PpMYB10.1启动子4...肉桃果肉颜色形成关系的研究_王蛟.pdf

DOI：10.13430/ki.jpgr.20220909001植物遗传资源学报 2023，24（3）：758-766Journal of Plant Genetic ResourcesPpMYB10.1启动子483 bp缺失与红肉桃果肉颜色形成关系的研究王蛟，曹珂，王玲玲，王力荣（中国农业科学院郑州果树研究所，郑州450009）摘要：以红色深浅不一的红肉桃种质为材料，探讨影响其花色素苷含量的分子机理，为高效选育红色深浅不等的红肉桃品种提供理论依据。利用GUS染色测定桃果肉花色素苷重要基因PpMYB10.1的启动子活性，利用DNA-pulldown鉴定结合于PpMYB10.1启动子上的转录抑制因子，利用双荧光素酶及酵母双杂交验证转录抑制因子的功能。结果表明：（1）具有深红、红、浅红的桃果肉，其对应的PpMYB10.1表达量及花色素苷含量依次下降。（2）具有483 bp序列的PpMYB10.1启动子，其启动活性弱于缺失该序列的启动子。（3）利用该483 bp序列鉴定到的转录抑制子基因Prupe.2G302800，虽然不能直接抑制PpMYB10.1的转录，但能够结合花色素苷合成的主效基因PpBL，并抑制其转录活性，可能对降低PpMYB10.1表达具有一定功能。本研究通过483 bp缺失序列鉴定到的转录抑制子Prupe.2G302800，虽然不是红肉变浅的直接因素，但通过抑制PpBL转录活性，对于红肉桃红色变浅，可能具有一定作用。关键词：红肉桃；PpMYB10.1；红色深浅；启动子活性Deciphering the Genetic Effect of a 483 bp Deletion in the PpMYB10.1 Promoter to Determine Intensities of the Red-colored Flesh PeachWANG Jiao，CAO Ke，WANG Ling-ling，WANG Li-rong（Zhengzhou Fruit Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450009）Abstract：Based on the red-flesh color peaches showing different intensities，this study attempted to decipher their formation mechanism in order to provide theoretical basis for efficient breeding of red peach varieties.The promoter activity of PpMYB10.1 was detected via GUS staining，and the candidate transcription repressors binding on its promoter were captured through DNA-pull down assay.The function of these candidate genes were determined by double luciferase and yeast two-hybrid assay.The results showed that：（1）The expression of PpMYB10.1 and anthocyanin content in flesh peaches with deep-red，red and light-red were gradually decreasing.（2）Activity of PpMYB10.1 promoter with a 483 bp deletion was weaker than that without the sequence.（3）Interestingly，we identified a candidate transcription repressor Prupe.2G302800 based on the 483bp deletion.The protein strongly interacted with PpBL，a major factor in anthocyanin synthesis and resulted in a reduction on the transcription of PpMYB10.1.Prupe.2G302800 is unlikely the direct factor modulating the red flesh of peach，whereas it might play an important role in decreasing red-flesh color by inhabiting PpBL transcription activity.Key words：red flesh peach；PpMYB10.1；different intensities of red-flesh color；promoter activity收稿日期：2022-09-09 修回日期：2023-01-06 网络出版日期：2023-01-18URL：https：/doi.org/10.13430/ki.jpgr.20220909001第一作者研究方向为桃种质资源评价与利用，E-mail：通信作者：王力荣，研究方向为桃种质资源与遗传育种研究，E-mail：基金项目：中国农业科学院科技创新工程专项经费项目（CAAS-ASTIP-2021-ZFRI-01）Foundation project：The Agricultural Science and Technology Innovation Program（CAAS-ASTIP-2021-ZFRI-01）3 期王蛟等：PpMYB10.1启动子483 bp缺失与红肉桃果肉颜色形成关系的研究红肉桃是一类特殊的桃种质资源，因果肉呈红色或紫红色，故也称血桃1。红肉桃富含花色素苷等抗氧化成分，具有清除体内自由基、抗肿瘤、防止心血管硬化等功效2。另外，不同红肉桃品种，花色素苷含量也表现出高低差异3。诸如此类特性，红肉桃被众多消费者所青睐，亦被育种专家作为重点选育对象。红肉桃根据花色素苷大量积累时间，可以划分成两种类型。第一种是成熟期积累型，代表品种有大红袍、天津水蜜等4；第二种是发育中期积累型，代表品种有大果黑桃、哈露红等。成熟期积累型的红肉桃，广泛应用于栽培及育种中，如湖北省农业科学院利用曙光（黄肉）与红肉桃18（红肉）作为亲本，选育出早熟红肉桃品种早仙红5。该类型的红肉，由主效基因PpBL控制，其启动子上的6688 bp转座子插入，是该类型红肉形成的关键变异6。PpBL与PpNAC1形成二聚体，上调调控基因PpMYB10.1转录因子的表达，之后PpMYB10.1又与另外一个转录因子PpbHLH3形成二聚体，上调花色素苷合成通路上的关键结构基因PpDFR与PpGUGT，最终导致花色素苷含量上升，果肉呈现红色7。成熟期积累型的红肉桃，根据花色素苷含量，又可分为深红、红及浅红等不同梯度，极大地丰富了红肉桃的供应类型。Hara-Kitagawa 等6认为PpMYB10.1启动子上游的5243 bp转座子插入，对红肉桃果肉颜色变浅具有一定作用。PpMYB10.1启动子上还存在一段483 bp缺失序列7，该变异是否也参与红肉桃红色深浅形成，以及它们具有什么样的调控机制，目前尚不明确。本研究以红色深浅不等的红肉桃为材料，利用分子生物学手段，研究其形成机制，为高效选育红色深浅不同的红肉桃品种提供理论依据。1材料与方法1.1试验材料用于试验的红色深浅不同的10份红肉种质，均属于成熟期大量积累花色素苷的红肉桃，分别为天津水蜜、园春白、武汉大红袍、微尖红肉、万州酸桃、红桃、大红袍、谷城大红袍、望谟小米桃、武汉2号，以上材料树龄14年，定植于中国农业科学院郑州果树研究所国家桃种质资源圃（郑州）。果肉拍照及样品采集于果实完全成熟时进行，具体为挑选树冠外围35个果实，横切拍照，并切取果皮与果核之间的果肉，迅速置于液氮，完全冷冻后用锡箔纸包裹，置于80 冰箱。1.2桃果肉花色素苷提取与测定花色素苷提取与测定参考赵慧芳等8方法。将冷冻的桃果肉样品研磨成粉末，称取2.0 g，以1 4的料液比例，加入1%的HCL-乙醇溶液（V盐酸 V无水乙醇=1 99），于25 提取2次，每次提取时间为60 min。提取液4000 r/min离心10 min，取上清液定容至100 mL，以测定花色素苷含量。花色素苷含量采用示差法测定。吸取2 mL上述上清液，分别用pH=1.0（0.2 mol/L KCL 0.2 mol/L HCl=25 67）与pH=4.5（0.2 mol/L NaAc 3H2O 0.2 mol/L HAc=1 1）的缓冲液稀释至20 mL，20 mL（2 mL 1%HCl-乙醇+18 mL缓冲液）作为空白对照。缓冲液分别在510 nm与700 nm处测定吸光值A510、A700，利用以下公式计算花色素苷含量。A=(A510 A700)PH1.0(A510 A700)PH4.5ACY=(A 449.2 10 V)/26900 m 100A：吸光值；ACY：花色素苷总含量；V：提取液的总体积；m：取样量；449.2：矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔分子质量；26900：矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数。1.3载体构建为了检测启动子活性，两段PpMYB10.1启动子序列（1126 bp、1609 bp）合成（北京六合华大基因科技有限公司，北京，中国）并连接到pBI121表达载体 多 克 隆 位 点（MCS）区，以 构 建 重 组 载 体：proPpMYB10.1（1126 bp）GUS 及 proPpMYB10.1（1609 bp）GUS，CaMV35S GUS为阳性对照9。为了检测转录因子与下游基因启动之间的互作关系，首先将PpMYB10.1两段启动子（1126 bp与1609 bp）序列合成并连接到pGreen0800LUC载体上，连接位置位于报告基因 LUC 上游10-11，以构建重组载体：proPpMYB10.1（1126 bp）LUC及proPpMYB10.1（1609 bp）LUC，MCS GUS 为阴性对照；之后将PpBL、Prupe.2G302800、PpNAC1 的 CDS 区克隆并A：天津水蜜；B：万州酸桃；C：大红袍A：Tianjin Shui Mi；B：Wanzhou Suan Tao；C：Da Hong Pao图1红肉桃不同红色深浅Fig.1Different intensities of the red-flesh color759植物遗传资源学报24 卷连接到pBI121载体上，连接位置位于 CaMV35S启动子下游，以构建重组载体：CaMV35S PpBL，CaMV35S Prupe.2G302800，CaMV35S PpNAC1，CaMV35S GUS为阳性对照。克隆基因CDS区需要的引物见表1。1.4桃果肉GUS染色为了明确启动子上的483 bp缺失对PpMYB10.1转录活性的影响，将构建好的过表达载体转化到农杆菌感受态细胞GV3101中，28 培养2 d。从平板上挑取单菌落，悬浮于1.0 mL LB培养基中（含50 mg/mL卡那霉素），28 培养10 h。从中吸取10 L，转移到15 mL LB培养基中（含50 mg/mL卡那霉素），28 摇床培养812 h。之后，5000 rpm离心10 min，收集菌体，并用侵染缓冲液（0.5 mol/L MES，1.0 mmol/L MgCL2，1.0 umol/L As）将菌体 OD 值调到 0.40.6。调好的菌液悬浮物于室温静置23 h，用真空离心浓缩器压入新鲜桃果肉。暗处理1624 h，见光培养24 h后，用GUS试剂盒（华越洋生物科技有限公司，北京，中国）染色。1.5DNA-Pulldown试验为了鉴定结合于483 bp上的转录抑制因子，将该序列设计为探针，并在河南瑞英生物技术有限公司（河南，中国）合成。果实核蛋白用蛋白提取试剂盒提取（生工生物工程股份有限公司，上海，中国）。（1）将200 pmol生物素标记的探针DNA与核酸孵育液混合，配置成500 L的体系，再与链霉亲和磁珠一起孵育1h，磁力架上磁力分离吸取上清液，用于后续挂珠效率检测。（2）用预冷的核酸孵育缓冲液洗涤2次，蛋白孵育缓冲液洗涤2次，放置磁力架上分离，并提取上清液。（3）将蛋白提取物与蛋白孵育缓冲液配置成500 L体系，与DNA-磁珠复合物4 孵育过夜，以形成蛋白-DNA-磁珠复合物。（4）将该复合物放置磁力架上磁力分离，以尽可能去除上清，用预冷的蛋白孵育缓冲液冲洗磁珠67次，收集沉淀。（5）加入100 L蛋白洗脱液，95 水浴5 min，12000 r/min离心5 min，吸取上清液。从上清液中吸取510 uL，置于聚丙烯酰胺凝胶点样孔中，电泳检测试验组与对照组中蛋白种类差异（试验组是蛋白-DNA-磁珠复合物，对照组是蛋白-磁珠复合物）。之后，上清液用于质谱鉴定，以确定蛋白液中蛋白质数量及理化性质。1.6双荧光素酶试验为了验证质谱鉴定到的转录因子对PpMYB10.1的抑制活性，将上述1.3构建的重组载体proPpMYB10.1（1126）LUC 及 proPpMYB10.1（1609）LUC 侵染A.tumefaciens GV3101，其OD值经检测并调至0.6；将 重 组 载 体 CaMV35S PpBL，CaMV35S Prupe.2G302800，CaMV35S PpNAC1，CaMV35S GUS 也侵染A.tumefaciens GV3101，其OD值经检测并调至1.1。之后，将上述两类重组载体以1 5的体积比混匀，静置30 min，用注射器注入烟草叶片中。暗处理1624 h，见光培养24 h，之后，将叶片浸入双荧光素钠盐缓冲液（生工生物工程股份有限公司，上海，中国），10 min后取出，放入成像系统（上海天能科技有限公司，上海，中国）获取LUC强度值。表1双荧光素酶及酵母双杂交试验用到的引物Table1Primers used in dual luciferase and Yeast two-hybrid assay引物名称Primer namePpBL FPpBL RPpNAC1 FPp NAC1 RPrupe.2G302800 FPrupe.2G302800 RPpBL F1PpBL R1Prupe.2G302800 F1Prupe.2G302800 R1PpMYB10.1 FPpMYB10.1 RPpTEF2 FPpTEF2 R引物序列（5-3）Primer sequence（5-3）acgggggactctagaggatccATGTTGGGAATGGAAGACGCAcgatcggggaaattcgagctcTTACTTAGCATCCATGATATAATCCAacgggggactctagaggatccATGGAGAGCACCGACTCCTCcgatcggggaaattcgagctcCTATCCCAAATTGGACTCAGacgggggactctagaggatccATGGCTTCCGATCTCGAAAAcgatcggggaaattcgagctcTTAGTACTCCCATTTCTTCAtggccatggaggccgaattcATGTTGGGAATGGAAGACGCAccgctgcaggtcgacggatccTTACTTAGCATCCATGATATAATCCAggccatggaggccagtgaattcATGGCTTCCGATCTCGAAAActcgagctcgatggatcccgtTTAGTACTCCCATTTCTTCAGAAATGATTGGTGGGAAACCGTCCTTCTTCTGAAACATTGGTGATTCCGGTGCCCAGAAGTCCAGCAGCTTCCATTCCAA应用Applicaton载体构建（pBI121）载体构建（pBI121）载体构建（pBI121）载体构建（pBI121）载体构建（pBI121）载体构建（pBI121）载体构建（pGBDT7）载体构建（pGBDT7）载体构建（pGADT7）载体构建（pGADT7）实时定量PCR实时定量PCR实时定量PCR实时定量PCR引物中小写字母代表载体上的序列，大写字母代表基因上的序列The small letters represent sequences on the vector and the capital letters represent sequences on the genes7603 期王蛟等：PpMYB10.1启动子483 bp缺失与红肉桃果肉颜色形成关系的研究1.7酵母双杂交试验为了检测 PpBL 与质谱鉴定到的转录因子Prupe.2G302800 之间是否存在互作，将 PpBL 的CDS序列克隆并连接到pGBKT7的MCS区，引物见表 1。重组载体利用 PEG/LiAC 法转入酵母菌株Y2HGOLD（上海唯地生物技术有限公司，上海，中国），涂布于 3-AT 浓度梯度的酵母缺陷型培养基SD-Trp/X-a-GAL上，以检测PpBL的自激活活性，并确定抑制自激活的最终3-AT浓度。同样的方法，将Prupe.2G302800 的 CDS 序列连接到 pGADT7 的MCS区。重组的pGBKT7及pGADT7载体以质量比 1 2 连同变性的 Carrier DNA，转入 Y2HGOLD，轻轻混匀；之后加入300 L 1TE/LiAc/PEG，混匀；30 水浴 30 min，每 10 min 摇匀一次；每管加入20 L DMSO，轻轻混匀；42 水浴热激15 min，每5 min上下颠倒混匀一次；高速离心15 s，弃上清。用1 mL YPD Plus重悬菌体，30，250 r/min 复苏1 h；高速离心15 s，弃上清；100 L NaCl（0.9）重悬菌体，涂布于酵母缺陷型培养基SD-Trp-Leu-His-Ade/3AT/X-a-Gal 上；30 培养箱培养35 d。预计有蓝色阳性克隆长出。1.8实时荧光定量PCR果实RNA用快速试剂盒提取（北京艾德莱生物科技有限公司，北京，中国）。质检后的 RNA，取1.5 L，用反转录试剂盒反转录成cDNA（天根生化科技有限公司，北京，中国）。反应体系包含：2.0 L稀释倍数为10的cDNA，0.5 L上下游引物，10 L SYBR mix，7 L 的 ddH2O。扩增体系包含如下步骤：95 30 s；95 15 s，58 15 s，72 15 s，45个循环。内参引物基于PpTEF2设计，扩增包含3个技术重复12，引物见表1。1.9数据分析利用 NCBI 在线软件 Primer-BLAST（https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC=BlastHome）进 行 引 物 设 计；利 用Excel2007对定量数据进行处理；利用Prism软件做柱形图及韦恩图；利用PhotoshopCS6对不同类型的图片进行组合。2结果与分析2.1PpMYB10.1启动子活性截短检测与参考基因组相比13，PpMYB10.1启动子上存在两个变异，一个是483 bp的缺失，位于ATG上游554 bp的位置，另一个是5243 bp的转座子插入，位于ATG上游-1609 bp的位置14。前期发现这两处变异的基因型与果肉红色深浅具有很好的对应性，如当这两处变异分别表现为D1D1与T1T1时，果肉呈现深红色，当分别为D1D2与T1T1时，果肉呈现红色，当分别为D2D2与T1T1时，果肉呈现浅红色，当分别为D2D2与T1T2或T2T2时，果肉颜色为浅白色或白色（结果未发表）。其中，单倍型D1表示有483 bp缺失，单倍型D2表示没有483 bp缺失，单倍型T1表示没有5243 bp插入，单倍型T2表示有5243 bp插入。为了进一步探究两处变异对红肉桃红色深浅的影响，首先对深红、红、浅红对应的PpMYB10.1表达量及花色素苷含量进行测定。结果表明，深红果肉对应的PpMYB10.1表达量及花色素苷含量最高，分别为4.20及69.960 mg/100 g，红色果肉次之，分别为1.873.29及8.50116.003 mg/100 g，浅红果肉第三，分别为0.941.34及1.8865.769 mg/100 g（图2A、B）。随后，对其中之一的483 bp的缺失序列进行了验证。共设计了两段启动子序列，第一段不包含483 bp缺失序列，长度为1126 bp（图2C），另一段包含483 bp，长度为1609 bp（图2C）。两段序列分别替换pBI121表达载体GUS上游的CAMV35S启动子序列，构建2个携带GUS的表达载体proPpMYB10.1（1126 bp）GUS与proPpMYB10.1（1609 bp）GUS，并瞬时转化桃果肉，以鉴定两段序列的启动活性。结果表明，携带有proPpMYB10.1（1609 bp）GUS的果肉，染色蓝色明显弱于proPpMYB10.1（1126 bp）GUS（图2C），表明不包含483bp的启动子序列具有较强的启动活性，而包含该缺失序列的启动子，其启动活性较弱。2.2483 bp序列影响PpMYB10.1启动子活性分析PpBL与PpNAC1形成二聚体，上调PpMYB10.1转录7，以此推测 483 bp 序列的存在可能影响二聚体结合启动子的性能，导致转录活性下降，使 PpMYB10.1 表达量降低。为了验证该猜测，将PpBL与PpNAC1的CDS序列连接到pBI121表达载体上，替换 CAMV35S（为了便于表述，下文中CAMV35S简写为35S）下游的GUS序列，以构建重组载体35S PpBL及35S PpNAC1。将携带及未携带483 bp的1126 bp及1609 bp的启动子序列分别与pGreen0800LUC报告基因LUC连接，构建重组载体proPpMYB10.1（1609 bp）LUC 与 proPpMYB10.1（1126 bp）LUC。重组载体分别转化农杆菌GV3101，之后共侵染烟草。结果表明，具有35S PpBL+35S 761植物遗传资源学报24 卷PpNAC1+proMYB10.1（1126 bp）LUC的注射位点的LUC活性几乎与35S PpBL+35S PpNAC1+proMYB10.1（1609 bp）LUC相当（图3A），初步表明PpBL/PpNAC1对两段启动子的激活能力几乎一样。启动子的低启动活性，一般与结合其上的转录抑制子密切相关15。上文中483 bp序列的存在，能够导致启动子活性减弱，表明在果肉中，该段序列可能有转录抑制因子结合。为了验证该猜测，将483 bp序列设计成探针，并标记上脱硫生物素标记，与红肉桃果肉核蛋白孵育，以鉴定结合其上的调控蛋白。结果表明，在蛋白洗脱液处理的蛋白上清液中，试验组在蛋白分子量为 4566.2 KDa 及 2535 KDa的区间内，较对照组有明显条带，说明483 bp的DNA探针捕获了与之结合的蛋白。之后，将蛋白上清液经过质谱鉴定分析，共获得15个目标蛋白（图3、表2），其中Prupe.4G232600（WRKY转录因子）、Prupe.2G302800及Prupe.6G284800根据功能注释，可能具有抑制功能，三者被用于之后的功能验证。2.3候选基因功能验证双荧光素酶试验被用来验证3个候选基因的转录抑制活性。Prupe.4G232600、Prupe.2G302800及Prupe.6G284800 的 CDS 替换 pBI121 表达载体的GUS序列，由35S启动子调控（35S Prupe.4G232600、35S Prupe.2G302800及35S Prupe.6G284800）。重组载体与 proPpMYB10.1（1609 bp）LUC 分别转化农杆菌GV3101，之后共侵染烟草。结果表明，在烟草叶片中，具有35S Prupe.4G232600+proMYB10.1（1609 bp）及 35S Prupe.2G302800+proMYB10.1A：红色深浅不一的红肉桃果肉中花色素苷含量测定，不同小写字母表示不同品种花色素苷含量在P0.05水平上差异显著，1：大红袍；2：谷城大红袍；3：望谟小米桃；4：园春白；5：武汉大红袍；6：红桃；7：天津水蜜；B：红色深浅不一的红肉桃果肉中PpMYB10.1表达量测定，不同小写字母表示不同品种PpMYB10.1表达量在P0.05水平上差异显著；1：大红袍；2：谷城大红袍；3：望谟小米桃；4：武汉2号；5：园春白；6：武汉大红袍；7：微尖红肉；8：万州酸桃；9：红桃；10：天津水蜜；C：483 bp缺失序列对PpMYB10.1启动子活性影响检测，黑色直线表示不同长度的PpMYB10.1启动子，CAMV35S启动子为阳性对照，红色方框代表483 bp缺失序列，果盘蓝色越深，表明启动子活性越强A：Detection of anthocyanin content in different intensities of the red-flesh color peach，different small letters indicate the significant differences of anthocyanin content in different varieties at P0.05 level，1：Da Hong Pao；2：Gucheng Da Hong Pao；3：Wangmo Xiao Mi Tao；4：Yuan Chun Bai；5：Wuhan Da Hong Pao；6：Hong Tao；7：Tianjin Shui Mi；B：Relative expression of PpMYB10.1 in different intensities of the red-flesh color peach，different small letters indicate the significant differences of PpMYB10.1 expression in different varieties at P0.05 level，1：Da Hong Pao；2：Gucheng Da Hong Pao；3：Wangmo Xiao Mi Tao；4：Wuhan 2；5：Yuan Chun Bai；6：Wuhan Da Hong Pao；7：Wei Jian Hong Rou；8：Wanzhou Suan Tao；9：Hong Tao；10：Tianjin Shui Mi；C：Detection of influence of 483 bp deletion in PpMYB10.1 promoter on its priming activity，black lines indicate different length promoter sequence of PpMYB10.1，CAMV35S promoter is used as a positive control，red rectangle indicates 483 bp deletion，promoter activity increases with increasing blue color intensity of peach fruit discs图2PpMYB10.1启动子上两处变异对其启动活性影响检测Fig.2Validation of influence of two variations in PpMYB10.1 promoter on priming activity7623 期王蛟等：PpMYB10.1启动子483 bp缺失与红肉桃果肉颜色形成关系的研究（1609 bp）的注射位点，其LUC活性高于对照35S GUS+proMYB10.1（1609 bp）。而具有35S Prupe.6G284800+proMYB10.1（1609 bp）注射位点的 LUC活性几乎与对照35S GUS+proMYB10.1（1609 bp）相当（图4）。这些表明，3个候选基因对PpMYB10.1启动子不具有抑制活性。A：PpBL/PpNAC1对PpMYB10.1启动子（携带与未携带483 bp）激活能力检测，黑色直线表示不同长度的PpMYB10.1启动子，MCS序列为阴性对照，红色方框代表483 bp缺失序列；B：果实核蛋白聚丙烯酰胺凝胶图；C：质谱分析鉴定到的果实核蛋白，15及5分别是试验组及对照组鉴定到的核蛋白数量，386是试验组与对照组共有的核蛋白数量A：Detection of PpBL/PpNAC1 activation to PpMYB10.1 promoter（with and without 483 bp sequence），black lines indicate different length promoter sequence of PpMYB10.1，MCS sequence is used as negative control，red rectangle indicates 483 bp deletion；B：Polyacrylamide gel diagram of fruits nuclear protein in test and control groups；C：Fruit nuclear proteins identified through mass spectrometry，15 and 5 are the number of nuclear proteins identified by the test group and the control group，respectively，386 is the number of nuclear proteins shared by the test group and the control group图3483 bp序列影响PpMYB10.1转录机制分析Fig.3Influence of 483 bp deletion on PpMYB10.1 transcription表2通过DNA-pulldown鉴定到的果实核蛋白Table 2Fruit nuclear proteins captured through DNA-pull down assay蛋白质登录号AccessionA0A251MZG7M5XHN6M5W271A0A251R8E8M5X1T4A0A251PT15M4QFW7M5W5T0M5X2Q0A0A251R812M5WTZ0M5X1L2A0A251NBV4Q38JC5M5VZS0基因编号Gene IDPrupe.8G176700Prupe.1G253600Prupe.7G227300Prupe.1G360400Prupe.2G232500Prupe.4G232600Prupe.2G162400Prupe.6G284800Prupe.4G074900Prupe.1G352200Prupe.4G038700Prupe.2G302800Prupe.7G153600Prupe.7G259600Prupe.6G076300蛋白质分子量（kDa）MW38.815.145.922.138.559.428.112.119.543.534.940.759.221.527.3注释信息Description未知特征的蛋白未知特征的蛋白未知特征的蛋白未知特征的蛋白具有还原型辅酶 dom结构域的蛋白质WRKY20转录因子转录因子磷酸甘露糖变位酶2巨噬细胞移动抑制因子同源物巨噬细胞移动抑制因子同源物COPZ1蛋白-半乳糖苷酶具有PKS_ED结构域的蛋白质SPK1的的G2等位基因抑制因子等位基因抑制因子琥珀酸脱氢酶（辅酶Q）黄素蛋白亚基受温度诱导的脂质运载蛋白未知特征的蛋白加粗的条目表示用于之后验证的候选基因The terms bold represent candidate genes for further validation763植物遗传资源学报24 卷在烟草叶片中，具有35S Prupe.2G302800+35S PpBL+35S PpNAC1+proMYB10.1（1609 bp）的农杆菌注射位点，LUC 活性明显低于 35S GUS+35S PpBL+35S PpNAC1+proMYB10.1（1609 bp），这表明Prupe.2G302800可能对PpBL或PpNAC1具有抑制作用（图5A）。之后，将Prupe.2G302800克隆并连接到载体pGADT7上，PpBL连接到pGBKT7上，二者共转化Y2HGOLD。结果表明，携带此二者的酵母菌株，在SD-Trp-Leu-His-Ade/3AT/X-a-Gal缺失培养基上长出蓝色菌斑，表明 Prupe.2G302800 可以与PpBL发生互作（图5B，详见https：/doi.org/10.13430/ki.jpgr.20220909001，附图 1）。因为 PpBL 是红肉桃形成的关键基因，也是上调PpMYB10.1的主要转录因子，所以结合以上结果，推测Prupe.2G302800可以与PpBL结合，并抑制其转录活性，进而减弱PpBL/PpNAC1对PpMYB10.1的转录激活能力。A：pBI121及pGreen0800LUC重组载体构建及PpBL/PpNAC1对PpMYB10.1启动子激活能力检测；B：Prupe.2G302800与PpBL互作分析A：Recombinant vector construction of pBI121 and pGreen0800LUC，and detection of PpBL/PpNAC1 activation ability to PpMYB10.1promoter at injection sites with and without Prupe.2G302800 products；B：Detection of interaction between Prupe.2G302800 and PpBL图5Prupe.2G302800功能分析Fig.5Prupe.2G302800 functional analysis图43个候选基因对PpMYB10.1抑制活性检测Fig.4Suppression of three candidate genes to PpMYB10.1 transcription7643 期王蛟等：PpMYB10.1启动子483 bp缺失与红肉桃果肉颜色形成关系的研究3讨论花色素苷是黄酮类合成途径的终产物，由许多酶催化合成，如苯丙氨酸3裂解酶（PAL），肉桂酸-4-羟化酶（C4H），查尔酮合成酶（CHS），查尔酮异构酶（CHI），黄酮醇-3 羟化酶（F3 H），二羟基黄酮醇还原酶（DFR）及类黄酮-3-O-糖基转移酶（UFGT）16。编码这些酶的基因，在转录水平上受到转录激活因子与抑制因子调控17。转录因子通常具有特殊的结构域，结合下游结构基因的启动子，进而启动转录调控。例如，拟南芥中的转录抑制子MYBL2及矮牵牛中的 MYBx，在碳末端均具有抑制结构域TLLLFR，下调花色素苷主要结构基因表达18。AtMYB4不仅可以结合自己的启动子序列，以抑制自身表达，而且能够与AtMYB12竞争性结合黄酮醇途径基因启动子上的顺式作用元件，以形成负反馈调节19-20。桃果肉中主要花色素苷为矢车菊-3-葡萄糖苷，个别品种也有矢车菊-3-芸香糖苷3，21