烟叶淀粉降解菌的筛选及其作用效果研究.pdf

烟叶淀粉降解菌的筛选及其作用效果研究孙光伟1,2，孙敬国2，陈振国2，赵婉1，杨勇1，向海波1*（1.湖北大学生命科学学院，省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室，武汉430062；2.湖北省烟草科学研究院，武汉430030）摘要：为有效降解烟叶淀粉含量，提高烟叶品质和安全性，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）YA14 经优化条件发酵后的菌液喷施至待烤鲜烟叶并室温下放置处理 48h，然后进行烘烤，分析喷施烟叶与对照烟叶烘烤过程中淀粉和蛋白质含量、相关酶活性及烤后烟叶常规化学成分、外观质量与感官质量的变化，并采用扩增子测序技术对烟叶微生物群落的变化进行了分析。结果表明，经优化条件发酵后，YA14 菌株产淀粉酶活力达 146.38mg/(mgmin)。烘烤前喷施 YA14 菌液显著降低了烟叶的淀粉含量，降解率达 37.17%，但对烟叶蛋白质没有明显降解作用。喷施 YA14 菌液能不同程度地提高烟叶过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和淀粉酶的活性，降低多酚氧化酶（PPO）、淀粉分支酶（SBE）及硝酸还原酶（NR）的活性。此外，喷施 YA14 菌液可以提高烟叶群落丰富度及物种多样性，有效提高了芽孢杆菌属（Bacillus）和曲霉属（Aspergillus）等优势菌群丰度，并降低了窄食单胞菌属（Stenotrophomonas）和赤霉属（Gibberella）等菌群的相对丰度。施用 YA14 菌株后烤后烟叶化学成分协调，外观质量和感官质量均优于对照，有助于提升烤后烟叶品质。关键词：烟草；淀粉降解菌；枯草芽孢杆菌；扩增子测序中图分类号：TS41+1文献标识码：A文章编号：1007-5119（2024）01-0070-09Screening and Effect Evaluation of Starch DegradingBacteria in Tobacco LeafSUNGuangwei1,2,SUNJingguo2,CHENZhenguo2,ZHAOWan1,YANGYong1,XIANGHaibo1*(1.CollegeofLifeSciences,HubeiUniversity,StateKeyLaboratoryofBiocatalysisandEnzymeEngineering,Wuhan430062,China;2.HubeiInstituteofTobaccoScience,Wuhan430030,China)Abstract:Inordertoeffectivelydegradetobaccoleafstarchandimprovethequalityandsafetyoftobacco,onestrainofstarchdegradingbacterianamedasBacillus subtilisYA14,wasfermentation-optimizedandthensprayedontotobaccoleaves48hbeforecuring.Thechangesofstarchandproteincontent,relatedenzymeactivities,conventionalchemicalcomposition,appearancequalityandsensoryqualityoftobaccoleaveswereanalyzedduringthecuringprocessofYA14sprayedandcontrolledtobaccoleaves.AmpliconsequencingtechnologywasusedtoanalyzethechangesofmicrobialcommunitiesintobaccoleavesafterYA14treatment.TheresultsshowedthattheamylaseactivityofYA14strainunderoptimizedfermentationconditionsreached146.38mg/(mgmin),andYA14bacterialsolutionsprayedbeforecuringsignificantlyreducedthestarchcontentoftobaccoleafwiththedegradationrateof37.17%,while had no obvious degradation effect on the protein content of tobacco leaf.The activities of peroxidase(POD),superoxidedismutase(SOD)andamylasewereincreasedbysprayingYA14andtheactivitiesofpolyphenoloxidase(PPO),starchbranchingenzyme(SBE)andnitratereductase(NR)weredecreased.Inaddition,YA14treatmentcouldimprovetherichnessandspecies diversity of tobacco microbial communities,especially improve the abundance of dominant microbes Bacillus andAspergillus.ItalsoreducetherelativeabundanceofStenotrophomonas,Gibberellaandothermicrobes.AfterapplicationofYA14,thechemicalcompositionofcuredtobaccoleaveswasharmonized,andtheappearanceandsensoryqualitywerebetterthanthecontrol,whichindicatedthattheapplicationofstarchdegradingstrainYA14hadgreatsignificanceforimprovingthequalityofcuredtobaccoleaves.Keywords:tobacco;starchdegradingbacteria;Bacillus subtilis;ampliconsequencing目前烟叶淀粉含量偏高已成为制约我国烟草质量的主要因素之一1-2。国外优质烤后烟叶的淀粉含量在 2%左右，而我国烤后烟叶的淀粉含量普遍偏高，为 5.5%8.5%3。淀粉含量过高会影响基金项目：湖北省烟草公司重点技术项目（NO.027y2021-005）；中国烟草总公司重点科技项目（110202102007）第一作者：孙光伟（1987），男，硕士，高级农艺师，从事烟草调制研究。E-mail：sgw_*通信作者：向海波（1986），男，副教授，从事植物保护研究。E-mail：xhb_收稿日期：2023-07-28修回日期：2024-01-26中国烟草科学ChineseTobaccoScience2024,45(1):70-78DOI:10.13496/j.issn.1007-5119.2024.01.010烟叶燃烧性，产生刺激性的有害气体，降低卷烟的抽吸品质4。当淀粉降解不充分时，还原糖含量会偏低，导致烟叶糖碱比失衡，同样会对卷烟的品质和安全性产生不利影响5。因此，烤烟淀粉降解充分与否成为当今烟草行业评价烟草品质的一个重要标准。以往的研究主要通过选育优良品种、转变施肥方式和改进烘烤工艺等方法来降低烟叶淀粉含量6-8。近年来，一些研究开始聚焦于通过微生物来降解烟叶淀粉，冯颖杰等9将菌株 XC-3 接种于烟叶表面，使烟叶淀粉含量降解率达到 29.84%。张晓瑞等10从烟叶表面筛选得到 1 株淀粉降解菌 HX-6，经优化工艺发酵后烟叶淀粉降解率达31.75%。利用微生物降解烟叶淀粉在应用方面仍存在菌株酶活性较低，效果不稳定等问题，并且有关微生物降解烟叶淀粉过程中烟叶内部微生物的活动研究较少。因此，本研究将能高效降解淀粉的降解菌喷施于烟叶，分析烤后烟叶质量，并通过扩增子测序技术对烟叶微生物群落的变化进行分析，从而探究降解菌降解烟叶淀粉、提高烟叶质量的作用机理，为烟叶淀粉降解菌的大规模应用提供理论支撑。1材料与方法1.1材料1.1.1供试烟叶和菌株供试烤烟品种为云烟 87，在中部烟叶成熟期采摘鲜烟叶备用。淀粉降解菌株 YA14 为实验室前期筛选获得。1.1.2培养基LB 培养基：NaCl10g/L，胰蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，在 121 下高压蒸汽灭菌 20min。淀粉培养基：可溶性淀粉 20g/L，牛肉膏 5g/L，胰蛋白胨 10g/L，氯化钠 5g/L，琼脂15g/L，在 115 下高压蒸汽灭菌 20min。1.2方法1.2.1菌种鉴定（1）形态观察：将 YA14 菌株接种至 LB 固体培养基，30 培养 24h，观察菌落形态特征并对菌株进行革兰氏染色。（2）分子生物学鉴定：以 YA14 菌株基因组DNA 为模板，采用引物（27F：AGAGTTTGATCCT-GGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT）进行 PCR 扩增，引物合成和测序由武汉擎科生物科技公司完成。将测序所得序列在 NCBI 中进行BLAST 同源性搜索比对，比对结果用软件 MEGA6.0 构建系统发育树。1.2.2YA14 菌株发酵条件的优化采用 DNS 法测定细菌淀粉酶的活力11。参考张晓瑞10的方法进行 YA14 菌株发酵条件的优化。以 LB 培养基作为对照（CK），以菌株淀粉酶活力为测定目标，分别对发酵培养基中碳源（葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油，添加量为 10g/L）、氮源（胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、硫酸铵，添加量为 10g/L）和无机盐（磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、硫酸镁，添加量为 3g/L）的种类进行单因素试验，然后根据结果设计正交试验，对菌株发酵条件进行优化。1.2.3喷施发酵液处理及烟叶品质测定YA14 菌株接种于 LB 培养基中按照优化后的条件发酵 24h，所得菌液与蒸馏水 11 混合后，均匀喷施于烟叶正反面，至均匀沾满叶片但不滴落，喷施蒸馏水作为对照。每个处理喷施 60 片烟叶，重复 3 次。室温下放置 48h 后于烤房进行三段式烘烤，在烤房升温至 38、40、42、44 以及 46 分别取烟叶样品 4 片进行酶活性、淀粉和蛋白质含量测定。过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、多酚氧化酶（PPO）、硝酸还原酶（NR）、-淀粉酶、-淀粉酶及总淀粉酶的活性采用李合生等12的方法，淀粉分支酶活性（SBE）采用分光光度计法测定13，淀粉和蛋白质含量分别按照 YC/T2162013烟草及烟草制品淀粉的测定连续流动法和 YC/T2492008烟草及烟草制品蛋白质的测定连续流动法测定。烘烤完成后，取 20 片烟叶按照GB26351992烤烟和 YC/T4152011烟草在制品感官评价方法对烟叶外观质量和感官质量进行评价，粉碎后进行常规化学成分分析。1.2.4烟叶微生物扩增子测序在 1.2.3 中烤房升温至 40 时，取烟叶样品 4 片，置于冰上迅速运回实验室进行微生物扩增子测序，扩增子测序方法参考文献 14，由北京诺禾致源公司完成。1.2.5数据分析本研究所有数据的统计和分析第 1 期孙光伟等：烟叶淀粉降解菌的筛选及其作用效果研究71利用 DPS 数据处理系统、Origin9.0、Rstudio 和Excel2010 等软件进行。2结果2.1YA14 菌株的形态观察和分子学鉴定由图 1 可知，YA14 菌落呈乳白色，不透明，边缘整齐，细胞形态呈杆状，革兰氏染色结果为阳性。将 YA14 菌株的 16SrDNA 扩增产物经纯化、测序后与 Genebank 中的核酸序列进行 BLAST 同源比对，采用邻接法构建 YA14 菌株及其相似菌株的系统发育树（图 2）。结果显示 YA14 菌株与Bacillus subtilis（MN945443.1）的相似性达到 100%，结合形态学观察结果，确定菌株 YA14 为枯草芽胞杆菌。YA14 菌株的 16SrDNA 序列已上传国家微生物科学数据中心，编号为 NMDCN0001DPT。AB20 m注：A 为 YA14 菌株的菌落形态，B 为 YA14 菌株在显微镜下的形态。Note:A,colonymorphologyofstrainYA14;B,cellmorphologyofstrainYA14undermicroscope图1YA14 菌株的菌落及细胞形态Fig.1ColonyandcellmorphologyofstrainYA14Bacillus subtilis strain BcX1(JX504009.1)Bacillus subtilis strain H-2 KX791428.14853688176379969934271461001000.00507171Bacillus subtilis strain BSFT-28(MN945443.1)Bacillus velezensis CR-502(AY603658)YA14Bacillus amyloliquefaciens DSM 7(FN597644)Bacillus spizizenii NRRL B-23049(CP002905)Bacillus vallismortis DV1-F-3(JH600273)Bacillus stercoris JCM 30051(MN536904)Bacillus halotolerans ATCC 25096(LPVF01000003)Bacillus tequilensis KCTC13622(AYTO01000043)Bacillus atrophaeus JCM 9070(AB021181)Bacillus swezeyi NRRL B-41294(MRBKO1000096)Bacillus licheniformis ATCC14580(AEO17333)Bacillus haynesii NRRL B-41327(MRBL01000076)Bacillus sonorensis NBRC 101234(AYTNO1000016)Bacillus pumilus ATCC 7061(ABRX01000007)Bacillus capparidis EGI 6500252(KY003162)Bacillus acidicola 105-2(AF547209)Bacillus dafuensis FJAT-25496(MK934696)图2YA14 菌株基于 16SrDNA 序列的系统发育树Fig.2PhylogenetictreeofstrainYA14basedon16SrDNAsequence2.2YA14 菌株发酵条件的优化如图 3 所示，当碳源、氮源和无机盐分别是淀粉、酵母粉和磷酸二氢钠时，YA14 菌株的淀粉酶活力最高，分别达到了 139.55、127.96 和132.12mg/(mgmin)，CK 组为 126.96mg/(mgmin)。在此基础上设计三因素三水平的正交试验，对淀粉、酵母粉和磷酸二氢钠的添加量进行优化，试验因素水平见表 1。结果如表 2 所示，YA14 菌株发酵条件的最佳组合为 A2B2C2，即碳源、氮源和无机盐的浓度分别为 10、10 和 3g/L 时，YA14 菌株的淀粉酶活力最高。对最佳发酵组合进行试验验证，YA14 菌株的淀粉酶活力为 146.38mg/(mgmin)，比优化前提高了 15.30%。72中国烟草科学2024 年第 45 卷2.3烘烤过程中 YA14 菌株对烟叶酶活性的影响如图4 所示，在不同烘烤阶段YA14 菌株处理组的 POD、SOD、-淀粉酶、-淀粉酶和总淀粉酶的活性均高于 CK 组，PPO 和 NR 的活性均低于 CK组。SBE 活性在烘烤期间呈“M”型波动，差异最大的为 42 时，YA14 菌株处理组 40.27mg/(mgmin)相较于 CK 组 108.70mg/(mgmin)降低 62.95%。2.4烘烤过程中 YA14 菌株对烟叶淀粉和蛋白质含量的影响由图 5 可知，YA14 菌株处理组与 CK 组的烟叶淀粉总含量随烘烤温度升高均呈下降趋势，40之后处理组的烟叶淀粉含量明显低于 CK 组，在46 时达到最低，淀粉降解率为 37.17%。YA14菌株处理组的烟叶蛋白质总含量在烘烤初期下降较快，但烘烤结束时与 CK 组无明显差异。2.5YA14 菌株对烤后烟叶常规化学成分的影响如表 3 所示，YA14 菌株处理的烤后烟叶还原糖含量较 CK 组显著升高了 16.81%，其他指标与CK 无显著差异。2.6YA14 菌株对烤后烟叶外观质量的影响施加 YA14 菌株的烟叶烤后颜色桔黄，成熟度较好，叶片结构疏松、油润感强，韧性、弹性更佳，色泽趋于饱和，光泽较为鲜亮，上等烟比例显著高于 CK，中等烟比例无明显差异（表 4）。通过对烤后烟叶质量特征和风格特征的评价对比发现（表 5），烟叶施加 YA14 菌株处理后，烟叶香气质、香气量、杂气和刺激性得分均提高，劲头得分降低，余味、燃烧性、灰色和浓度与 CK 组没有差异。碳源 Carbon source蔗糖 Sucrose葡萄糖 Glucose淀粉 Starch甘油 GlycerolCK胰蛋白胨 Tryptone酶母粉 Yeast extract牛肉膏 Beef extract硫酸铵(NH4)2SO4CK磷酸氢二钠 Na2HPO4磷酸二氢钠 NaH2PO4氯化钠 NaCl硫酸镁 MgSO4CK15010050ccaaaaaadbbbababab0氮源 Nitrogen source无机盐 Inorganic salt淀粉酶活性Amylase activity/(mgmg1min1)150100500淀粉酶活性Amylase activity/(mgmg1min1)150100500淀粉酶活性Amylase activity/(mgmg1min1)注：图中不同小写字母表示处理间差异达显著水平（p0.05）。下同。Note:Differentlowercaselettersinthefigureindicatesignificantdifferencesbetweentreatments(pBC最优组合A2B2C2注：K1、K2、K3表示3个因素在水平1、2、3时3次试验的淀粉酶活力的总和；k1、k2、k3表示3个因素在水平1、2、3时3次试验的淀粉酶活力的平均值；R表示极差。Note:K1,K2andK3representthesumofamylaseactivitiesfromthreeexperimentsatlevels1,2,and3ofthreefactors;k1,k2andk3representtheaveragevalueofamylaseactivitiesfromthreeexperimentsatlevels1,2,and3ofthreefactors;Rstandsforrange.第 1 期孙光伟等：烟叶淀粉降解菌的筛选及其作用效果研究73POD/(mgmg1min1)20000015000010000050000CKYA14036384042444648烘烤温度 Flue-curing temperature/SOD/(mgmg1min1)200015001000500036384042444648烘烤温度 Flue-curing temperature/PPO/(mgmg1min1)200015001000500036384042444648烘烤温度 Flue-curing temperature/NR/(mgmg1min1)10080604020036384042444648烘烤温度 Flue-curing temperature/-淀粉酶活性-amylase activity/(mgmg1min1)总淀粉酶活性Total amylase activity/(mgmg1min1)403020100-淀粉酶活性-amylase activity/(mgmg1min1)15105036384042444648烘烤温度 Flue-curing temperature/36384042444648烘烤温度 Flue-curing temperature/604020036384042444648烘烤温度 Flue-curing temperature/淀粉分支酶活性SBE activity/(mgmg1min1)25020015010050036384042444648烘烤温度 Flue-curing temperature/CKYA14CKYA14CKYA14CKYA14CKYA14CKYA14CKYA14图4不同处理组烘烤过程中烟叶酶活变化Fig.4Changesofenzymeactivitiesoftobaccoleafduringflue-curingindifferenttreatmentgroupsCKYA14CKYA1436384042444648烘烤温度 Baking temperature/36384042444648烘烤温度 Baking temperature/淀粉含量Starch content/(mgg1)20151050蛋白质含量Protein content/(mgg1)1086240图5不同处理组烘烤过程中烟叶淀粉和蛋白质含量变化Fig.5Changesofstarchandproteincontentsintobaccoleavesduringcuringindifferenttreatmentgroups74中国烟草科学2024 年第 45 卷2.7YA14 菌株对烟叶微生物群落的影响2.7.1对细菌多样性和群落结构的影响如表 6 所示，YA14 菌株处理的烟叶样品细菌群落 Shannon指数显著高于 CK，Simpson 指数显著低于 CK。PCoA 分析（图 6A）发现，CK 组与 YA14 菌株处理组之间的样本点分布存在明显分离。通过对烟表3烤后烟叶化学成分Table3Chemicalconstituentsincuredtobaccoleaves化学成分ChemicalconstituentsCKYA14烟碱Nicotine/%/2.840.11a3.210.14a还原糖Reducingsugar/%22.661.33b26.471.54a总糖Totalsugar/%38.861.86a39.191.72a总氮Totalnitrogen/%/1.690.11a1.690.09a钾Potassium/%1.210.08a1.180.08a氯Chlorine/%0.260.01a0.290.01a糖碱比Sugar/Alkali13.680.89a12.210.93a氮碱比Nitrogen/Alkali0.590.02a0.530.01a两糖比Reducingsugar/Totalsugar0.580.01a0.680.02a钾氯比Potassium/Chlorine4.650.27a4.060.24a注：表中不同小写字母表示处理间差异达显著水平（p0.05），下同。Note:Differentlowercaselettersinthefigureindicatesignificantdifferencesbetweentreatments(p0.05),thesamebelow.表4烤后烟叶外观质量Table4Appearancequalityandgradingofcuredtobaccoleaves处理TreatmentsCKYA14颜色Color7.58.3成熟度Maturity6.87.8叶片结构Leafstructure6.76.3身份Body7.48.0油分Oilcontent6.46.0色度Colorintensity5.05.3上等烟比例Rateoffirst-classtobacco/%17.872.07b26.313.94a中等烟比例Rateofmedium-classtobacco/%62.061.87a64.942.22a表5烤后烟叶感官质量Table5Sensoryqualityofcuredtobaccoleaves感官质量特性Sensoryquality指标IndicatorCKYA14质量特征Qualitycharacteristic香气质Aromaquality1415.5香气量Aromaquantity13.514杂气Offensivetaste1313.5刺激性Irritation1617余味Aftertaste1717燃烧性Combustibility44灰色Ashcolor44风格特征Stylecharacteristic浓度Concentration3.53.5劲头Strength3.53表6细菌的 多样性指数Table6diversityindexofbacteria处理TreatmentChao1OTUsShannonSimpsonCoverageCK203.7846.49a 19942.57a 3.490.73b 0.930.00a 0.9997YA14263.5841.34a 25940.73a 5.180.31a 0.720.11b 0.9996OthersFibrobacterotaDesulfobacterotaAcidobacteriotaSpirochaetotaCyanobacteriaActinobacteriotaBacteroidotaMyxococcotaFirmicutesProteobacteriaCK00.250.500.751.000.20.221012000.20.20.40.40.6BACSphingomonasBacteroidetes_vadinHA17MassiliaAerococcusKlebsiellaChloroplastSulfuritaleaVagococeusActinoplanesAllorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobinm-RhizobiumErwiniaEnterococcusRulstoniaBacillusAnaeromyxobacterProvidenciaMethylobacterium-MethylorubrumPseudomonasEnterobacterPantoeaAlcaligenesHaliangiumMitochondriaAcinetobacterStenotrophomonasFalsirhodobacterBBMC-4CitrifermentansCryptosporangiunSerratiaPCoA-PC1 vs PC2PC2(30.52%)PC1(38.3%)YA14CKYA14CKYA14门水平的相对丰度Relative abundance in phylim level/%注：A 为烟叶细菌群落主坐标分析（PCoA）；B 为烟叶样品中细菌门水平的相对丰度；C 为属水平上优势菌群的聚类热图。Note:A,principalcoordinateanalysis(PCoA)oftobaccoleafbacterialcommunity;B,relativeabundancesofbacteriaatphylumlevelintobaccoleaves;C,hierarchicalclusteranalysisofdominantbacterialgeneraintobaccoleaves.图6烟叶细菌群落结构分析Fig.6Analysisofbacterialcommunitystructureintobaccoleaves第 1 期孙光伟等：烟叶淀粉降解菌的筛选及其作用效果研究75叶细菌群落进行门水平的鉴定，发现 YA14 菌株处理后的粘菌门（Myxococcota）与拟杆菌门（Firmi-cutes）的相对丰度高于 CK 组，而放线菌门（Acti-nobacteria）的相对丰度低于 CK 组（图 6B）。对相对丰度排名前 30 的属进行热图分析（图 6C），与 CK组相比，YA14 菌株的施用增加了芽孢杆菌属（Bacillus）和肠杆菌属（Enterobacter）等的丰度，并降低了窄食单胞菌属（Stenotrophomonas）和欧文氏菌属（Erwinia）等的丰度。2.7.2对真菌多样性和群落结构的影响从表 7 可以看出，YA14 菌株处理的烟叶样品的 OTUs 个数和丰富度Chao1 指数均显著低于CK 组，而Shannon指数与 CK 组无显著性差异。根据 PCoA 分析，PC1 和 PC2 分别解释了真菌群落总变异的 49.46%和 26.04%（图 7A），对烟叶样品中的真菌进行门水平的鉴定（图 7B），发现YA14 菌株处理组的子囊菌门（Ascomycota）的相对丰度高于 CK 组，而担子菌门（Basidiomycota）和被孢霉菌门（Mortierellomycota）的相对丰度低于CK 组。对相对丰度排名前 30 的属进行热图分析，如图 7C 所示，YA14 菌株处理组的曲霉属（Aspergi-llus）、布勒担孢酵母属（Bulleromyces）、红酵母属（Rhodotorula）和莫氏黑粉菌属（Moesziomyces）等的相对丰度高于 CK 组；而赤霉属（Gibberella）和茎点霉属（Phoma）等的相对丰度低于 CK 组。3讨论芽孢杆菌常用于降解烟叶淀粉9-11，本研究将B.subtilisYA14 菌株喷施烟草叶面，使烤后烟叶淀粉含量降低了 37.17%，优于冯颖杰等9和李正风等15的报道，但不及王勇1的报道（淀粉降解率达 43.89%），原因主要是联合使用了外源淀粉酶。YA14 菌株处理的烤后烟叶的还原糖含量显著增加，烟叶的香气质和香气量增加，刺激性和杂气减少，表7真菌的 多样性指数Table7diversityindexoffungi处理TreatmentChao1OTUsShannonSimpsonCoverageCK156.5249.34a 153.3346.5a 2.41.77a0.840.00a 0.9998YA1464.6621.1b63.6622.36b 3.730.22a 0.580.44a 0.99990.20.25000.20.250.40.500.75ABCPCoA-PC1 vs PC2PC2(26.04%)PC1(49.46%)CK00.250.500.751.00YA14CKYA14OthersGlomeromycotaChytridiomycotaMortierellomycotaBasidiomycotaAscomycota门水平的相对丰度Relative abundance in phylim level/%21012CladosporiumSampaiozymaHannaellaFilobasidiumMorchellaGibberellaAlternariaEpicoccumFusariumBulleromycesRhodotorulaSporobolomycesSymmetrosporaPhomaLecteraButyriboletusPapiliotremaAmpelomycesPlectosphaerellaBoeremiaAspergillusPenicilliumSetophaeosphaeriaTrichodermaHumicolaMoesaiomycesWallemiaVishniacozymuChaetomiumMeyerozyma注：A 为烟叶真菌群落主坐标分析（PCoA）；B 为烟叶样品中真菌门水平的相对丰度；C 为烟叶中属水平上优势菌群的聚类热图。Note:A,principal coordinate analysis(PCoA)of tobacco leaf fungi community;B,relative abundances of fungi at phylum level in tobacco leaves;C,hierarchicalclusteranalysisofdominantfungigeneraintobaccoleaves.图7烟叶真菌群落结构分析Fig.7Analysisoffungicommunitystructureintobaccoleaves76中国烟草科学2024 年第 45 卷同时上等烟比例大幅提高，说明烟叶的品质在YA14 菌株处理后有较好的提升。这与毛多斌等16对 B.subtilisH11 处理的烟叶增香提质的研究结果一致。下一步计划在喷施 YA14 菌株的基础上结合烘烤工艺的改进，以达到充分改善烟叶品质的目的。在烘烤过程中，随着温度的升高，烟叶氧化胁迫加重，保护酶 POD 和 SOD 活性下降，淀粉酶活性降低，不利于大分子物质的降解与转化；同时高温使细胞结构发生变化，多酚和 PPO 接触，易发生酶促棕色化反应，形成聚合多醌等深色色素，影响烟叶品质和价值17-18。本研究施加 YA14 菌株后提高了烟叶 POD、SOD 的活性，同时降低了 PPO活性，说明它可以增加烟叶的抗氧化能力，有利于烟叶大分子物质的分解转化，并抑制深色色素形成，从而形成优良的烟叶品质。YA14 菌株处理组的NR 与 CK 组相比更低，说明 YA14 菌株能一定程度降低氮代谢运转速度，减少氮的同化，抑制蛋白质的积累，从而促使烤后烟叶蛋白质降低。但是YA14 菌株处理的烟叶蛋白含量与 CK 组没有显著差异，表明 YA14 菌株对氮的同化抑制效果有限，达不到显著降低蛋白含量的效果。YA14 菌株处理的烟叶-淀粉酶、-淀粉酶及总淀粉酶活性均有不同程度的升高且 SBE 活性有一定程度的降低，说明它不仅可以促进淀粉的降解还能抑制支链淀粉的合成，更有利于烘烤过程中烟叶淀粉的降解，与王勇1的报道一致。近年来，利用微生物菌剂降解烟叶淀粉的报道越来越多19-21，但有关微生物菌剂处理对烟叶微生物群落影响的研究较少。一般认为烟叶中的优势微生物是细菌，其次是真菌和放线菌，其中芽孢杆菌属、假单胞菌属、曲霉菌属和酵母菌等为优势菌群22-24。黄申等20采用肠杆菌 F8-2 和不动杆菌7S-2 混菌发酵山东烟叶，发现混菌发酵对烟叶原有微生物群落产生了较大影响，其中假单胞菌属相对丰度显著增加，芽孢杆菌属有较大幅下降，而优势真菌属种类并无太大变化。毛多斌等16用B.subtilisH11 喷施烟叶后发现假单胞菌属的相对丰度大幅降低，而芽孢杆菌属的相对丰度显著增加。本研究也发现芽孢杆菌属、假单胞菌属和酵母菌是烟叶中的优势微生物，烤前喷施 YA14 菌株有效提高了烟叶芽孢杆菌属、肠杆菌属、布勒担孢酵母属和红酵母属等的丰度。芽孢杆菌具有促进烟叶内物质的转化、提质增香和改善吸食口感等功能25；肠杆菌能增加烟叶香气，降低杂气20；酵母菌和芽孢杆菌联合使用可以降低烟叶淀粉和蛋白质的含量，同时增加香气物质的含量26。这表明 YA14菌株的添加在改变烟叶内在化学成分的同时也改变了烟叶微生物的多样性，有利于更好地降解淀粉等大分子物质，增加致香物质成分，从而提升烟叶品质。4结论本研究对一株高效降解烟叶淀粉的 B.subtilisYA14 进行了发酵条件优化，优化后淀粉酶活力达146.38mg/(mgmin)。将其喷施于烟叶表面，提高了烟叶的抗氧化能力和烟叶微生物群落丰富度及物种多样性，促进了烟叶淀粉降解，降解率达37.17%。YA14 菌株处理的烤后烟化学成分协调、外观质量好、感官质量提升、烟叶等级上调。后续将开发同时降解烟叶淀粉和蛋白质等大分子物质的复合菌剂，为工业化应用提供有力的技术