纳米载银义齿基托生物安全性的研究现状.pdf

361Chin J Geriatr Dent,December,2023,VoI.21.No.6 中华老年口腔医学杂志 2023 年 12 月第 21 卷第 6 期 纳米载银义齿基托生物安全性的研究现状*李澳科，闫通通，王晓容 摘要 聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate,PMMA）是目前临床中广泛使用的义齿基托材料，它具有良好的生物相容性、化学稳定性和美观性等诸多优点。但 PMMA 的抗菌性能欠佳，它的较大表面积和高孔隙率易打破口腔内微生物和宿主之间的动态平衡，在使用过程中常发生黏膜发红、溃疡，甚至义齿性口炎的情况。近年来在 PMMA 中添加纳米载银无机抗菌剂以提高其抗菌性能的研究十分常见，这种新型材料的抗菌性能已被证实。但纳米载银粒子（Ag-loaded nanoparticles,AgNPs）的潜在毒性和口腔材料的特殊性导致其具有一定的应用风险，可能与不同浓度、尺寸、粒径及载体的AgNPs 有关。本文综述了近些年关于AgNPs 的潜在毒性研究，以及不同纳米载银义齿基托的生物安全性的研究现状，旨在为其临床应用提供参考。关键词 纳米载银粒子；聚甲基丙烯酸甲酯；义齿基托；生物安全性 中国图书分类号 R783 文献标识码 ADOI:10.19749/.cjgd.1672-2973.2023.06.010Research status of biosafety of nano-silver loaded denture base LI Ao-ke,YAN Tong-tong,WANG Xiao-rong(Department of Prosthodontics,Hospital of Stomatology,Jilin University,Changchun 130021,China)AbstractPolymethyl methacrylate(PMMA)is a widely used in clinical denture base material which has many advantages such as good biocompatibility,chemical stability and aesthetics.However,the antimicrobial performance of PMMA is not desirable,its larger surface area and high porosity are easy to break the dynamic equilibrium between microorganisms and hosts in the mouth,often occurring in the process of mucosal redness,ulceration,and even denture stomatitis.In recent years,it is very common to add nano-silver loaded inorganic antibacterial agents to PMMA to improve its antibacterial properties,and the antibacterial properties of this new material have been confirmed.However,the potential toxicity of Ag-loaded nanoparticles(AgNPs)and the specificity of oral materials lead to a certain risk of their application,which may be related to the different concentrations,sizes,particle sizes and carriers of AgNPs.In this paper,we reviewed the research on the potential toxicity of AgNPs and the biosafety of different nano-silver bearing denture bases in recent years,aiming to provide reference for their clinical application.Key wordsAg-loaded nanoparticles;polymethyl methacrylate;denture base;biosafety 基金项目 吉林省科技发展计划项目（20220401092YY）作者单位 130021 长春，吉林大学口腔医院修复科（李澳科，闫通通，王晓容）通信作者 王晓容，E-mail:wangxr135 综述 聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate,PMMA）主要是由单体分子甲基丙烯酸甲酯（methyl methacrylate,MMA）聚合而成的人工合成高分子材料，在临床中常用于制作全口及可摘义齿基托、腭护板、下颌斜面导板和正畸保持器等产品1。PMMA 价格合理、舒适美观且生物相容性良好，但它的结构疏松多孔、表面积大，长期处于口腔环境中更会加重表面粗糙程度，削弱口腔的自洁作用，从而加快致病菌定植甚至引起义齿性口炎的发生。为了解决抗菌性的问题，近些年来在 PMMA中添加纳米填料的研究十分常见2-3。其中，纳米载银粒子（Ag-loaded nanoparticles,AgNPs）提高义齿基托抗菌性能的作用已被证实。AgNPs 由纳米材料和银离子通过多种途径合成，与单一成分相比，它既具有亚微米大小和超大的表面积，在小剂量下即可产生良好的抗菌效果；又可以进入细菌内部，通过破坏大分子物质、泄露细胞内容物等方式导致细菌死亡4。但 AgNPs 的强氧化活性可能对人体存在潜在毒性，复合材料也可能产生新的毒性，因此 AgNPs/PMMA 能否安全应用于临床仍需进一步研究5。本文对 AgNPs 的潜在毒性及 AgNPs/PMMA 的生物安全性研究现状进行综述，为这种新型材料应用于临床前奠定理论基础。1 AgNPs 的潜在毒性 纳米载银粒子(AgNPs)具有优异的化学稳定性、抗真菌和杀菌性能，目前已广泛用于抗菌剂、抗癌剂以及医疗保健行业6。它的强细胞毒性是消除微生物的优势，但在应用于人体的过程中也可能造成潜在危害。许多实验发现，在暴露362 中华老年口腔医学杂志 2023 年 12 月第 21 卷第 6 期 Chin J Geriatr Dent,December,2023,VoI.21.No.6 于AgNPs的不同类型细胞系中出现活性氧(reactive oxygen species,ROS)显著增加、脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）损伤、细胞周期停滞，甚至细胞死亡或凋亡的现象7。AgNPs 产生毒性的关键事件是通过扩散、内吞或吞噬作用进入细胞并释放 Ag+，随后渗透到内体、溶酶体和线粒体等细胞器8。AgNPs倾向于在线粒体中积累，Ag+也可以与线粒体膜蛋白的硫醇基团相互作用，这些都会诱发线粒体功能障碍9。此外，AgNPs与生物分子的相互作用可诱导构象改变、酶衰竭、信号通路激活等生化改变10。除了纳米银粒子与细胞的直接作用以外，多数观点认为 AgNPs 和Ag+导致细胞内生成过量 ROS 是其产生细胞毒性更重要的原因11。当 ROS 的产生超过细胞抗氧化防御系统的能力时，就会导致氧化应激，进而引起氧化性 DNA 损伤、炎症反应、线粒体功能障碍，最终导致细胞凋亡12。迄今为止，AgNPs 本身如何在活细胞中发挥毒性的机制尚不完全清楚。研究表明，AgNPs 的毒性作用很大程度上取决于 AgNPs 的颗粒浓度、剂量、粒径大小、形状和暴露时间等13。AgNPs 的体外细胞毒性似乎与粒径大小成负相关，与剂量大小成正相关。例如，Zhang XF 等14研究了不同粒径 AgNPs(10 nm、20 nm)对雄性体细胞和精原干细胞的影响，结果表明 10 nmAgNPs 比 20 nmAgNPs 更具细胞毒性，以剂量和大小依赖的方式抑制雄性体细胞和精原干细胞。Stoehr LC 等15比较了球型 AgNPs(30 nm)、线型AgNPs(长度：1.5 25m，直径 100 160 nm)和银微粒（40m）对肺泡上皮细胞的影响，结果显示线型 AgNPs 存在最高水平的细胞毒性，降低了肺泡上皮细胞的活性并增加了乳酸脱氢酶的释放，并引起细胞内钙的升高和增强其他免疫作用。这种基于形状的毒性效应可能是由于线型AgNPs 与细胞膜直接相互作用，而不是通过内吞作用被内化。基于上述条件，评价 AgNPs 的细胞毒性要结合多种因素，较大尺寸和较低的含量的球形 AgNPs 有助于减少 Ag+初始爆发释放，并实现低细胞毒性16。2 AgNPs/PMMA 生物安全性检测 合适浓度、粒径、形状及载体的 AgNPs 毒性极小，与 PMMA 义齿基托结合形成的抗菌复合材料有望应用于临床，在此之前对 AgNPs/PMMA 的生物安全性评价必不可少。生物安全性原则要求口腔材料应对人体无毒性、无刺激性、无致癌和致畸作用。根据YY-0268 牙科材料的生物学评价附录 A 规定，PMMA 义齿基托属于 C 类(持久接触 30d)表面接触器械，生物相容性评价试验应考虑细胞毒性、遗传毒性、刺激或皮内反应、迟发性超敏反应、亚慢（急）性全身毒性等试验。2.1 细胞毒性试验 细胞毒性试验可用于评价材料致细胞损伤的潜在可能，并预测最终应用于机体时产生的生物学反应。Chen R 等17采用 MTT法比较了 3 wt%载银纳米二氧化钛(Ag/TiO2，粒径30nm)PMMA和3wt%载银纳米磷酸锆(Novaron，平均粒径 0.8 mm)PMMA 复合材料的细胞毒性，发现在两倍稀释的浸提液中孵育 24 h 后，各组对成纤维细胞的生长没有不利影响。但在未稀释浸提液中，Ag/TiO2组相比之下具有较明显的细胞毒性(P 0.05)，提示 AgNPs 的毒性与不同载体有关。Petrochenko PE 等18采用脉冲激光沉积的方法制作出一种沉积均匀的 PMMA/AgNPs 薄膜。结果显示用 10000 脉冲的 PMMA/AgNPs 薄膜的抗菌率高达 99%，其释放的 Ag+浓度为 0.8g/mL，用 MTT 法和流式细胞术检测均未显示细胞毒性和显著坏死及凋亡。但随着激光脉冲总数的增大，Ag+的剂量增加到该阈值以上会诱发毒性。毒理学研究发现溶液中 AgNPs 浓度超过 5g/mL 时，不同细胞系会出现明显的细胞毒性反应19。Pinheiro MCR 等20评估了不同浓度（1 组：1%、2 组：2.5%、3 组：5%）AgNPs 掺入热聚合 PMMA 后，在 24、48、72 h 对成纤维细胞产生的细胞毒性。在这项研究中 2 组和 3 组比 1 组表现出更高的细胞毒性，然而与对照组相比，所有组的生存能力都较低（P 0.05）。此项试验仅研究了 72 h 内的细胞毒性，后期 Ag+的释放速率和释放量尚未可知，根据研究结果可建议这种新型义齿基托在使用前进行浸泡以便释放初期 Ag+。2.2 遗传毒性试验 遗传毒性试验是生物安全性重要检测指标之一，用于评价材料的致畸、致癌、致突变能力，以了解材料对机体的远期作用。申证暄等21将 2 wt%纳米载银室温固化型 PMMA 浸提液分为高(200 mg/ml)、中(40 mg/ml)、低(8 mg/ml)剂量组对随机分组小鼠以 50 ml/kg 灌胃毒染，取小鼠股骨骨髓制片，进行嗜多染红细胞实验。结果表明，抗菌性室温固化 PMMA 材料浸提液高、中、低各浓度组微核率无剂量反应关系，该材料无致突变性。Acosta-Torres LS 等22在 MMA 单体中加入 1g/ml363Chin J Geriatr Dent,December,2023,VoI.21.No.6 中华老年口腔医学杂志 2023 年 12 月第 21 卷第 6 期 银纳米颗粒进行微波固化，使用从急性 T 细胞白血病患者的外周血中建立的人类 T 淋巴细胞 Jurkat 细胞进行彗星试验，结果显示与阳性对照组相比，AgNPs/PMMA 实验组对细胞没有毒性。2.3 溶血试验 溶血试验主要用于评价长期与人体直接接触的材料的血液相容性。AgNPs 会产生尺寸依赖性红细胞溶血23，与 PMMA 形成的义齿基托虽不与血液直接接触，但长期与口腔黏膜接触摩擦，戴用者可能会出现黏膜破损的情况。此时若纳米载银 PMMA 的血液相容性较差，可能对机体产生不良的健康影响（如贫血、高血压、肾毒性等）24。张赢心等25将纳米载银磷酸锆PMMA（2 wt%、1.5m）浸提液与人红细胞进行溶血试验，溶血率为 2.45%(符合国家标准)，认为该材料不会对人体产生溶血反应。Wekwejt M 等26在PMMA 骨水泥中加入 1.5 wt%和 3 wt%AgNPs（平均粒径 50 nm），检查了材料的抗菌性能以及红细胞的完整性、血小板和牙髓干细胞的活力等。结果显示含有纳米银（1.5 wt%和 3 wt%）的 PMMA骨水泥不影响红细胞溶血、血小板功能、活力、形态和牙髓干细胞的粘附。2.4 黏膜刺激试验 少数情况下 PMMA 义齿基托会产生局部黏膜刺激反应，表现为口腔炎、口腔烧灼感或滚烫感、不同强度的疼痛感以及过敏反应27，这可能与 PMMA 合成过程中单体 MMA 未完全聚合和析出有关28。AgNPs 本身具有潜在毒性，与 PMMA 形成的复合材料是否会加重对口腔黏膜的刺激是临床使用前需要关注的问题。Sun J 等29将 AgNPs 颗粒与PMMA 粉末以 1:20(w:w)的质量比球磨均匀混合制备义齿基托标本，其浸提液以 3 cm2/mL 注射到新西兰大鼠背部。注射后即刻及 24 h、48 h、72 h 观察注射区域，未见红斑、水肿、溃疡、硬结等致敏现象。张赢心等25将 1.5 wt%、2.0 wt%、2.5 wt%AgNPs/PMMA 实验组分别缝合在金黄地鼠一侧颊囊头端，14 d 后取各组黏膜组织做 HE 染色并进行组织学观察，结果发现实验组的黏膜组织切片与对照组无显著差异。以上两项实验合成 PMMA 所用的聚合反应均为化学固化，相较于热固化，这种聚合方式形成的义齿基托具有更大的刺激性30。但在这种情况下，AgNPs/PMMA 复合材料和浸提液对口腔黏膜及皮下组织也并无初次刺激作用。2.5 全身毒性试验 AgNPs 在真实唾液中具有稳定性和化学持久性，且 ROS 释放量很小，预测AgNPs 不太可能对口腔造成严重伤害，但这种持久性可能使它们运输到其他环境31，进入机体至远端部位产生有害作用。史金先等32对小鼠进行短期重复给药的毒性试验，发现小鼠血清丙氨酸氨基转移酶、谷丙转氨酶不受 2 wt%AgNPs/PMMA浸提液的影响；同一浓度下，抗菌组和普通组的肝脏脏器系数无显著性差异。Sun J 等29将试验标本缝合进入小鼠背部，术后密切观察小鼠的精神状态和体重。移植 7 天后小鼠背部完全愈合，染色切片显微镜下观察：标本周围皮肤结构正常，肌肉层完整，未见炎性细胞浸润和细胞坏死。在皮内移植实验中，未发生小鼠全身中毒反应。2.6 临床研究 临床研究是确认材料有效性、监测副作用的重要手段。赵兰花等33选取全口义齿修复患者 30 例，上颌作为实验组使用 2 wt%载银纳米二氧化钛 PMMA，下颌为自身对照组使用单纯 PMMA。3 个月后患者并未出现任何不适，并且实验组义齿组织面无病损者明显少于对照组（P 0.05）。此项研究在小范围人群中测试了新型义齿基托材料，属于临床一期试验。近些年来AgNPs/PMMA 材料的生物安全性研究以细胞系的毒性检测为主，体内实验和临床实验占比较少，仍需进一步研究。3 总结与展望 当纳米载银粒子与牙科材料相互作用时，它们的毒性可能会增加或减少，这必须对纳米复合材料进行特异性评估和多方面因素考虑。通过分析这种复合材料生物安全性的检测结果，可以得出以下结论：0 3 wt%、C（AgNPs）5g/mL、球型颗粒、磷酸锆载体的纳米载银粒子既可以提升义齿基托的抗菌性能又不影响机械性能，也是满足生物安全性的最优选择。目前大部分研究以细胞系的毒性检测为主，但生物实验结果不能保证器械或材料无潜在的生物危害，在临床使用期间还应该进行生物学调查，进一步观察是否对人体产生副反应或不良事件。总体来说，纳米载银义齿基托的研究对提高老年人的口腔健康具有重要意义，在未来的研究中应该鼓励探索和开发同时具有良好机械性能、抗菌性能和生物安全性能的义齿基托。参考文献1 Kosti M,Igi M,Gligorijevi N,et al.The Use of Acrylate Polymers in DentistryJ.Polymers(Basel),2022,14(21):45112 An S，Evans JL，Hamlet S,et al.Incorporation of antimicrobial agents in denture base resin:A systematic reviewJ.J Prosthet Dent,2021,126(2):188-195364 中华老年口腔医学杂志 2023 年 12 月第 21 卷第 6 期 Chin J Geriatr Dent,December,2023,VoI.21.No.6 3 王景蓉,高姗姗.义齿基托抗菌物质抗真菌和细菌感染的研究进展 J.中华老年口腔医学杂志,2020,18(6):356-360 Wang JR,Gao SS.Advances in research on antifungal and antibacterial effect of removable dentures J.Chin J Geriatr Dent,2020,18(6):356-3604 Nie P,Zhao Y,Xu H.Synthesis,applications,toxicity and toxicity mechanisms of silver nanoparticles:A review J.Ecotoxicol Environ Saf,2023,253:1146365 Zhang D,Yu F,Li H,et al.AgNPs reduce reproductive capability of 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