我国华东与华南地区养殖鱼类迟缓爱德华氏菌分离株的多样性分析.pdf

,()中 国 人 兽 共 患 病 学 报C h i n e s eJ o u r n a l o fZ o o n o s e sD O I:/j i s s n 实验研究我国华东与华南地区养殖鱼类迟缓爱德华氏菌分离株的多样性分析李素一,池洪树,陈斌,张晓佩,许斌福,福建省重大专项(N o N Z 、N o N Z );福建省公益类科研院所专项(N o R 、N o R )联合资助通讯作者:许斌福,E m a i l:x b f c x j c o m;O R C I D:作者单位:福建省农业科学院生物技术研究所,福州 ;福 建 省 水 产 病 害 防 控 工 程 技 术 研 究 中 心,福 州 ;福建省淡水水产研究所,福州 ;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福州 摘要:目的对 株来源于我国华东与华南地区的养殖鱼类迟缓爱德华氏菌(E d w a r d s i e l l at a r d a)分离株进行多样性分析.方法通过菌体血清凝集试验及 Sr R NA与h s p 部分基因序列的聚类分析.结果菌体血清凝集试验结果显示,鳗源迟缓爱德华氏菌E T Y的抗O血清可凝集大部分鱼源迟缓爱德华氏菌;人源迟缓爱德华氏菌标准株A T C C 的抗O血清仅与鱼源迟缓爱德华氏菌WY 有交叉凝集;鲶鱼爱德华氏菌E I V的抗O血清与鱼源迟缓爱德华氏菌无交叉凝集.株鱼源迟缓爱德华氏菌A L NA 和E L与以上种爱德华氏菌抗O血清不发生凝集反应.基于 Sr R NA及h s p 部分基因序列构建的系统发育进化树显示,来源于不同地区的绝大部分鱼源迟缓爱德华氏菌分离株进化同源性较高,在基于 Sr R NA构建的系统进化树中,山东地区分离自大菱鲆的迟缓爱德华氏菌聚为一支.株鱼源迟缓爱德华氏菌A L NA、E L、G K 与人源迟缓爱德华氏菌A T C C 及人源鲶鱼爱德华氏菌E I V有一定亲缘关系.结论我国华东、华南地区的鱼源迟缓爱德华氏菌分离株普遍具有相似的血清型和较高的进化同源性,并与人源的迟缓爱德华氏菌、人源的鲶鱼爱德华氏菌有明显差异.个别鱼源迟缓爱德华氏菌血清型与分子系统进化分析结果不一致,提示在防控鱼类爱德华氏菌病时,应将菌体表面抗原的免疫原性与分子聚类分析相结合.关键词:迟缓爱德华氏菌;血清型;Sr R NA;h s p;系统进化树中图分类号:R ,S 文献标识码:A文章编号:()D i v e r s i t ya n a l y s i so fE d w a r d s i e l l at a r d ai s o l a t e s f r o mc u l t u r e df i s hi nE a s t e r na n dS o u t h e r nC h i n aL IS u y i,CH IH o n g s h u,CHE NB i n,Z HANGX i a o p e i,XUB i n f u,(I n s t i t u t eo fB i o t e c h n o l o g y,F u j i a nA c a d e m yo fA g r i c u l t u r a lS c i e n c e s,F u z h o u ,C h i n a;F u j i a nE n g i n e e r i n gT e c h n o l o g yR e s e a r c hC e n t e ro fA c q u a c u l t u r eD i s e a s eC o n t r o la n dP r e v e n t i o n,F u z h o u ,C h i n a;F r e s h w a t e rF i s h e r i e sR e s e a r c hI n s t i t u t eo fF u j i a nP r o v i n c e,F u z h o u ,C h i n a;I n s t i t u t eo fA n i m a lH u s b a n d r ya n dV e t e r i n a r yM e d i c i n e,F u j i a nA c a d e m yo fA g r i c u l t u r a lS c i e n c e s,F u z h o u ,C h i n a)A b s t r a c t:T h i ss t u d yw a sa i m e da t a n a l y z i n gt h ed i v e r s i t yo f i s o l a t e so fE d w a r d s i e l l a t a r d af r o mc u l t u r e df i s ho r i g i n a t i n gf r o m E a s t e r na n dS o u t h e r nC h i n a T h em e t h o d si n c l u d e db a c t e r i a ls e r u ma g g l u t i n a t i o nt e s t sa n dc l u s t e ra n a l y s i so f Sr R NAa n dp a r t i a l g e n es e q u e n c e so fh s p B a c t e r i a l s e r u ma g g l u t i n a t i o nt e s t sr e v e a l e dt h a t t h eOa n t i g e ns e r u mo fEt a r d aE T Y(f r o mA n g u i l l aj a p o n i c a)a g g l u t i n a t e dm o s t f i s h d e r i v e dEt a r d a I nc o n t r a s t,t h eOa n t i g e ns e r u mo f h u m a n d e r i v e dEt a r d aA T C C c r o s s a g g l u t i n a t e dw i t ho n l y f i s h d e r i v e dEt a r d aWY T h eOa n t i g e ns e r u mo fE d w a r d s i e l l ai c t a l u r iE I Vd i dn o tc r o s s a g g l u t i n a t e w i t hf i s h d e r i v e dEt a r d aN o t a b l y,t w of i s h d e r i v e dEt a r d as t r a i n s,A L NA a n dE L,d i dn o te x h i b i ta g g l u t i n a t i o nr e a c t i o n sw i t ht h eOa n t i g e ns e r u m o ft h et h r e ea b o v eE d w a r d s i e l l as t r a i n s F u r t h e r m o r e,t h ep h y l o g e n e t i ct r e ec o n s t r u c t e do nt h eb a s i so f Sr R NAa n dp a r t i a lg e n es e q u e n c e so fh s p r e v e a l e d t h a tm o s t f i s h d e r i v e dEt a r d ai s o l a t e sf r o md i f f e r e n tr e g i o n se x h i b i t e dh i g hh o m o l o g y N o t a b l y,t h eEt a r d ai s o l a t e so b t a i n e df r o mt u r b o t i nS h a n d o n gp r o v i n c ee x h i b i t e dc l u s t e r i n gw i t h i nt h e Sr R NA b a s e dp h y l o g e n e t i ct r e e A d d i t i o n a l l y,t h r e e f i s h d e r i v e dEt a r d as t r a i n s,A L NA,E L,a n dG K,d i s p l a y e dag e n e t i cr e l a t i o n s h i pw i t hh u m a n d e r i v e dEt a r d aA T C C a n dh u m a n d e r i v e dEi c t a l u r iE I V I nc o n c l u s i o n,f i s h d e r i v e dEt a r d ai s o l a t e sf r o mE a s t e r na n dS o u t h e r nC h i n ag e n e r a l l ye x h i b i ts i m i l a r i t i e si ns e r o t y p e sa n ds h a r eh i g hh o m o l o g y N o t a b l y,t h e yd i f f e rs i g n i f i c a n t l yf r o mh u m a n d e r i v e dEt a r d aa n dh u m a n d e r i v e dEi c t a l u r i S o m ef i s h d e r i v e dEt a r d as e r o t y p e sd on o ta l i g nw i t ht h er e s u l t so fm o l e c u l a rp h y l o g e n e t i ca n a l y s i s,t h u su n d e r s c o r i n gt h e i m p o r t a n c eo f c o m b i n i n gt h e i mm u n o g e n i c i t yo fb a c t e r i a ls u r f a c ea n t i g e n sw i t hm o l e c u l a r l e v e l c l u s t e ra n a l y s i s i ne f f o r t s t oc o n t r o l e d w a r d s i e l l o s i s i nf i s hK e y w o r d s:E d w a r d s i e l l at a r d a;s e r o t y p e;Sr R NA;h s p;p h y l o g e n e t i c t r e eS u p p o r t e db yt h eM a j o rP r o j e c t so fF u j i a nP r o v i n c e(N o N Z 、N o N Z ),S p e c i a lP r o j e c to fF u j i a nP u b l i cW e l f a r eS c i e n t i f i cR e s e a r c hI n s t i t u t e s(N o R 、N o R )C o r r e s p o n d i n ga u t h o r:X uB i n f u,E m a i l:x b f c x j c o m爱德华氏菌属(E d w a r d s i e l l a)为肠杆菌科革兰氏阴性杆菌,是人兽共患的重要致病菌,传统上分为迟缓爱德华氏菌(E d w a r d s i e l l at a r d a)、鲶鱼爱德华氏菌(E d w a r d s i e l l ai c t a l u r i)和保科爱德华氏菌(E d w a r d s i e l l ah o s h i n a e)个种 .其中,迟缓爱德华氏菌和鲶鱼爱德华氏菌是水产动物的主要致病菌,保科爱德华氏菌是鸟类和爬行动物的致病菌.鲶鱼爱德华氏菌只感染鱼类,可引起鲶鱼的肠道败血症.而迟缓爱德华氏菌(Et a r d a)具有广泛的宿主适应性,能感染淡水海水养殖鱼类、爬行动物、两栖动物和哺乳类等多种动物;流行性广、易暴发、危害大,是水产上常见的致病菌 .鱼类迟缓爱德华氏菌是大菱鲆、鳗鲡等多种重要经济鱼类的首要病原之一,一旦暴发感染往往导致鱼类的大量死亡,危害极其严重 ;同时该菌也可感染人类,引起细菌性胃肠炎、腹泻、败血症等,威胁着人类的公共卫生安全 .爱德华氏菌分布广泛,宿主多样,因此多样性分析对了解爱德华氏菌菌群的种属关系或变异情况、掌握其流行规律、研发疫苗、制定精准的免疫防控策略具有重要的指导意义.迟缓爱德华氏菌的分型传统上以生理生化和血清分型为主,随着基因测序技术的产生,Sr R NA、h s p 等基因测序分析的方法逐步应用到迟缓爱德华氏菌的鉴定与分型中.传统的血清型分析主要是基于菌体表面抗原与特异性血清抗体发生凝集反应来进行鉴定分型,具有特异、灵敏、快速、简便的优点,但存在无法精准对迟缓爱德华氏菌进行鉴定与分型的局限.例如陈翠珍用菌体血清凝集的方法对 株分离自牙鲆的迟缓爱德华氏菌分离株进行血清分型,结果表明均为同种血清型.研究表明,Sr R NA在漫长的进化史中高度保守,被称为是细菌进化的分子钟,联合h s p 等基因测序对迟缓爱德华氏菌进行分子层面分型分析的方法具有更高的种间与种内分辨率,能补充利用血清学分型方法的不足.本研究对本室近年来分离保存和收集的来源于我国华东地区(福建、山东、浙江)与华南的广东地区的 株迟缓爱德华氏菌进行多样性分析,以期为迟缓爱德华氏菌的区系划分提供参考,为迟缓爱德华氏菌疫苗的开发设计和免疫防控策略制定提供依据.材料与方法材料爱德华氏菌菌株本研究所用的爱德华氏菌菌株信息如表所示,其中 株由本室保存的迟缓爱德华氏菌分离株来自我国华东地区(福建、浙江、山东)及华南地区(广东),其中 株迟缓爱德华氏菌分离自鳗鲡(包括欧洲鳗鲡、日本鳗鲡、花鳗鲡),株分离自大菱鲆,株分离自鳜鱼.主要试剂及材料细菌培养基T S B、T S A购自广东环凯微生物科技有限公司,细菌D NA提取试剂盒、琼脂糖凝胶D NA回收试剂盒及质粒小量提取试剂盒购自天根生化科技有限公司,P C R引物由上海生工有限公司合成,P C R克隆试剂盒(E xT a q酶、d NT P等)、PMD T克隆载体购自大连宝生物工程有限公司(T a k a r a),宿主菌E s c h e r i c h i ac o l i(DH )由本室保存.方法细菌复苏鉴定及基因组D NA提取复苏保存于 菌株,在T S A平板上划线,培养 h,挑取单菌落于 m LT S B培养液,在 、r/m i n条件下振荡培养过夜.按接种于新的 m LT S B培养液,培养至O D .利用A P I E生化鉴定系统再次对标本迟缓爱德华氏菌分离株进行生化鉴定,确定为迟缓爱德华氏菌后,用于后续试验.收集m L细菌培养液,用天根细菌D NA提取试剂盒(D P )按操作说明提取菌株中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ,()表本研究用菌株信息T a b S t r a i n s i n c l u d e d i nt h i s s t u d y种属菌株名称分离宿主分离地点来源单位E d w a r d s i e l l at a r d aE T 日本鳗鲡福建福建省农业科学院生物技术研究所E T 日本鳗鲡福建福建省农业科学院生物技术研究所E T 花鳗鲡福建福建省农业科学院生物技术研究所E T 日本鳗鲡福建福建省农业科学院生物技术研究所E T 欧洲鳗鲡福建福建省农业科学院生物技术研究所A L NA 欧洲鳗鲡福建福建省淡水水产研究所J S NA 日本鳗鲡福建福建省淡水水产研究所E T Y日本鳗鲡浙江福建省农业科学院生物技术研究所E I B 大菱鲆山东华东理工大学L T B 大菱鲆山东中国海洋大学WY 大菱鲆山东中国海洋大学WY 大菱鲆山东中国海洋大学G h A n 脑A日本鳗鲡广东珠江水产研究所G h A n 肾A日本鳗鲡广东珠江水产研究所G h A n 肾A日本鳗鲡广东珠江水产研究所G K 鳜鱼广东珠江水产研究所E L日本鳗鲡广东珠江水产研究所A T C C 人美国华东理工大学E d w a r d s i e l l ai c t a l u r iE I V人中国福建省疾病预防控制中心基因组D NA,作为P C R扩增的模板.其余 m L培养液在 r/m i n条件下常温离心m i n收集菌体,用 m o l/LP B S(p H)洗涤,再次 r/m i n条件下常温离 心 m i n后用 m o l/LP B S(p H)重悬,制备浓度为 C F U/m L的菌液,用于菌体血清凝集试验.血清型分析参考许斌福等 的方法分别制备了迟缓爱德华氏菌AT C C 、E T Y及鲶鱼爱德华氏菌E I V的兔抗O血清.参考陈斌 等的方法,将所制备的迟缓爱德华氏菌菌液加入 孔微孔板,每孔 L,分别加入同体积倍比稀释的AT C C 、E I V、E T Y种爱德华氏菌兔抗O血清以及正常兔血清并混匀,试验设组重复,在 条件下静置温育 m i n后观察凝集结果.P C R扩增 Sr R NA与h s p 基因序列利用细菌 Sr R NA(Ss m a l l s u b u n i t r i b o s o m a lR NA)基 因 通 用 引 物 及 参 照N C B I基 因 库 中 的h s p(h e a ts h o c kp r o t e i n)基因序列,设计引物扩增迟缓爱德华氏菌的 Sr R NA及h s p 基因部分序列.根据E xT a q(T a k a r a)试剂盒使用说明配制P C R反应体系,进行P C R扩增.Sr R NA产物预期大小为 b p,h s p 基因产物预期大小约 b p.本研究使用的引物及产物大小如表所示.表 Sr R N A及h s p 基因引物T a b P r i m e r s f o r Sr R N Aa n dh s p 引物名称引物序列()产物长度/b p Sr R NA FA G AG T T T G A T C(C/A)T G G C T C A G Sr R NA RTA C G G(C/T)T A CC T T G T TA C G A C T Th s p FG G(T/G)C C(C/A/G)AA G G G(A/C/T(C/A)G(A/T/C)AA(T/C)G T h s p RA T A C C(C/T)T C(T/A/C)T C(A/T/G)A C(T/A/G)G C(G/A/T)G C期李素一,等:我国华东与华南地区养殖鱼类迟缓爱德华氏菌分离株的多样性分析P C R反应体系(L):E xT a qB u f f e rL,d NT P M i x t u r e(mm o l/L)L,E x T a qD NA聚 合 酶(U/L)L,上 下 游 引 物(mm o l/L)各L,模板L,d d HO L.Sr R NA的P C R反应程序为:m i n;m i n,m i n,m i n,个循环;m i n.h s p 的P C R反应程序为:m i n;m i n,m i n,m i n,个循环;m i n.用琼脂糖凝胶电泳检测并回收P C R产物,与PMD T克隆载体连接后转化大肠杆菌Ec o l iDH ,经P C R验证具有插入片段的阳性质粒送T a k a r a公司测序,取次平行测序结果一致的序列为最终序列,提交到G e n B a n k,获得序列登录号(表).序列分析与系统进化树的构建将所得的 Sr R NA及h s p 序列,在N C B I上B L A S T比对分析.Sr R NA序列和h s p 序列集合分别使用ME GA 进行 次B o o t s t r a p采样及多序列比对,并构建N J系统发育树.结果血清型分析菌体凝集试验显示(表),分离自浙江的日本鳗鲡迟缓爱德华氏菌E T Y的抗O血清能与大部分鱼源迟缓爱德华氏菌发生凝集反应,其中包括分离自山东地区大菱鲆的所有迟缓爱德华氏 菌 分 离 株;与 分 离 自 福 建 地 区 日 本 鳗 鲡 的E T 的凝集效价最高,为,但不与人源迟缓爱德华氏菌AT C C 凝集.AT C C 作为人源迟缓爱德华氏菌标准株,其抗O血清除了能凝集本菌外,仅与鱼源迟缓爱德华氏菌WY 产生效价较低的凝集反应.鲶鱼爱德华氏菌E I V的抗O血清只能与自身E I V菌株发生凝集,无法与其他任何鱼源或人源的迟缓爱德华氏菌发生凝集.基于 Sr R NA及h s p 序列的遗传进化分析将P C R扩增获得的E T 等 株迟缓爱德华氏菌及鲶鱼爱德华氏菌E I V的 Sr R NA序列及h s p 序列上传至N C B I,获得基因序列号,并在G e n B a n k中与已知的相关序列进行比对分析,同时从N C B I下 载 保 科 爱 德 华 氏 菌 属(Eh o s h i n a e)AT C C 、及大肠杆菌B C E 的 Sr R NA与h s p 序列作为构建系统进化树的参照(表).一共 个 Sr R NA及h s p 序列用于构建系统进化树.表各菌株与种抗O血清的凝集结果T a b A g g l u t i n a t i o nr e s u l t s f o rv a r i o u s s t r a i n sw i t ht h r e eOa n t i g e ns e r a菌株名称抗O血清E T Y AT C C E I V来源E T 日本鳗鲡E T 日本鳗鲡E T Y 日本鳗鲡E T 花鳗鲡E T 日本鳗鲡E I B 大菱鲆G h A n b r a i n A日本鳗鲡G h A n k i d n e y A日本鳗鲡G h A n k i d n e y A日本鳗鲡GK 鳜鱼E L日本鳗鲡A L NA 欧洲鳗鲡J S NA 日本鳗鲡L T B 大菱鲆WY 大菱鲆WY 大菱鲆E T 欧洲鳗鲡AT C C 人E I V(Ei c t a l u r i)人表用于构建系统进化树的菌株 Sr R N A及h s p T a b Sr R N Aa n dh s p s e q u e n c e s f o rc o n s t r u c t i n gp h y l o g e n e t i c t r e e菌株名称种属N C B I登录号 Sr R NAh s p E T E d w a r d s i e l l at a r d aK C K C E T E d w a r d s i e l l at a r d aK C K C E T E d w a r d s i e l l at a r d aK C K C E T E d w a r d s i e l l at a r d aK C K C 中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ,()表(续)菌株名称种属N C B I登录号 Sr R NAh s p E T E d w a r d s i e l l at a r d aK C K C A L NA E d w a r d s i e l l at a r d aK C K C J S NA E d w a r d s i e l l at a r d aK C K C E T YE d w a r d s i e l l at a r d aGQ K C E I B E d w a r d s i e l l at a r d aC P C P L T B E d w a r d s i e l l at a r d aE U K C WY E d w a r d s i e l l at a r d aE U K C WY E d w a r d s i e l l at a r d aE U K C G h A n b r a i n AE d w a r d s i e l l at a r d aK C K C G h A n k i d n e y AE d w a r d s i e l l at a r d aK C K C G h A n k i d n e y AE d w a r d s i e l l at a r d aK C K C G K E d w a r d s i e l l at a r d aK C K C E LE d w a r d s i e l l at a r d aK C K C A T C C E d w a r d s i e l l at a r d aC P K C E I VE d w a r d s i e l l ai c t a l u r iK C K C A T C C E d w a r d s i e l l ah o s h i n a eC P C P B C E E s c h e r i c h i ac o l iC P C P 基于 Sr R NA序列构建的系统进化树如图显示,绝大部分鱼源迟缓爱德华氏菌进化同源性较高,其中来源于山东大菱鲆的迟缓爱德华氏菌分离株 聚 为 一 支;来 源 于 福 建 的 迟 缓 爱 德 华 氏 菌E T 、E T 、E T 、E T 、E T 、J S NA、来源于浙江的迟缓爱德华氏菌E T Y、来源于山东的迟缓爱德华氏菌E I B 、L T B、WY 、WY 及来源于广东的迟缓爱德华氏菌G h A n b r a i n A、G h A n k i d n e y A、G h A n k i d n e y A相 聚 类;来 源 于 福 建 的A L NA 与来源于广东的E L、GK 及人源迟缓爱德华氏菌AT C C 相聚,而鲶爱德华氏菌E I V及保科爱德华氏菌AT C C 与鱼源迟缓爱德华氏菌有一定的进化距离.图显示,基于h s p 部分序列构建的菌株系统发育进化树结果显示:株来源于福建的迟缓爱德 华 氏 菌(E T 、E T 、E T 、E T 、E T 、J S NA)、株来源于浙江的迟缓爱德华氏菌E T Y、株来源于山东的迟缓爱德华氏菌(E I B 、L T B、WY 、WY )及株来源于广东的迟缓爱德华氏菌(G h A n b r a i n A、G h A n k i d n e y A、G h A n k i d n e y A)相 聚 类.来 源 于 福 建 的 迟 缓 爱 德 华 氏 菌注:从左到右排列依次是菌株名称、宿主来源、分离地区.图基于 Sr R N A序列的系统进化树F i g P h y l o g e n e t i c t r e eb a s e do n Sr R N As e q u e n c e sA L NA 与 来 源 于 广 东 的 迟 缓 爱 德 华 氏 菌E L、GK 及人源迟缓爱德华氏菌AT C C 相聚.这两个结果与 Sr R NA系统发育进化树一致.有差异的是,鲶鱼爱德华氏菌E I V与迟缓爱德期李素一,等:我国华东与华南地区养殖鱼类迟缓爱德华氏菌分离株的多样性分析注:从左到右排列依次是菌株名称、宿主来源、分离地区.图基于h s p 部分序列的系统进化树F i g P h y l o g e n e t i c t r e eb a s e do np a r t i a l s e q u e n c e so fh s p 华氏菌GK 聚 为 一 支.此 外,保 科 爱 德 华 氏 菌AT C C 与所有的迟缓爱德华氏菌及鲶鱼爱德华氏菌显示出明显的进化差距.讨论迟缓爱德华氏菌是全球范围内水产养殖业最重要致病菌之一,具有广泛的表型和遗传多样性 .随着我国水产养殖行业的蓬勃发展,不同区域和宿主来源的迟缓爱德华氏菌分离株也在不断增加,对迟缓爱德化氏菌分离株进行多样性分析既有助于推进爱德华氏菌的流行病学研究,又为疫苗开发提供依据.细菌菌体O抗原与血清的凝集反应操作简便、敏感性高,是常用于判定细菌血清型的基本分型方法.细菌菌体O抗原是由多糖重复单元构成的多聚糖,具有多样性,基于O抗原的细菌血清凝集方法是划分细菌血清型的主要标准.本研究前期制备了迟缓爱德华氏菌E T Y、AT C C 及鲶鱼爱德华氏菌E I V的菌体O抗原及抗O血清,利用三种抗爱德华氏菌抗O血清与标本迟缓爱德华氏菌进行凝集反应,初步判断迟缓爱德华氏菌分离株的血清学类型.凝集试验结果显示,分离自我国华东与华南地区的的大部分迟缓爱德华氏菌O抗原血清型相似,但迟缓爱德华氏菌福建株A L NA 和广东株E L与三种菌体O抗原均不发生凝集,说明鱼源迟缓爱德华氏菌存在不同的血清型.鱼源迟缓爱德华氏菌(E T Y)兔抗O血清可与大部分鱼源迟缓爱德华氏菌菌体发生凝集反应,不与人源迟缓爱德华氏菌(AT C C )菌体发生凝集反应,人源迟缓爱德华氏菌(AT C C )兔抗O血清与大部分的鱼源迟缓爱德华氏菌菌体不发生凝集反应,说明鱼源和人源的迟缓爱德华氏菌存在血清型差异.鲶鱼爱德华氏菌兔抗O血清不与迟缓爱德华氏菌菌体发生凝集反应,说明爱德华氏菌种间差异明显.Sr R NA由于高度保守、易于分析,常用于细菌的分子鉴定与分型,以补充常规细菌鉴定或分类的不足.蒋德明等 通过对 株粘细菌的 Sr R NA序列的系统进化关系的分析表明,在形态上差异较小的菌株,在 Sr R NA上的同源性差异却较大,最大差异达到了;另外根据形态归为同一个属不同种的菌株,它们的 Sr R NA同源性却在 以上.目前一些重要的水产致病菌例如创伤弧菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、假单胞菌等也常用 Sr R NA序列的聚类分析来进行分子鉴定和分型 .热休克蛋白h s p 是另一类高度保守的持家基因,同时具有比 Sr R NA更丰富的多变性,已被证明在分类学上的分辨率鉴定及近缘细菌间的系统发育分析优于 Sr R NA.因此学者们通常联合 Sr R NA及h s p 聚类结果,进行细菌的亲缘进化关系及分类分析 .为进一步对标本爱德华氏菌进行分子系统进化性的分析,本研究克隆并测序标本迟缓爱德华氏菌的 Sr R NA与热休克蛋白基因h s p 部分基因序列,构建了系统进化树.基于 Sr R NA及h s p 部分基因序列构建的系统进化树结果一致显示,绝大部分鱼源迟缓爱德华氏菌分离株进化同源性较高.人源的迟缓爱德华氏菌分离株AT C C 与以上鱼源迟缓爱德华氏菌有一定的进化距离,但与来源于福建的鱼源迟缓爱德华氏菌A L NA(Sr R NA系统进化树中)或与来源于广东的鱼源迟缓爱德华氏菌E L(h s p 系统进化树中)相聚,说明不同种属来源的迟缓爱 德 华 氏 菌 存 在 一 定 的 亲 缘 关 系.同 时,A L NA 与E L在菌体血清凝集试验中显示 不 与种 血 清 中 的 任 何 一 种 凝 集,说 明A L NA 与E L血清型与其他鱼源迟缓爱德华氏菌不同.另外,在 Sr R NA系统进化树中,来源于广东的鱼源迟缓爱德华氏菌GK、E L及来源于福建的鱼源迟缓爱德华氏菌A L NA 与人源迟缓爱德华氏菌AT C C 聚类;在h s p 系统进化树中,GK、E L、A L NA 显示与人源迟缓中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ,()爱德华氏菌AT C C 及人源鲶鱼爱德华氏菌E I V聚类.但在 菌体血清凝集 实验中,E L与A L NA 均不与种抗O血清反应,而GK 与迟缓爱德华氏菌E T Y的抗O血清有凝集反应.以上结果说明作为人兽共患菌株,爱德华氏菌菌株可能通过食物 链等在水 产动物 与 人 之 间 交 叉 传染 .同时说明迟缓爱德华氏菌的血清分型与分子系统进化分析结果不具有绝对的相关性.这提示要更好地防控爱德华氏菌,不仅要进行分子层面的聚类分析,还应结合对菌体表面抗原的免疫原性等进行必要分析.利益冲突:无引用本文格式:李素一,池洪树,陈斌,等我国华东与华南地区养殖鱼类迟缓爱德华氏菌分离株的多样性分析J中国人兽共患病学报,():D O I:/j i s s n 参考文献L e u n gKY,S i a m eB A,T e n k i n kB J,e ta l E d w a r d s i e l l at a r d a v i r u l e n c em e c h a n i s m so f a ne m e r g i n gg a s t r o e n t e r i t i sp a t h o g e nJ M i c r o b e s I n f e c t,():D O I:/j m i c i n f P a r kS B,A o k iT,J u n gT S P a t h o g e n e s i so f a n ds t r a t e g i e s f o rp r e v e n t i n gE d w a r d s i e l l at a r d ai n f e c t i o ni nf i s hJ V e tR e s,():D O I:/B u j nN,M o h a mm e dH,B a l b o aS,e t a l G e n e t i c s t u d i e s t o r e a f f i l i a t eE d w a r d s i e l l a t a r d af i s h i s o l a t e s t oE d w a r d s i e l l ap i s c i c i d aa n dE d w a r d s i e l l aa n g u i l l a r u ms p e c i e sJ S y s tA p p lM i c r o b i o l,():D O I:/j s y a p m K a t h a r i o sP,K a l a t z i sP G,K o k k a r iC,e ta l C h a r a c t e r i z a t i o no f ah i g h l yv i r u l e n tE d w a r d s i e l l aa n g u i l l a r u ms t r a i ni s o l a t e df r o mg r e e ka q u a c u l t u r e,a n das p o n t a n e o u s l y i n d u c e dp r o p h a g et h e r e i nJ F r o n t M i c r o b i o l,:D O I:/f m i c b S h e t t yM F i r s t i s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fE d w a r d s i e l l at a r d af r o m d i s e a s e ds t r i p e d c a t f i s h,P a n g