 重组杆状病毒的拯救将Sf9昆虫细胞培养至对数生长期，并以1106个细胞密度接种于6孔细胞培养板，于27 温箱中静置12 h，取3 g的杆粒Bacmid-S1与Cellfectin II 转染试剂（10362100）混合，之后缓慢滴加到Sf9细胞中.于27 温箱中培养96 h，之后连续盲传3代，直至出现Sf9细胞变大、漂浮、脱落等明显细胞病变.2.6 S1重组蛋白的表达与鉴定为鉴定在Sf9细胞中是否表达外源蛋白S1，将收获的杆状病毒病毒液接种至Sf9细胞，置于27 温箱培养72 h后，经4%多聚甲醛固定处理，0.1%Triton X-100细胞透化，分别以anti-His鼠源单抗（1：500稀释）为一抗孵育1 h，用PBS洗涤3次，再用FITC标记的羊抗鼠二抗（1：500稀释）孵育1 h，PBS洗涤3次后置于荧光显微镜下观察.为鉴定表达的重组蛋白分子量大小是否与预期相符，收集已接毒的Sf9细胞培养上清样品和Sf9全细胞蛋白样品进行12%SDS-PAGE电泳，以1:3000倍稀释的anti-His单抗为一抗，HPR标记羊抗鼠二抗的稀释倍数为1:10 000，用Azure Biosystems C600多功能分子成像系统成像.最后通过His标签亲和层析的方式从Sf9细胞上清中纯化S1重组蛋白.3结果与分析3.1 S1基因的克隆及测序利用RT-PCR方法扩增S1基因序列，琼脂糖凝胶电泳结果显示（图1），目的片段大小约2 100 bp，与预期相符.将S1基因扩增片段和pMD19-T载体连接后，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5，在抗性平板中挑取单菌落进行摇菌和PCR鉴定，挑取的8个单菌落PCR鉴定均为阳性.随机挑选1、2、3号单菌落的菌液送苏州金唯智生物科技有限公司测序，结果显示3株单菌落的克隆基因序列均一致.且将测序拼接结果与NCBI 网站中公布的PEDV 流行株S1基因进行blast比对，S1基因的开放阅读框中没有移码和提前终止情况出现，因此将 1 号重组质粒命名为pMD19-S1.3.2 基于S1基因的遗传变异分析将测序结果拼接获得S1基因全长序列，序列分析结果显示，GD2020株的S1基因序列长2 214bp，共编码738个氨基酸.GD2020株的S1基因序列与国内PEDV分离株（HB-HA2015）的相似性较高，核苷酸相似性为98.3%，氨基酸相似性为97.7%，但与PEDV经典毒株CV777、DR13相比变异较大，核苷酸相似性为 89.9%90.0%，氨基酸相似性为88.1%88.4%（图 2）.提示 PEDV 通过长期流行进化，流行毒株较早期毒株已经发生了较大变化.M.核酸分子质量标准；1.S1基因；2.阴性对照；3-10.菌液PCR鉴定图1 S1基因PCR扩增及菌液PCR鉴定结果图2 GS2020株S1基因序列与参考毒株氨基酸序列比对结果18刘郁夫等：一株PEDV广东流行株S1基因遗传进化分析及其在昆虫细胞中的表达纯化第2期参考NCBI网站上公布的37株PEDVS1基因序列，利用Mega6软件构建遗传进化树.结果显示（图3），这些PEDV毒株可划分成GI和GII两个亚群，GD2020株与其他PEDV近期分离株被划分为GII亚群，与以CV777、DR13等经典株为代表的GI亚群形成了明显的分支差异，再进行细分发现GD2020株与AJ1102、GD-A 等毒株同属于 GII-b 分支.以上结果表明，GD2020株与近年来PEDV国内分离株的亲缘关系较近，属于同一分支，但与早期分离株亲缘关系较远.3.3 S1重组蛋白在昆虫细胞中的表达纯化为表达PEDV GD2020株的S1蛋白，将含S1基因重组杆粒转染Sf9细胞，在Sf9细胞中盲传3代后，可观察到细胞出现细胞肿胀、脱落、死亡等细胞病变（图4），表明重组病毒拯救成功.接着分别通过间接免疫荧光试验和western blots试验检测目的蛋白是否表达.结果显示，S1基因重组杆状病毒感染Sf9细胞72 h后，利用His标签单抗为一抗，可在Sf9细胞内观察到特异性结合的绿色荧光（图5），收集感染后72 h的Sf9细胞培养上清和细胞总蛋白，经 SDS-PAGE 电泳、NC 膜转印、一抗二抗孵育和ECL显色成像后，可在Sf9细胞总蛋白中检测到与His标签抗体发生特异性反应的目的条带，条带大小约78.1 ku，与预期相符（图6），表明成功实现在昆虫细胞中表达S1蛋白，且S1重组蛋白可通过细胞分泌上清的形式进行表达.经His镍株亲和纯化，成功纯化S1重组蛋白，浓度为0.273 mg/mL，纯度90%以上.4讨论与结论上个世纪70年代PEDV被首次报道，随后蔓延至欧洲及亚洲13个国家，现在在世界范围内呈广泛流行.2011年前后PEDV流行毒株出现了明显变异，经典疫苗株CV777不能提供有效保护力，导致以新生仔猪高发病率和高死亡率为特征的PEDV疫情迅速波及全国，并传播至东南亚和北美，给国内外养猪业带来严重经济损失2,7.刘云波等人通过RT-PCR检测腹泻猪群样品，结果显示PEDV阳性率为24.49%，PEDV是我国猪病毒性腹泻的主要病因8.注：为本研究所用毒株图3 S1基因序列遗传进化树图4 重组杆状病毒感染造成的Sf9细胞病变图5 间接免疫荧光试验M：蛋白分子量marker；1：Sf9-S1全细胞蛋白样品；2：Sf9-S1细胞破碎后离心沉淀样品；3：Sf9-S1细胞培养上清样品；4：His镍株纯化后S1重组蛋白图6 PEDV S1重组蛋白的western blot鉴定19肇庆学院学报第45卷S1基因编码的S1蛋白是PEDV的主要免疫原性蛋白，可诱导机体产生中和抗体.S1基因是进行PEDV分子流行病学研究的主要基因片段9.基于S1基因的遗传进化分析可将PEDV毒株分成2个亚群，以CV777、DR13等经典毒株为代表的GI亚群和以2011年以后PEDV分离株为代表的GII亚群，随着流行变异，GII亚群又细分成GII-a和GII-b2个小分支4，GII-a和GII-b小分支毒株在国内均有报道，且均能导致临床发病5.与国内相关报道类似5,10，本研究中PEDV GD2020株的S1基因序列属于GII-b分支，且与不同省份、不同分离时间的PEDVS1基因的相似性较高，提示我国各省区之间的PEDV分离株关系密切，相似性程度高，流行情况复杂，需要对PEDV的分子流行病学进行定期监测.新型基因工程疫苗是未来疫苗研究的方向，S1蛋白是诱导机体产生中和抗体的主要结构蛋白，常作为靶蛋白构建基因工程疫苗11-13.利用杆状病毒表达系统，Masuda等人成功构建表达PEDV S蛋白三聚体的重组杆状病毒，表达的 S 蛋白可刺激小鼠产生高水平的中和抗体14.Kim 等人通过瞬时表达技术，在HEK293T细胞中共转染S、M、E和N蛋白的真核表达质粒，成功组装成PEDV病毒样颗粒，在小鼠中具有较强的免疫原性15.为评价基因工程疫苗在本体动物猪中的免疫原性，武旺盛等人将慢病毒包装系统生产的S1蛋白，经293T细胞表达和纯化后制备成亚单位疫苗，经肌肉注射免疫巴马小型猪后，能诱导唾液、粪便及血清产生S1特异性IgA16.这些研究均为PEDV基因工程疫苗研发奠定了前期基础.Lu等人将S蛋白的B细胞表位（748YSNIGVCK755）和乙肝核心抗原（hepatitis B virus core capsid，HBcAg）在大肠杆菌中大量表达，表达的抗原免疫母猪可在乳汁中产生高水平的中和抗体，并可为仔猪提供一定的免疫保护能力17.虽然原核表达系统具有效率高、成本低等优点，但原核表达系统缺乏翻译后修饰功能，而昆虫细胞表达系统可对病毒蛋白进行一定的糖基化修饰，表达蛋白的生物活性比原核系统更接近于天然蛋白.因此本研究利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统，成功实现PEDV流行毒株S1重组蛋白的表达，且该S1重组蛋白可以细胞分泌上清的形式表达，表明杆状病毒-昆虫细胞表达体系系统成熟，表达成功率高.但S1重组蛋白表达产量水平仍然较低，这可能与未进行密码子优化，目的蛋白分子量太大等原因相关，S1重组蛋白的表达纯化条件仍需进一步摸索优化.接下来，项目组一方面对S1重组蛋白的表达条件进一步优化，提高产量；另一方面还将利用本研究制备的S1重组蛋白在小鼠模型中开展免疫原性评价、单克隆抗体制备等工作.本研究可为PEDV分子流行病学研究、亚单位疫苗研究、单克隆抗体制备提供参考和前期基础.参考文献：1JUNG K,SAIF L,WANG Q.Porcine epidemic diarrhea virus(PEDV):An update on etiology,transmission,pathogenesis,andprevention and controlJ.Virus Research,2020,286(9):1945-1980.2WANG D,FANG L,XIAO S.Porcine epidemic diarrhea in ChinaJ.Virus Research,2016,226:7-13.3温颖,李青梅,乔松林,等.猪流行性腹泻病毒纤突糖蛋白单克隆抗体的制备与鉴定J.中国兽医科学,2022,52(6):720-728.4ZHANG Y,CHEN Y,ZHOU J,et al.Porcine epidemic diarrhea virus:An updated overview of virus epidemiology,virulencevariation patterns and virus-host 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EvolutionAnalysis of SGenetic EvolutionAnalysis of S1 1 Gene of a PEDV Guangdong EpidemicGene of a PEDV Guangdong EpidemicStrain and Its Expression and Purification in Insect CellsStrain and Its Expression and Purification in Insect CellsLIU Yufu1,LIN Xiaohui1,TAN Yinjuan2,FENG Meiyin1(1.School of Life Sciences,Zhaoqing University,Zhaoqing,Guangdong 526061;2.Zhaoqing Institute of Biotechnology Co.,Ltd.,Zhaoqing,Guangdong 526238,China)Abstract:Abstract:In order to understand the prevalence and variation of porcine epidemic diarrhea virusS1 gene ofGuangdong epidemic strains corresponding diagnostic reagents were prepared.The S1 gene was amplified by RT-PCR from intestinal contents of piglets with suspected epidemic diarrhea,and the S1 genetic evolution tree wasconstructed by bioinformatics software.Then S1 gene was cloned into baculovirus shuttle plasmid pFastBac1,and transformed into DH10Bac competent cells.After screened by antibiotics,the recombinant baculovirus plas-mid was transferred into insect cell Sf9.After 3 generations of blind transmission,IFA test and western blots iden-tification were carried out.The results show that GD2020 strain was located in GII-b branch,and the nucleotidesimilarity with domestic PEDV isolates(HN-HB1-2018,HB-HA2015)is 98.0%98.3%,but the nucleotide simi-larity with the classical strains CV777 and DR13 is only 89.9%90.0%.And S1 recombinant protein can be suc-cessfully expressed in insect cell Sf9 in the form of supernatant secreted by cell.This research can provide a refer-ence for the epidemic status of PEDV,and provide early foundation for the research and development of diagnos-tic products of porcine epidemic diarrhea virus.Keywords:Keywords:porcine epidemic diarrhea virus;S1gene;genetic evolution;insect cell（责任编辑：张宝杰）21