2016年牛粪和食用菌渣等农业废料规模化生产鲜蚯蚓研究项目技术报告.doc

技术报告

一、立题依据及指导思想
近20年来，随着我国畜牧业的繁荣和发展，国内畜禽的饲养环境与饲主的饲养观念以及生产成本高涨的压力下，密饲已成为不正确的趋势，加上卫生管理上的缺失，疾病的发生日趋复杂化，兽药(包括药物添加剂)的使用日益广泛，兽药的使用无疑会导致兽药及其代谢产物在动物体内的滞留或蓄积，并以残留的方式进入人体及生态系统。兽药残留问题不仅涉及到广大人民群众的生命安全与健康，还涉及到生产经营企业的经济利益和国家经济的发展。去年以来，各地多宝鱼事件、"红心"鸭蛋事件、"瘦肉精"中毒等食品安全事件频发，食品安全问题导致我国农产品、食品国际贸易屡次受阻，损害了出口信誉和国家形象。目前，中国的食品已经出口到全球２００多个国家和地区。２００６年中国出口食品２４１７.３万吨，货值２６６.５９亿美元。近期，宠物食品和食品安全事件的出现，使中国的产品质量和食品安全状况备受关注。随着我国经济的发展和社会的进步，食品生产经营和消费格局的变化，以及经济和贸易的全球化，食品安全监管工作面临一些新形势。公众对食品安全的关注度将继续增加，食品安全事件极易引起全社会的广泛关注。
要提高畜禽产品的质量，确保畜禽产品的安全，除了严格控制疫情、加强饲养管理和对兽药及添加剂残留的监测与控制外，开发出新型的可替代抗生素的抗菌肽饲料原料和添加剂至关重要。由于抗菌肽具有广谱杀菌作用、相对分子量较小、热稳定、水溶性好等优点，更为重要的是抗菌肽对真核细胞几乎没有作用，仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞，在当前不少病原菌对原有抗生素逐步产生耐药性时。应用无毒无公害的新型抗菌剂代替抗生素作饲料添加剂，已成为当前国内外饲料学科的一项重要内容。抗生素作饲料添加剂严重影响畜产品在国际市场的竞争力，应用生物技术研究与开发新型抗菌剂是我国科学界一项紧迫的任务。
本项目用牛粪和食用菌渣等农业废料通过发酵处理成蚯蚓喜食的饵料，规模化生产鲜蚯蚓。将收集到的鲜蚯蚓用超声诱导技术诱导蚯蚓抗菌肽的高表达。然后将超声处理抗菌肽高表达的蚯蚓匀浆后离心, 用超滤的方法截留分子质量小于1 ku的粗组分。经过超滤截流的粗组分用阳离子交换剂SP-Sepharose Fast Flow和蛋白质液相色谱(FPLC)分析Pharmarcia FPLC系统收集抗菌肽，并得到纯化的抗菌肽。纯化的抗菌肽用电喷雾离子源质谱(ESI-MS)测其分子质量及纯度。接着用串联质谱(MS/MS法， Bruker ESQUIRE-LC/MS液相色谱-质谱联用仪)测定抗菌肽的氨基酸序列，用水将样品溶解后直接上样,电喷雾离子源，测定其的氨基酸序列。抗菌谱检测用微量稀释法，参照天津金章医用新技术研究所MIC试剂盒说明书。通过上述检测完成对蚯蚓抗菌肽的定性、定量和抗菌活性结构分析。然后将表面活性剂、助表面活性剂、油、水、抗菌肽等组分在适当条件下，形成油包水型（W/O）的外观透明、低粘度，热力学稳定体系抗菌肽微乳液。
考虑生产成本和市场化问题，因为蚯蚓消化道中有10多种蛋白水解酶如蚯蚓纤溶酶,这些蛋白酶类对蛋白质有较强的水解活性,可使蛋白质发生水解作用,选择适宜的酶解条件,使蚯蚓体内酶保持较高活性,并利用这些酶水解体蛋白,使之变成可溶性的小分子活性肽和氨基酸,作为添加剂可以直接被其它动物体完整地吸收,发挥其促生长及抗病的作用。为了进一步利用蚯蚓营养肽,本研究对蚯蚓营养肽的性质及功能进行了深入研究,以研究其促进动物生长及防病的机理,并为其进一步的开发利用打下基础。
以"蚯蚓生态链"为核心，创立肉牛生态养殖新模式，形成高效的"肉牛-牛粪-蚯蚓-蚯蚓抗菌肽-有机肉牛生产"生态链并延伸成产业化链，开发出无毒无公害的新型促进动物生长及防病的蚯蚓营养肽作为饲料添加剂。

二、课题研究的主要内容

1.主要技术路线
牛粪、食用菌渣等发酵处理用作蚯蚓饵料
蚯蚓的工厂化饲养
超生诱导技术诱导蚯蚓抗菌肽的高表达
用超滤的方法截留分子质量小于1 ku的粗组分
阳离子交换剂（SP-Sepharose Fast Flow）和蛋白质液相色谱(FPLC)分析系统收集抗菌肽
利用微乳化技术对抗菌进行处理生产抗菌肽微乳液
电喷雾离子源质谱测抗菌肽分子质量及纯度
串联质谱测定抗菌肽的氨基酸序列
抗菌谱检测
动物饲养试验
营养肽的性质分析及功能分析

2、创新点
利用微乳化技术处理抗菌肽，制备的抗菌肽微乳液，微乳液粒径大小都在10-100 nm以下，形成纳米级的抗菌肽微乳液粒，有利于动物机体吸收。且粒径大小随时间变化不大，稳定性好，制备简单，常温下贮藏，微乳化的抗菌肽损失随时间变化很小。抗菌肽通过微乳化形成油包水的微乳液粒，使其免受胃蛋白酶等消化酶的酶解作用，还有胃酸的腐蚀作用。
利用蚯蚓消化道中有10多种蛋白水解酶，可使蚯蚓本身蛋白质发生水解作用,使之变成可溶性的小分子活性肽和氨基酸,开发出促生长及抗病的蚯蚓营养肽。
3、本研究的主要难点在于
⑴ 对蚯蚓利用工程菌采用超声技术进行抗菌肽高表达诱导。
采用诱导方法制取蚯蚓抗菌寡肽，这是一条与“基因工程”方法制取抗菌肽完全不同的途径,对发展生物制药具有重要意义。
⑵ 抗菌肽的超滤和提取。
用超滤法与离子交换层析相结合的蚯蚓抗菌肽制备方法，简便易行、收获率和纯度高,从蚯蚓(Eisenia foetida)体中分离得到抗菌肽,发现的抗菌寡肽的结构特点,找出蚯蚓抗菌寡肽族的氨基酸组成。
⑶ 利用微乳化技术处理抗菌肽。
微乳化通过以Tween80表面活性剂、正丁醇为助表面活性剂、油、水、抗菌肽等组分在适当条件下，外观透明、低粘度，热力学稳定体系。形成油包水型（W/O）的抗菌肽微乳液。微乳液是一种水和油在大量表面活性剂及助表面活性剂(一般为中等链长的醇)存在下自发形成的透明或半透明的体系。分散相质点为球形，但半径非常小， 通常在10～100nm 范围，是热力学稳定体系。进入20世纪90年代之后，因为微乳液具有外观透明、稳定性好、易于制备、粒径小且均匀等优点开始作为药物载体在药学领域得到应用。
⑷蚯蚓本身发生酶解条件的控制
利用蚯蚓消化道中有10多种蛋白水解酶，可使蚯蚓本身蛋白质发生水解作用,使之变成可溶性的小分子活性肽和氨基酸,开发出促生长及抗病的蚯蚓营养肽。如果条件控制不好发生过酶解或酶解不全。

三、主要仪器设备
电子分析天平ARI140 HH-2数显恒温水浴锅 超净台 高压蒸汽灭菌锅 恒温培养箱，超滤杯系统(颇尔-格尔曼,美国)，高速低温离心机(Hitachi CR21,日本)，冷冻干燥机(FTS SYSYTEMTM, TDS-3D-MP, Revco,德国)，Bruker ESQUIRE-LC/MS液相色谱-质谱联用仪，MIC空白板及对应的结种器(天津金章医用新技术研究所)， Pharmarcia FPLC系统, SP-Sepharose Fast Flow; Pro RPCTMHR 5/10预装柱(Pharmacia,瑞典)。

四 实验方法
1、蚯蚓生产
牛粪和食用菌渣等农业废料通过EM菌液发酵处理，处理成蚯蚓喜食的饵料，将饵料和种蚓投放到蚯蚓生物反应器上。
2、对蚯蚓进行抗菌肽高表达诱导
将从蚯蚓生物反应器上收集到的蚯蚓加入少量水,用超声诱导(额定功率80W),诱导处理15min的时间。
3、抗菌肽的分离纯化
⑴ 粗样品的制备
将用超声处理抗菌肽高表达的蚯蚓用0.02 mol/L(pH 6.0)磷酸缓冲液(PB)匀浆后离心,取上清并计算30%饱和度所需要的固体硫酸铵量,研细后于4℃缓慢加入,离心收集上清.接着加入60%饱和度所需要的固体硫酸铵,重复上述操作并收集沉淀。用分子质量截留为1 ku的超滤杯超滤,获得分子质量小于1 ku的粗组分,取少量进行抗菌活性检测。
⑵ 阳离子交换分离
阳离子交换剂SP-Sepharose Fast Flow,缓冲液A为0.01 mol/L乙酸铵缓冲液(pH 5.45),缓冲液B为1.0 mol/L乙酸铵缓冲液(pH 5.45).用缓冲液A平衡,上样后用缓冲液A洗脱到出现基线,而后进行梯度洗脱0%-100% B洗脱300 ml。收集各峰并取少量进行抗菌活性检测。
抗菌实验表明, 60%饱和度的硫酸铵沉淀分子质量<1 ku的蛋白质粗组分,对白色念株菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、粘质沙雷菌、产酸克雷伯菌有抗菌活性, ,对卡他布兰汉氏球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯氏菌有抗菌活性。
⑶ 反相快速蛋白质液相色谱(FPLC)分析
反相快速蛋白质液相色谱(FPLC)分析Pharmarcia FPLC系统, Pro RPCTM HR 5/10预装柱,缓冲液A为0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液缓冲液B为0.085 TFA/70%乙腈(乙腈∶水为70∶30)， 0%-50% B洗脱40 ml (或0%-30% B洗脱24ml)，洗脱后的样品真空干燥。
阳离子交换分离得到两种组分T-1与T-2，T-1与T-2的分子质量都小于1 ku。在相同的缓冲液梯度中从阳离子交换柱中洗脱出来,这说明T-1与T-2的等电点、离子特性非常相似。在FPLC分析中, T-1与T-2是临近的两个峰,分离纯化的结果表明T-1与T-2是在离子特性和疏水特性等方面非常相似的两种活性成分。
纯度及分子质量测定:只要质量有差异的杂质都可以用质谱法检测出来，灵敏度高且用量少。T-1与T-2的质谱分析表明T-1与T-2已经得到了纯化。用ESI-MS测定多肽的相对分子质量精确度可达0.1 %-0.01%， 远比其他方法(如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶过滤、超离心等)精确。T-1与T-2的相对分子质量为535.27和519.27。
氨基酸序列测定:利用串联质谱技术(MS/MS) T-1与T-2得了肽的结构信息。T-1包含丙氨酸(Ala)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)和两个丝氨酸(Ser), 5个氨基酸残基的分子质量之和为493.26,现加一个乙酰基(Ac 42),正好为T-1的相对分子质量535.27,证明该肽被乙酰基所封闭。T-2的MS/MS质谱分析表明,T-2包含丙氨酸(Ala)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、甘氨酸(Gly)和苏氨酸(Thr), 5个氨基酸残基的分子质量之和为477.26,现加一个乙酰基,正好为T-2的相对分子质量519.27,证明该肽被乙酰基所封闭。质谱数据证明T-1的肽序列为Ac-Ala-Met-Val-Ser-Ser。质谱数据证明T-2的肽序列为Ac-Ala-Met-Val-Gly-Th T-1与T-2的N端均被乙酰基所封闭, N端的3个氨基酸残基(丙氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸)相同。 T-1的C端是两个丝氨酸残基,而T-2是甘氨酸和苏氨酸残基,丝氨酸、甘氨酸和苏氨酸都是不带电荷的极性R基氨基酸。T-1与T-2有很高的同源性。

4、抗菌谱检测
4.1 实验材料
原料：大平2号蚯蚓
菌种名称及来源
菌种名称及来源如表所示
菌种名称
来源
菌种类型
培养基
金黄色葡萄球菌
实验室
G+细菌
肉汤
枯草芽孢杆菌
实验室
G+细菌
肉汤
大肠杆菌
实验室
G-细菌
肉汤
链球菌
实验室
G+细菌
肉汤
变形杆菌
实验室
G-细菌
肉汤
皮氏伯克霍尔德菌
实验室
G-细菌
肉汤
4.2 培养基配制及培养条件
培养基配方为蛋白胨1 %，酵母膏0.5 %，NaCl 10 %，调节pH 值为 7. 0，121 ℃灭菌20 min。固体培养基添加1 %的琼脂。37 ℃培养。
4.3 抗菌肽的微乳化
在35℃下， Tween80:正丁醇=1:1；抗菌肽、油、水为1:99:999形成油包水型（W/O）的抗菌肽微乳液。
4.4 抑菌效果的检测
采用琼脂扩散纸片法
A 接种待测菌种 在超净台上分别将各种待测菌种用接种针密致划线接种在预先做好的琼脂平板培养基上，每一种待测菌种接种在一个平板上。
B 抗菌肽纸片的制备 将准备好的5mm直径圆形的滤纸片用无菌镊子浸在试管中的抗菌肽原溶液中，然后拿出来凉干。
C 用无菌镊子将浸出液滤纸片放在琼脂平板培养基的表面，（注意各个纸片之间的距离）。
D 将贴好滤纸片的培养基放在37℃培养箱内培养，观察测量抑菌圈直径。直径大者抑菌作用强，反之亦然。
4.5 蚯蚓抗菌肽的热稳定性的检测
将蚯蚓浸出液原液分别在100℃灭菌0，5，10，30min，用灭菌时间不同浸出液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌做抑菌检测。
4.6 蚯蚓抗菌肽对不同待测菌种的抑菌效果的比较
选择了皮氏伯克霍尔德菌、变形杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌以及大肠杆菌等 5种菌和金黄色葡萄球菌一起做对照实验发现:蚯蚓浸出液对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、皮氏伯克霍尔德菌、变形杆菌、链球菌均有抑菌效果，对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最强，对皮氏伯克霍尔德菌抑菌效果最弱。结果见表 1。

表1 蚯蚓抗菌肽对不同菌种的抑菌效果
供试菌种
抑菌圈直径/mm
金黄色葡萄球菌
9.0
枯草芽孢杆菌
12.6
大肠杆菌
11.0
链球菌
7.8
变形杆菌
5.7
皮氏伯克霍尔德菌
5.6
表2 蚯蚓抗菌肽对不同菌种的抑菌效果的对比

4.7 蚯蚓抗菌肽的热稳定性
蚯蚓抗菌肽溶液分别在100℃加热0，5，10，30min，对抗菌活性基本没有影响，如表3所示，未经加热处理的蚯蚓浸出液对大肠杆菌的抑菌效果最好,经加热灭菌处理的蚯蚓抗菌肽随加热时间的增加,对大肠杆菌抑菌效果逐渐下降,加热30min的蚯蚓浸出液对大肠杆菌没有抑菌效果。
而蚯蚓抗菌肽溶液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果逐渐上升，经30min加热处理的蚯蚓抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，随着加热时间的缩短，对经黄色葡萄球菌的抑菌效果有所上升。

表3 灭菌不同时间蚯蚓抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果
蚯蚓浸出液灭菌时间/min
抑菌圈直径/mm
对大肠杆菌
对金黄色葡萄球菌
0
11.0
9.0
5
10.8
9.2
10
10.4
9.4
30
10.2
9.8

表4 不同灭菌时间蚯蚓抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果的变化

4.8 结论
A 蚯蚓抗菌肽对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、皮氏伯克霍尔德菌、变形杆菌、链球菌均有抑菌效果，对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最强，对皮氏伯克霍尔德菌效果最弱。
B蚯蚓抗菌肽有较强的热稳定性，随着灭菌时间的增长抑菌效果基本上没有影响，经加热灭菌处理的蚯蚓浸出液随加热时间的增加,对大肠杆菌抑菌效果逐渐下降，而对于金黄色葡萄球菌，随着加热时间的缩短，抑菌效果有所上升。

五、抗菌肽饲料添加剂对断奶仔猪和肉仔鸡生产的影响
5.1抗菌肽饲料添加剂对断奶仔猪猪腹泻率和死亡率的影响。
5.1.1材料与方法
试验动物选体重接近的断奶仔猪60头，随机分为3组，每组20头，公母各半，公猪去势，个体编号，对照组饲喂基础饲料，试验Ⅰ组在基础饲料中添加1%的抗菌肽饲料添加剂，试验Ⅱ组在基础饲料中添加3%的抗菌肽饲料添加剂。经预试期后，个体称重，试验正式期33d。
5.1.2饲料配方及营养水平（见表5）
表5饲料配方及营养水平
原料（％）
对照组
试验Ⅰ组
试验Ⅱ组
玉米
58.75
58.75
58.25
豆粕
19.48
19.48
19.48
膨化大豆
8.71
8.71
8.71
油脂
1.94
1.94
1.94
鱼粉
4.97
4.97
4.97
抗菌肽饲料添加剂
-
1%
3%
乳清粉
3.0
3.0
3.0
石粉
0.8
0.8
0.8
磷酸氢钙
1.1
1.1
1.1
食盐
0.25
0.25
0.25
1%预混料
1.0
1.0
1.0
营养水平
消化能(MJ/kg·DM) 13.79
粗蛋白质(%) 18.0
钙(%) 0.81
磷(%) 0.75
赖氨酸(%) 1.24
蛋氨酸(%) 0.32
蛋氨酸+胱氨酸(%) 0.68

注：预混料含各种维生素（A、D3、E、K3、B1、B2、B6、B12、烟酸、泛酸钙、吡哆醇、胆碱），各种微量元素（Fe、Cu、Zn、Mn、Co、I、Se）。按《瘦肉猪饲养标准GB8487—87》配制日粮。

试验期间饲养管理猪舍为全封闭猪舍，断奶仔猪饲喂粉料，喂前用水拌湿，每日4次（6:30、10:30、14:00和17:30），自由采食，自由饮水。各组分别记录喂料量，腹泻情况和死淘率。舍内温度15～22℃，地面干燥，及时清除粪便，通风换气，舍内卫生良好。

5.1.3结果与分析
试验期各组腹泻情况（见表6）
结果表明：在35～50日龄阶段，添加1%和3%的抗菌肽饲料添加剂，试验Ⅰ、Ⅱ组比对照组的腹泻率分别减少了30％和45％；51～68d期间，试验Ⅰ、Ⅱ组比对照组的腹泻率分别减少了28%和40%；死亡率各组均为0。添加1%和3%的抗菌肽饲料添加剂可以不同程度地降低腹泻率，对调控消化道内菌群结构可能有一定的效果。

表6日粮中添加1%和3%的抗菌肽饲料添加剂对断奶仔猪腹泻率和死亡率的影响（n=20）
项目

腹泻次数
35～50d

51～68d
腹泻率（%）
35～50d

51～68d
死亡率（%）
35～50d

51～68d
对照组
12
10
60
50
0
0
试验I组
6
5
30
22
0
0
试验II组
3
2
15
10
0
0

5.2抗菌肽饲料添加剂对肉仔鸡生产的影响
5.2.1试验设计
选取480只健康1日龄艾维茵肉仔鸡,随机分成4组,每组4个重复,试验期为42d。试验各组在饲喂玉米-豆粕型日粮的基础上加入不同水平的抗菌肽和抗生素,药物配伍及添加剂量见表7。
表7　各组药物配伍及添加剂量
组别
添加物及含量
试验1组
黄霉素5mg/kg+喹乙醇30mg/kg
试验2组
抗菌肽1mg/kg
试验3组
抗菌肽3mg/kg
试验4组
抗菌肽5mg/kg

5.2.2试验日粮及饲养管理基础日粮配方及营养指标见表8(参照美国NRC1994,家禽日粮营养需求配制而成)。
表8　基础日粮成分及营养指标
原料
1～21d
22～42d
玉米/%
57.0
59.2
豆粕/%
26.0
21.8
膨化大豆/%
7.2
9.2
进口鱼粉/%
3.0
2.0
石粉/%
2.0
3.0
菜油/%
1.0
1.0
NaCl/%
0.22
0.24
Lys/%
0.078
0.000
Met/%
0.218
0.139
预混料/%
3.284
3.421
营养指标

ME/(MJ·kg-1)
12.35
12.57
CP/%
20.883
19.500
Ca/%
1.001
0.939
TP/%
0.651
0.631
AP/%
0.473
0.458
Lys/%
1.150
1.000
Met/%
0.561
0.459
Met+Cys/%
0.944
0.830
注:预混料中含Zn 310 mg/kg, Cu 21.0 mg/kg, Fe 113 mg/kg, Mn 360 mg/kg,I 80 mg/kg,VE 150 mg/kg,VC 50mg/kg,参照NRC(1994)。
试验前鸡舍充分冲洗并消毒,试验期间每周2次带鸡消毒。肉鸡自由采食和饮水。鸡舍温度、湿度、光照和饲养密度依常规要求而定。
5.2.2指标测定
试验期间,每天观察记录仔鸡死亡数;22和43日龄清晨,对鸡进行空腹称质量,记录耗料量。试验结束时分别计算肉鸡成活率、平均日增质量和料肉比。
5.2.3数据分析
数据分析采用MicrosoftExcel2000和SPSS(10.0)软件对数据进行处理。所有数据均采用平均值±标准误差表示。
5.2.4结果与分析
A:对肉鸡成活率的影响试验各组肉鸡成活率结果见表9。由表9可见,整个试验期,抗菌肽组肉鸡成活率都高于其他2组。试验3组肉鸡在1～21d和22～42d的成活率分别比试验1组高出3.76%和5.17%,差异显著。试验3组肉鸡成活率也高于试验2组,但差异不显著。试验4组肉鸡在1～21d和22～42d的成活率显著高于试验1组,差异显著;相对于试验2组,试验4组的成活率有上升趋势,差异不显著。试验4组与试验3组比较,肉鸡成活率有下降趋势,但差异不显著。

表9　试验各组肉鸡成活率
项目
试验1组
试验2组
试验3组
试验4组
成活率(21d)
94.30a
97.54ab
98.06b
98.44b
成活率(42d)
91.26a
95.18ab
96.43b
97.60b
　注:同行数据肩注不同小写字母表示差异显著,肩注不同大写字母表示差异极显著

B:对肉鸡生产性能的影响试验各组肉鸡平均日增质量(ADG)和料肉比(F/G)结果见表10。由表4可知,无论在饲养前期、后期及整个试验期,抗菌肽添加组肉鸡都表现出良好的生长趋势,其中试验4组肉鸡平均日增质量最高,略高于试验3组,显著高于试验1组和试验2组,差异显著。抗菌肽组的料肉比均略低于抗生素组,但差异不显著。

表10　试验各组平均日增质量和料肉比结果
测试项目
试验1组
试验2组
试验3组
试验4组
体质量(1d)
39.00±0.02
39.00±0.02
39.00±0.02
39.00±0.02
体质量(21d)
585.00±11.31
604.00±02.38
613.00±11.5
625.00±14.36
体质量(42d)
1789±0.07
1989.00±0.59
1979.00±0.06
1999.00±0.35
平均日增质量(1～21d)
25.00±11.36
26.89±10.05
26.33±12.53
27.89±14.36
平均日增质量(22～42d)
57.03±4.06a
61.57±2.59a
65.15±3.16b
65.33±2.59b
平均日增质量(1～42d)
41.57±5.33a
44.39±4.25a
46.29±6.22b
46.57±4.35b
料肉比(1～21d)
1.46±0.37
1.43±0.26
1.38±0.55
1.37±0.24
料肉比(1～42d)
2.01±0.88
1.93±0.59
1.89±0.24
1.78±0.64

5.2.5小结
试验结果表明,在肉仔鸡日粮中添加5mg/kg抗菌肽,能有效提高肉鸡成活率,改善饲料消化吸收,提高肉鸡的生产性能。由于抗生素的过度使用,细菌耐药性正在惊人的增强。试验观察到,与大剂量的抗生素组合相比,抗菌肽能提高肉鸡成活率及生产性能,很少有耐药性产生。从经济效益上看,抗菌肽添加剂量小,作用快,成本低,可作为抗生素替代物,广泛应用于饲料行业。
六、 蚯蚓营养肽的研究
6.1 材料与试剂
1.复合蚯蚓营养液:自行研制
2.试剂:Sephadex G-25:德国,Sigma公司SDS,PAGE,等Sigma公司进口,上海
试剂厂分装。
6.2方法
1.氨基酸分析:氨基酸自动分析仪分析。由河北省分析测定中心测定。
2.微量元素:原子吸收法河北省分析测定中心测定。
3.维生素: 河北省分析测定中心测定。
4.SDS PAGE电泳:参照(刘毓秀,程桂芳译,蛋白质的凝胶电脉法·实践方法。1986,科学出版社)文献的方法,浓缩胶5%,分离胶12%。
6.3结 果
表11蚯蚓营养肽氨基酸分析
氨基酸名称
含量mg/100ml
氨基酸名称
含量mg/100ml
天冬氨酸
541
赖氨酸
660
异亮氨酸
474
丙氨酸
547
苏氨酸
377
组氨酸
185
亮氨酸
604
半胱氨酸
124
酪氨酸
228
精氨酸
563
谷氨酸
985
颉氨酸
481
苯丙氨酸
406
脯氨酸
219
甘氨酸
248
蛋氨酸
257
丝氨酸
335

蚯蚓蛋白含量很高，约占干重的50-65%，将其水解所获得的混合液，其中氨基酸占85%，短肽和小分子蛋白为14%-15%。而氨基酸中以谷氨酸、赖氨酸和精氨酸的含量居多。
表12 酶解后蚯蚓营养肽的矿物质和维生素含量
矿物质
含量mg/L
维生素
含量mg/L
钾
992
维生素A
13.56
铁
340
维生素B1
53.95
钙
320
维生素B2
84.02
钠
315
维生素E
30.98
镁
120
维生素C
382.9
锌
7.1

锰
3.87

硒
0.32

蚯蚓还含有各种维生素、矿物质元素、蚯蚓素、6-羟基嘌呤、琥珀酸、胆碱、蚯蚓解热素、活性酶及某些抗菌肽。
6.4 结论
1. 蚯蚓营养肽含有丰富的氨基酸和多肽
蚯蚓消化道内具有多种消化酶,且活性较强,但至今没有很好开发利用。已有报道指出,蚯蚓消化道中有10多种蛋白水解酶如蚯蚓纤溶酶等,这些蛋白酶类对蛋白质有较强的水解活性,可使蛋白质发生水解作用,已有研究发现,机体对二、三肽的吸收比自由氨基酸的吸收快,并且能被肌肉组织及细胞直接利用。我们就是利用这一特性把蚯蚓体蛋白水解成可溶性的小分子活性肽和氨基酸,这些氨基酸和活性肽,可以直接被其它动物体完整地吸收,发挥其促生长及抗病的作用。
2. 蚯蚓营养肽中矿物质元素和维生素的含量
蚯蚓营养肽的矿物元素和维生素含量丰富尤其是铁及维生素C、B1、B2的含量很高。从表12中可以看出,钾、铁、钙、钠、锌等含量较为丰富,分别992,340,320,315和7.1毫克/毫升,并且含有一定数量的硒、锰等机体必需的微量元素,分别为0.32和3.87毫克毫升,。从表中可以看出, 蚯蚓营养肽中维生素的含量非常丰富,其中,维生素B1为53.95毫克/升,维生素B2为84.02毫克/升,维生素C为382.9毫克/升,维生素E为30.98毫克/升,这些丰富的维生素对作为添加剂是非常有益的。因此, 蚯蚓营养肽作为一种新型的饲料添加剂用于动物生产上是可行的。
6.5蚯蚓营养肽对蛋鸡的增产效果
衡水市某蛋鸡场存栏蛋鸡1200只,分为2组, 600只喂给蚯蚓营养肽, 500只喂给清水作为对照。由灵寿县肉牛养殖协会把活体蚯蚓溶化成液体,把液体蚯蚓兑入蛋鸡饮水中(蚯蚓营养肽1∶饮水10),让蛋鸡自由饮用。用时投喂全价饲料。14 d后,蛋鸡产蛋由平均每8.2枚500g增重为每7.60枚500 g。蛋黄颜色改变也十分明显,由淡黄色变为金红色,煮熟食用口感由松软变得柔韧。饲喂液体蚯蚓,消除了蛋鸡对活体蚯蚓的恐惧感;又由于鸡群饮水量均衡, 蚯蚓营养肽蛋白质、矿物质、维生素、抗菌肽等营养元素含量丰富,摄入量一致,故鸡产蛋量增加显著,蛋黄变得深红。提高了鸡蛋品质,售价有所提高。
七、市场预测
由于抗菌肽具有广谱杀菌作用、相对分子量较小、热稳定、水溶性好等优点，更为重要的是抗菌肽对真核细胞几乎没有作用，仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞，在当前不少病原菌对原有抗生素逐步产生耐药性时。应用无毒无公害的新型抗菌剂代替抗生素作饲料添加剂，已成为当前国内外饲料学科的一项重要内容。
随着人们对无污染绿色畜产品的渴望，开发生产绿色饲料添加剂已经成为商家，市场竞争的新制高点。目前75%的饲料添加剂品种不符合绿色食品生产的需求，因此新型绿色饲料添加剂的市场前景是极其广阔的，其经济效益是巨大的。 据饲料工业协会统计，未来几年绿色饲料添加剂的市场需求量迅速增加，每年可达15万吨，按氨基酸酶肽制剂占总量的1/4计算，氨基酸酶肽制剂年需求量为近4万吨，全国5年内需求量估计在20-25万吨。氨基酸酶肽制剂的平均价格为2万元/吨，市场规模在40-50亿人民币左右。而应用本技术成果投产年产抗菌肽饲料添加剂100吨的加工车间或加工厂，年产值可达200万元。
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