毛叶苕子磷饥饿响应基因VvPHR1的克隆及功能研究_毛琳琳.pdf

毛叶苕子磷饥饿响应基毛叶苕子磷饥饿响应基因因 VvPHR1 的克隆及功能研究的克隆及功能研究毛琳琳1，朱瑞利1，易可可1，段志龙2，王秀斌1，周卫1，孙静文1*（1中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京100081/农业农村部植物营养与肥料重点实验室；2延安市农业科学研究所，陕西延安716000）摘要:【目的目的】磷饥饿响应因子 PHR(phosphatestarvationresponse)在植物根系发育和磷养分吸收中起重要作用，本研究主要阐明毛叶苕子 VvPHR1 基因生物学功能，为培育磷高效型绿肥作物提供理论依据。【方法方法】通过转录组测序获得毛叶苕子 VvPHR1 基因序列。采用酵母单杂交方法验证 VvPHR1 基因的转录激活功能，构建其过表达载体，利用花粉管通道法分别遗传转化野生型和突变体(Atphr1)拟南芥，获得超量表达 VvPHR1 基因和突变体功能回补转基因材料。对正常磷(1mmol/LPi)和低磷(1mol/LPi)的培养基中生长 30 天的拟南芥取样，采用实时荧光定量 PCR 对野生型和转基因拟南芥中 VvPHR1 及下游磷转运基因的表达进行分析，并对转基因材料进行表型分析，测定其主根长、鲜重、总磷及无机磷(phosphate，Pi)含量。【结果结果】毛叶苕子转录组中有 13 个 PHR 基因，转录本 129590、96227、120424 与拟南芥的 PHR1 相似度最高，其中转录本 120424 在低磷诱导下表达量最高，将该转录本命名为 VvPHR1 基因。该基因 cDNA 全长 1008bp，编码 335 个氨基酸，推测编码蛋白的分子量为 36.5KD，等电点为 6.04。系统发育树构建结果显示，该基因与蒺藜苜蓿和大豆 PHR1 基因的亲缘关系较近。亚细胞定位分析表明，VvPHR1 基因定位在细胞核中。酵母单杂交结果显示，VvPHR1 基因在酵母细胞中具有转录激活活性，能够激活下游报告基因表达。实时荧光定量 PCR 结果显示，与野生型相比，低磷胁迫下转 VvPHR1 基因拟南芥中 VvPHR1 基因及其下游调控的磷转运蛋白基因的表达量均显著上调。进一步研究转 VvPHR1 基因植株表型发现，在正常磷培养基中，野生型与转 VvPHR1 基因型拟南芥，以及突变体与突变体回补型拟南芥之间植株长势、主根长、全磷和无机磷含量均无显著差异；而在低磷培养基中，转 VvPHR1 基因拟南芥与野生型及突变体回补型拟南芥与突变体相比，主根更长，且植株全磷和无机磷含量均显著增加。【结论结论】毛叶苕子 VvPHR1 基因定位在细胞核中且具有转录自激活活性，具有转录因子的功能特征。在低磷条件下，VvPHR1 基因在转基因拟南芥的表达显著上调，能够促进根系伸长和增加植株对磷吸收，与拟南芥AtPHR1 基因有相似的功能。关键词:毛叶苕子；磷饥饿响应因子；转录因子；低磷胁迫Cloning and functional study of VvPHR1 gene involved in phosphatestarvation response by Vicia villosaMAOLin-lin1,ZHURui-li1,YIKe-ke1,DUANZhi-long2,WANGXiu-bin1,ZHOUWei1,SUNJing-wen1*(1 Institute of Agricultural Resources and Regional Planning,Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of PlantNutrition and Fertilizer,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Beijing 100081,China;2 Yanan Institute of AgriculturalSciences,Yanan,Shaanxi 716000,China)Abstract:【Objectives】Phosphatestarvationresponse(PHR)playsanimportantroleinplantrootdevelopmentandphosphorus(P)nutrition.Thisstudywasconductedtoclarifythebiologicalfunctionsofthe PHR1geneinVicia villosaandprovideatheoreticalbasisforcultivatinghigh-phosphorusefficiencygreenmanurecrops.【Methods】WeobtainedtheVvPHR1genesequencebyRNA-seqtechniqueandverifiedthetranscriptionalactivationofthegenebyusingayeastsinglehybridizationmethod.TheoverexpressionvectoroftheVvPHR1genewasconstructedandgeneticallytransformedintothewild-typeandmutant(Atphr1)Arabidopsis thalianaby植物营养与肥料学报2023,29(1):97108doi:10.11674/zwyf.2022441JournalofPlantNutritionandFertilizershttp:/www.plantnutrifert.org收稿日期：20220821接受日期：20221130基金项目：国家自然科学基金项目（31972514）；农业农村部绿肥产业技术体系（CARS-22-G-07）。联系方式：毛琳琳E-mail:；*通信作者孙静文E-mail:thepollen-tubepathwaymethod.ExpressionsoftheVvPHR1geneanddownstreamphosphatetransporterinwild-typeandtransgenicArabidopsis thalianaweregrownfor30daysinnormal(1mmol/LPi)andlowPi(1mol/LPi)mediaandanalyzedbyreal-timefluorescentquantitativePCR.PhenotypeandphysiologicalindicesoftransgenicArabidopsis thaliana,suchasmainrootlength,freshweight,totalPandPicontentswereanalyzed.【Results】Therewere13PHRgenesinVicia villosatranscriptome,andtranscripts129590,96227,and120424hadthehighestsimilaritywiththePHR1geneofArabidopsis thaliana.Theexpressionleveloftranscript120424wasthehighestunderlowPistress;thus,itwasnamedtheVvPHR1gene.ThefulllengthofVvPHR1cDNAwas1008bp,encoding335aminoacidproteinswithaputativemolecularweightof36.5KDandanisoelectricpointof6.04.ThephylogenetictreeresultsshowedthatthisgenewascloselyclusteredwiththePHR1genefromMedicago truncatulaandGlycine max.Subcellularlocalizationanalysisshowedthatthisgenewaslocalizedinthecellnucleus.YeastsinglehybridizationexperimentsindicatedthattheVvPHR1genehadtranscriptionalauto-activationandcouldactivatedownstreamreportergeneexpression.Theresultsofreal-timePCRshowedthattheexpressionofVvPHR1intransgenicArabidopsis thalianawas(P0.05)enhancedunderlowPitreatment,andtheexpressionofdownstreamphosphatetransportersintransgenicArabidopsis thalianawas(P0.05)inplantgrowth,mainrootlength,totalPandPicontentsbetweenwild-typeandoverexpressedVvPHR1Arabidopsis thaliana,aswellasbetweenmutantandmutantback-complementedArabidopsis thalianainnormalPitreatments.InlowPitreatments,mainrootlength,totalP,andPiofoverexpressedVvPHR1andmutantback-complementedArabidopsis thaliana(P0.05)increasedcomparedwiththewild-typeandmutantArabidopsis thaliana.【Conclusions】TheVvPHR1geneislocalizedinthecellnucleusandhasatranscriptionalauto-activationfunction,aspecificbiologicalcharacteristicoftranscriptionfactors.ExpressionoftheVvPHR1geneisupregulatedintransgenicArabidopsis thalianaunderlowPiconditions.TheVvPHR1genehasasimilarfunctiontotheAtPHR1geneandcouldpromoterootelongationandincreasePiuptakeinplantsunderlowPitreatment.Key words:Vicia villosa;phosphatestarvationresponse;transcriptionfactor;lowphosphorusstress磷是核酸、脂质、糖类等生物大分子的重要组成部分，在细胞代谢活动、酶的调控反应中起着至关重要的作用13。尽管在土壤中磷含量丰富，但其扩散速率较低，易被金属离子固定，不易被植物吸收利用4,因此土壤中磷的有效性并不高。在低磷环境下，植株生长缓慢、矮小且瘦弱，同时生育期延迟，并最终导致农作物减产5。在生产中通常会施用磷肥来解决作物缺磷问题，但当季磷肥利用率并不高，通常在 10%25%，同时过度施用磷肥会造成磷矿资源枯竭和水体富营养化等负面影响6。因此，提高植物自身对磷的吸收显得尤为重要。多年来，育种学家们通过杂交育种或分子改良等方法来提高作物对磷的吸收和利用能力以提升作物对低磷环境的适应性78。PHR 基因是植物响应低磷胁迫的关键调控因子，可通过启动下游基因的表达来提高植物对磷的吸收，被启动的功能基因主要包括促进根系伸长基因和磷的转运蛋白基因等910。PHR 基因对下游基因的调控作用最早在拟南芥中报道，目前共发现 15 个 AtPHR 家族成员，其中 PHR1基因是参与低磷调控最重要的一个基因。水稻中的同源基因为 OsPHR2，与 AtPHR1 有相同的功能10，同时 OsPHR3、OsPHR4 基因等相继被发现1112。在拟南芥和水稻模式植物中，大多数磷饥饿响应基因都是被AtPHR1和OsPHR2以及其同源基因AtPHL1、AtPHL2、OsPHR1和OsPHR3诱导而激活1314。因此，通过转录因子诱导下游磷吸收相关基因的表达，来提高转基因植物抗低磷胁迫能力一直是国内外研究的热点。迄今为止，已经从拟南芥、水稻、小麦、玉米、油菜等多种植物中克隆出 PHR 转录因子。在豆科植物中，已从大豆中克隆了 35 个 PHR基因，并将其中的 GmPHR25 转入到大豆中，在低磷胁迫下，获得的转基因植株根毛中 11 个磷转运基因及 5 个磷饥饿响应基因的表达显著提高15。同时，在 NCBIGenBank 中还能搜索出苜蓿等的 PHR 基因98植物营养与肥料学报29卷序列，但没有相应基因的生物学功能报道。因此，总体来说豆科植物 PHR 基因功能的相关研究较少。毛叶苕子(Vicia villosa)是重要的豆科绿肥作物，具有较强的固氮能力，翻压还田可以有效提高土壤中养分含量，改良土壤结构。但是其对磷利用率低，吸收利用土壤难溶性磷酸盐的能力较差，极大地限制了其在绿肥翻压还田增加土壤有效磷含量中的应用。长期以来关注毛叶苕子氮素养分吸收及释放规律多，其磷素养分吸收转运的相关研究少。同时，关于 PHR 基因的研究都是在模式植物如水稻、拟南芥开展的，非模式植物特别是绿肥作物上的研究甚少。毛叶苕子中 PHR 基因的生物学功能是否与模式植物一致，目前并不清楚。因此，本研究从毛叶苕子中克隆 PHR 基因，研究该基因的亚细胞定位特征及转录自激活功能，进一步将该基因分别在野生型及 Atphr1 突变体拟南芥中表达，研究转基因材料的生理表型及磷含量变化，以期深入揭示毛叶苕子 PHR 基因的生物学功能，为遗传改良磷高效毛叶苕子品种、阐明绿肥作物耐低磷胁迫的分子机制提供理论依据。1 材料与方法1.1 试验材料供试毛叶苕子品种为苏联毛苕和徐苕 3号，由中国农业科学院农业资源与农业区划研究所曹卫东研究员提供，phr1突变体拟南芥由清华大学刘栋教授提供。植物总 RNA 提取试剂盒、质粒提取试剂盒购于 TIANGEN 生物公司。大肠杆菌DH5 感受态细胞、农杆菌 GV3101 感受态细胞、酵母AH109 感受态细胞均购于北京擎科生物技术有限公司。试验所设计的引物由上海生工生物工程有限公司合成。克隆载体 pCAMBIA1300、pCAMBIA1300-GFP 均购于北京华越洋生物公司。1.2 毛叶苕子转录组测序及PHR基因相关转录本表达分析设置两个处理：1)正常磷(200mol/LPi)；2)低磷(2mol/LPi)，3 次重复。在智能光照培养箱中(26，16h 光照；20，8h 黑暗)，采用 Hoagland改良营养液进行培养，营养液 pH 为 6.30.1，每隔3 天更换 1 次营养液。选取正常磷和低磷处理 12 天的苏联毛苕和徐苕 3 号的地上部和根系，每个处理 3 次生物学重复，共计构建 24 个基因文库。为消除个体间差异，将低磷处理 12 天相同品种的毛叶苕子 5 株混合取样，每个材料取 3 次生物学重复，样品经液氮速冻后80 保存，用于 RNA 提取。委托美吉生物医药科技有限公司完成基因文库构建和转录组测序。采用单分子实时测序技术(SMRT)进行毛叶苕子全长转录组测序。使用 RSEM 比对软件(http:/deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/)对转录本的表达水平进行定量分析，利用 FPKM(fragmentsperkilobasespermillionreads)法计算基因表达量，即每一百万条序列中，每个基因以一千个碱基为单位，比对上的 reads(建库时打断获得的 fragments，当以 PE 测序时，同一个片段包含两条 reads)个数。具体公式如下：FPKM=某基因唯一比对到基因的 fragments 数/(某基因的长度唯一比对到参与基因组的总 fragments 数)109。1.3 VvPHR1基因的克隆基于毛叶苕子 3 代全长转录组测序获得 PHR 序列信息，设计上下游引物，正向引物序列为 primerF：5ATGGAAGCTCGTCCTGCTTTCTCAATTG3，反向引物序列为 primerR：5TCAATGGGGCTTAGTTTTTTTTTCTCCAGC3。采用 TIANGEN 公司的试剂盒提取毛叶苕子总 RNA，以毛叶苕子总RNA 为模板，用 Promega 公司的 AMV 反转录酶试剂盒进行逆转录，获得毛叶苕子 cDNA。利用 PCR方法从 cDNA 中扩增 PHR 基因全长 ORF，反应体系为 cDNA1L、2KODBuffer25L、dNTPs5L、KOD 酶 1L、上下游引物各 1L，ddH2O 补足至 50L。PCR 反应条件为 955min；9530s，5810s，721min；28 个循环；725min。PCR 产物胶回收后连接到 pMD18-T 克隆载体，转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞，然后提取质粒 DNA，将质粒送北京博迈德生物科技有限公司完成测序，获得毛叶苕子 PHR 基因序列，命名为 VvPHR1 基因。1.4 VvPHR1基因的亚细胞定位分析根据 VvPHR1 基因的开放阅读框设计特异性引物(primerF：5AACACGGGGGACGAGCTCGGTACCATGGAAGCTCGTCCTGCTTTCTC3;primerR：5ATGATACGAACGAAAGCTCTGCAGATGGGGCTTAGTTTTTTTTTCTCCAGC3)，采用高保真酶扩增获得 VvPHR1 基因全长 ORF(去除终止密码子TGA)，采用无缝克隆与 pCAMBIA-35S-EGFP 载体连接构建融合表达载体，参照郭贞慧16的方法制备水稻原生质体和烟草细胞，采用 PEG 介导法和农杆菌注射法将构建好的重组质粒 pCAMBIA-VvPHR1-1期毛琳琳，等：毛叶苕子磷饥饿响应基因 VvPHR1 的克隆及功能研究99EGFP 分别转入水稻原生质体和烟草细胞中，在光照培养箱中于 25 下光照培养 48h，采用激光共聚焦显微镜(ZEISSLSM-510META，Germany)观察其亚细胞定位。1.5 VvPHR1基因的转录激活功能分析根据 VvPHR1 设计特异性引物(primerF：5AGGCCGAATTCCCGGGATGGAAGCTCGTCCTGCT3;primerR：5GCCGCTGCAGGTCGACTCAATGGGGCTTAGTTTTTTTTTCTCCAGC3)，扩增VvPHR1 基因的 ORF，与用 XmaI 和 SalI 双酶切后的表达载体 pGBKT7 连接，构建重组质粒 pGBKT7-VvPHR1，经测序验证后转入酿酒酵母 AH109，以pGBKT7 空载体作为阴性对照，按照 100、101、102、103、104和 105等 6 个浓度梯度均匀涂于 SD/Trp单缺陷平板、SD/Trp/His两缺平板、SD/Trp/His/Ade 三缺陷平板上培养，观察转化子的生长情况，再挑选转化子涂于 SD/Trp/His/Ade(+X-gal)显色平板，进行-半乳糖苷酶活性检测，并拍照记录。1.6 VvPHR1基因遗传转化拟南芥根据 VvPHR1 的开放阅读框设计含有酶切位点的特异性引物(primerF：5GGGGTACCATGGAAGCTCGTCCTGCTTTCTC3;primerR：5ACGCGTCGACTCAATGGGGCTTAGTTTTTTTTTCTCCAGC3)，采用高保真酶扩增获得 VvPHR1 全长ORF，选用限制性内切酶 KPNI 和 SALI 酶切载体pCAMBIA1300 以及带有酶切位点 VvPHR1 全长 ORF，采用 T4连接的方法将目的基因与 pCAMBIA1300-35S 载体连接构建融合表达载体 pCAMBIA1300-35S-VvPHR1，然后通过电击法，将融合表达载体转入农杆菌 GV3101 感受态细胞。播种前将拟南芥种子放置于 4 冰箱春化 2天，然后营养土装盆播种拟南芥，待其抽薹开花后进行花序侵染。将冷冻保存的含 pCAMBIA1300-35S-VvPHR1 农杆菌菌液活化培养后用于侵染拟南芥。活化后的农杆菌菌液加入 15L 表面活化剂 Silwet-77，震荡混匀，利用沾花法分别侵染野生型及 phr1突变体拟南芥。剪去已经开过的拟南芥的花与籽粒荚，留下花蕾备用。将拟南芥花浸入农杆菌悬浮液30s 并套袋处理，重复侵染 23 次。在光照培养箱中培养(23，16h 光照；20，8h 黑暗)，30 天后，收集成熟种子(T1代)后放置 37 烘干，之后置于 4 保存。通过潮霉素对 T1代拟南芥种子进行抗性筛选，获取阳性转基因植株(图 1)。然后通过 PCR 检测潮霉素抗性基因(Hyg)，对转基因植株进行进一步鉴定，检测引物：Hyg(501)F：GAGCATATACGCCCGGAGTC；Hyg(501)R：CAAGACCTGCCTGAAACCGA，结果显示抗性植株扩增出约 501bp 的目标条带(图 2)。连续加 2 代，获得稳定遗传的 T3代转基因拟南芥。1.7 实时荧光定量 PCR将生长 30 天的正常磷(1mmol/LPi)和低磷(1mol/LPi)处理的野生型(WT)和过表达型(OEPHR1)拟南芥取样，液氮速冻，提取拟南芥总 RNA，使用Promega 公司的 AMV 反转录酶试剂盒逆转录成cDNA，使用 SYBRGreenProTaqHSqPCRKit(AccurateBiotechnology)试剂盒进行荧光定量 PCR。定量 PCR 反应体系为 10L2SYBRGreenProTaqHSPremix、1L 引物(10mol/L)、2LcDNA、0.4LROXReferenceDye，并加入 ddH2O至20L。反应程序：1)95预变性 10min；2)扩增阶段，95变性 10s，58 退火+延伸45s，40 个循环；3)溶解曲线阶段，95 变性 15s，601min。其中每个样品包括 3 次生物学重复和 3 次技术重复。定量 PCR图 1 转基因拟南芥潮霉素抗性苗筛选Fig.1 Screening of hygromycin-resistant seedlings intransgenic Arabidopsis thalianaDL1000500图 2 转基因拟南芥电泳检测Fig.2 Electrophoretic test of transgenicArabidopsis thaliana100植物营养与肥料学报29卷引物序列见表 1。数据分析方法：用拟南芥内参基因 actin 作为相对定量的标准，表达分析使用 2CT法，方法如下：1)待测样品CT=待测样品 CT(gene)待测样品CT(actin)；2)对照样品CT=对照样本 CT(gene)对照样品CT(actin)；3)CT=待测样品CT对照样品CT。1.8 转VvPHR1基因拟南芥的表型观察及磷含量测定将野生型(WT)、T3代转基因型(OEPHR1)、突变体(phr1)以及突变体回补转基因型(phr1-VvPHR1)拟南芥种子用 75%乙醇消毒 5min，30%NaClO 消毒 2min，75%乙醇消毒 2min，再用无菌蒸馏水洗涤 5 次，然后将种子铺在 1/2MS 固体培养基上，置于 4 黑暗环境春化处理 2 天后，放于光照培养箱生长 7 天左右，将在 1/2MS 固体培养基上生长的拟南芥移至正常磷(1mmol/LPi)和低磷(1mol/LPi)的 MS 固体培养基上生长 30 天，拍照记录表型，取样保存，用于后续试验测定。全磷含量测定采用钼锑抗比色法，无机磷含量测定参照郭贞慧16无机磷测定方法。1.9 生物信息学分析及数据处理利用ProtParam在线工具预测 VvPHR1 基因编码蛋白的分子量、等电点、蛋白质分子式和编码氨基酸组成；利用 TMHMMServerv.2.0 在线对VvPHR 蛋白的跨膜结构进行分析，采用 Netphos 分析 VvPHR 蛋白的激酶磷酸化位点；利用 SOPMA 在线工具对 VvPHR1 蛋白进行二级结构预测。使用MEGA-X 软件来构建系统发育进化树，分析毛叶苕子和其他 PHR 基因家族成员之间的系统进化关系。用Excel2019软件进行数据计算和图表制作。用Origin2022 进行柱状图绘制。采用SPSS软件进行方差分析，采用Duncan氏新复极差法进行多重比较，不同字母表示P0.05，即差异显著。2 结果与分析2.1 毛叶苕子PHR1基因的组织特异性表达分析在毛叶苕子转录组中共筛选到 13 个磷酸盐饥饿响应因子 PHR(phosphatestarvationresponse)基因，与拟南芥和苜蓿等 PHR1 序列相似性最高的是转录本 129590、转录本 96227 和转录本 120424，其中转录本 120424 在根系和地上部表达量均最高(表 2)，且该基因在正常磷水平下表达量较低，而在低磷水平下表达量较高，在毛叶苕子测序的两个品种的地上部和根部中均有体现(图 3)，该转录本可能是毛叶苕子磷饥饿响应关键基因。2.2 VvPHR1基因的生物信息学分析毛叶苕子转录本 120424 的 cDNA 序列全长 1008bp，编码 335 个氨基酸(图 4)。依据生物信息学分析，推测该基因无跨膜结构，可能定位于细胞核中，编码蛋白的分子量为 36.5KD，等电点为 6.04，存在 54 个激酶磷酸化位点，其中包括 41 个 Serine(丝氨酸)、11 个 Threonine(苏氨酸)和 2 个 Tyrosine(酪氨酸)位点；编码蛋白的二级结构含有 20.90%的-螺旋、70.15%的无规则卷曲、7.16%的延伸链和1.79%的-转角。用该转录本序列与拟南芥、水稻和玉米等植物 PHR 基因做系统进化树分析发现，该基因与蒺藜苜蓿和大豆的 PHR1 亲缘关系较近(图 5)。基于生物信息学预测及系统进化树分析，将毛叶苕子转录本 120424 命名为 VvPHR1。2.3 VvPHR1基因的转录自激活功能验证利用酵母单杂交系统验证 VvPHR1 基因的转录自激活功能。结果显示，带有 pGBKT7-VvPHR1 融合载体的酵母菌在 SD/Trp、SD/Trp/His 和表 1 实时荧光定量 PCR 引物序列Table 1 Primer sequence of the real-time fluorescent quantitative PCR引物名称Primername引物序列Primersequence(53)引物名称Primername引物序列Primersequence(53)Actin-FGGTAACATTGTGCTCAGTGGTGGAtPHT1;8-RGTCACCGAGGTAACCGAAGACTAGTActin-RAACGACCTTAATCTTCATGCTGCVvPHR1-FATGGAAGCTCGTCCTGCTTTCTAtPHT1;1-FATGGCCGAACAACAACTAGGAGTVvPHR1-RATGAAAACATATGCCCAACTGCTCCAtPHT1;1-RCAAAGGGCCACACCGTTGACCIPS1-FGGCCATCCCCTAGCTAGGTGAAAtPHT1;4-FATGGCAAGGGAACAATTACAAGTGTTIPS1-RGCCAAAGGATAGAAGTTGCCCAATTTCAtPHT1;4-RGAGAGTCCCACAGAAGGCAACGAtPHT1;9-FCCTCACAGTCAAACCAAAGCATATTCCAtPHT1-8-FCGTCGCTTGATGTAGCTCGAACAAtPHT1;9-RCCCATTCCGGCGACTATTATCGC1期毛琳琳，等：毛叶苕子磷饥饿响应基因 VvPHR1 的克隆及功能研究101SD/Trp/His/Ade 的培养基上都能正常生长，并且能够使 X-gal 染料显示蓝色，然而含有 pGBKT7 空载的酵母菌只能在 SD/Trp 上生长(图 6)，上述结果表明 VvPHR1 在酵母细胞中具有转录激活活性。2.4 VvPHR1基因的亚细胞定位分析将构建好的重组质粒分别转入烟草细胞和水稻原生质体中，在激光共聚焦显微镜下观察。结果显示，在烟草细胞中 VvPHR1-GFP 融合蛋白与蓝色核标记物融合为青色，共定位于细胞核中(图 7A)；在水稻原生质体中，更清楚地看到 VvPHR1-GFP 融合蛋白在细胞核中发出绿色荧光的区域，与 D53 核定位 Marker 标记为红色的区域融合成了明显的黄色(图 7B)，上述试验结果表明毛叶苕子 VvPHR1 基因定位在细胞核中。2.5 转VvPHR1基因拟南芥中PHR、PHT基因表达特征采用实时荧光定量 PCR 分析野生型(WT)和超表达型(OEPHR1)拟南芥在 1mmol/LPi 和 1mol/LPi 培养基处理 30 天后，VvPHR1、IPS1 和磷转运蛋表 2 磷饥饿响应相关基因的筛选Table 2 Screening for phosphate starvation response related genes转录本idTranscript_id蛋白描述Proteindescription根部表达量Expressioninroot地上部表达量Expressioninshoot相似性(%)Similaritytranscript127314proteinPHR1Medicago truncatula00.0292.1transcript129590proteinPHR1Medicago truncatula0.370.1495transcript94901proteinPHR1Medicago truncatula0059.8transcript96227proteinPHR1Medicago truncatula0.680.1294.8transcript110185proteinPHR1Amborella trichopoda1.801.8570.6transcript111427proteinPHR1Medicago truncatula0.390.2792transcript112310proteinPHR1Medicago truncatula0.150.1191.4transcript120424proteinPHR1Medicago truncatula3.571.9393.7transcript98918proteinPHR1Medicago truncatula0.100.0591.7transcript100234proteinPHR1Medicago truncatula0.010.0171.2transcript101911proteinPHR1Medicago truncatula0.310.7292.6transcript107740proteinPHR1Medicago truncatula3.261.0492.6transcript109723proteinPHR1Medicago truncatula0.210.2592.6注：使用RSEM比对软件(http:/deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/)对转录本的表达水平进行定量分析，利用FPKM(fragmentsperkilobasespermillionreads)法计算基因表达量，即每一百万条序列中，每个基因以一千个碱基为单位，比对上的reads(建库时打断获得的fragments，当以PE测序时，同一个片段包含两条reads)个数。具体公式如下：FPKM=某基因唯一比对到基因的fragments数/(某基因的长度唯一比对到参与基因组的总fragments数)109。Note:WithRSEMthansoftware(http:/deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/)expressionleveloftranscriptionofthisquantitativeanalysis.TheFPKM(fragmentsperkilobasespermillionreads)methodwasusedtocalculatethegeneexpression,thatis,foreveryonemillionsequences,eachgenewasalignedwithonethousandbasesastheunit(fragmentsobtainedduringlibraryconstructionwereinterrupted,andwhenPEwasusedforsequencing,thesamefragmentcontainstworeads).Thespecificformulaisasfollows:FPKM=thenumberoffragmentsfortheuniqueagenealignment/(thelengthoftheagenethetotalnumberoffragmentsfortheuniqueagenomealignment)109.4.03.53.02.52.01.51.00.50NP-SNP-RLP-S苏联毛苕 Soviet Vivia villosa徐苕 3 号 Xushao 3LP-Rlg(FPKM+1)图 3 转录本 120424 在苏联毛苕和徐苕 3 号中的表达量Fig.3 Expression of transcript 120424 in Soviet Viciavillosa and Xushao 3注：利用 FPKM(fragmentsperkilobasespermillionreads)法计算基因表达量，纵坐标为转录本在每个样本中的表达量对数值。NP-S正常磷处理地上部；NP-R正常磷处理根部；LP-S低磷处理地上部；LP-R低磷处理根部。Note:TheFPKM(fragmentsperkilobasespermillionreads)methodwasusedtocalculatethegeneexpression.Theordinateisthelogarithmoftranscriptexpressionineachsample.NP-SShootwithnormalphosphoruscondition;NP-RRootwithnormalphosphoruscondition;LP-SShootwithlowphosphoruscondition;LP-RRootwithlowphosphoruscondition.102植物营养与肥料学报29卷白基因 AtPHT1;1、AtPHT1;4、AtPHT1;8、AtPHT1;9的表达。结果显示，野生型中未检测到 VvPHR1 基因的表达，在 OEPHR1 拟南芥中，与正常磷处理相比，低磷处理下 VvPHR1 基因显著上调表达(图 8A)。进一步分析 PHR1 基因调控的下游磷转运蛋白基因的表达情况，结果表明与野生型拟南芥相比，在低磷处理下，OEPHR1 拟南芥中的低磷诱导基因IPS1 表达没有显著差异，而磷转运蛋白相关基因AtPHT1;1、AtPHT1;4、AtPHT1;8、AtPHT1;9 表达均显著上升，其中 AtPHT1;1磷转运基因上调表达量最图 4 VvPHR1 基因序列Fig.4 Sequence of VvPHR1 gene玉米 ZmPHR1-Like3(NP_001140549.1)莱茵衣藻 CrPHR1(AAD55945.1)水稻 OsPHR3(XP 015627390.1)水稻 OsPHR2(XP 015