本科毕业论文---kiyik河胡杨内生细菌多样性分析及一株潜在新种的多相分类学鉴定.doc

新疆大学硕士毕业论文

硕士研究生学位论文

新 疆 大 学

论文题目（中文）：Kiyik河胡杨内生细菌多样性分析及一株潜在新种的多相分类学鉴定
论文题目（外文）：Diversity of Endophytic Bacteria from the Populus euphratica in kiyik ancient river and taxonomic identification of a novel bacterium

研 究 生 姓 名：布阿依夏姆·阿木提
学 科 专 业：生 物 学
研 究 方 向：微生物学
导师 姓名 职称：艾尔肯·热合曼 教授

论文答辩日期 2013年5 月 24 日
学位授予日期 年 月 日

Magisterial Thesis

Diversity of Endophytic Bacteria from the Populus euphratica in kiyik ancient river and taxonomic identification of a novel bacterium

Master Degree Candidate: Buayshem Hamood
Mentor: Prof. Erkin Rahman

College of Life Science and Technology, Xinjiang University
62

摘 要
本研究对位于塔里木河中游废弃343年的古河道胡杨林胡杨茎秆液进行可培养内生细菌的多样性分析。三颗胡杨茎秆液混合之后采用常规培养法分离得到80株纯培养物。其中25株从LB培养基，21株从NB培养基，16株从KB培养基而18株从MA培养基所分离到的。有32株杆状，45株短杆状和3株球状，17株革兰氏阳性，63株革兰氏阴性细菌。表型特征和16S rRNA基因序列系统发育分析结果显示，80株菌归类为厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）等5个类群，16个属，24个种。其中属于γ-变形菌的细菌为49株，占分离菌株的61.25%（49/80）；属于厚壁菌门的细菌为15株，占分离菌株的18.75%（15/80）；属于α-变形菌纲的细菌为10株，占分离菌株的12.5%（10/80）；属于放线菌门的细菌为7株，占分离菌株的8.75%（7/80）；属于拟杆菌门的细菌为1株，占分离菌株的 1.25%（1/80）。假单胞菌属(Pseudomonas)是占优势属，占分离菌株的43.75% (35/80)。
在80株细菌当中发现与Pseudomonas xinjiangensis、Pseudomonas sabulinigri、Pseudomonas azotifigens、Pseudomonas pelagia、Rhizobium rosettiformans、Microbacterium hydrocarbonoxydans、Microbacterium sedminis 、Halomonas sulfidaeris、Halomonas meridiana、Halomonas desiderata、Nesterenkonia aethiopica、Nesterenkonia suensis 、Nocardioides alkalitolerans、Planococcus maritimus、Pontibacter salisaro、Planomicrobium koreense和 Pantoea brenneri等模式菌株有着低于98.7%的16S RNA基因序列相似性的59株细菌。初步认为是14种潜在新分类单元，需对其进行进一步研究。
对潜在新种的详细多相分类学研究结果表明，菌株KBL-4-9是短杆状，无鞭毛，严格好氧，细胞内积累类脂粒（PHB，即poly-β-hydroxybutyric acid 聚-β-羟基丁酸）的革兰氏阴性菌株。生长温度是4-45℃（最适37℃），pH范围是6.0-9.0（最适pH 7.0），NaCl浓度范围是0-3%（w/v）（最适是0-1%）。 与Pseudomonas xinjiangensis S3-3T有97.24%的16S rRNA基因序列相似性和41.2%的DNA-DNA杂交率。基因组DNA的G+Cmol%含量是60.4%。主要脂肪酸组分有C16:0、Summed Feature 8、C17:0 cyclo、C19:0 cyclo w8c、C12:0、Summed Feature 3、C12:0 3OH和C10:0 3OH。基于表型特征，化学分类特征和遗传学特征分析结果，提议将菌株KBL-4-9归类为假单胞菌属的一个新物种，并命名为Pseudomonas Tograkense 。

关键词：Kiyik古河道；胡杨；内生细菌；多样性；16S rRNA； 多相分类学

Abstract
The aim of this study was to identify the culturable endophytic bacteria isolated from storage liquid of six Populus Euphratica stands at the ancient Kiyik River which dried up 343years before. Through conventional dilution-plating method, we isolated 80 pure cultivable strains. Among them, 25 strains were isolated on LB plates, 21 were isolated on NB plates, 16 were isolated on KB plates and 18 strains were isolated on MA plates. Gram staining and simple staining test results of the isolates shows that 17 strains were gram-positive, 63 strains were gram-negative, and 3 strains were coccus, 32 strains were rod-shaped and 45 strains were short rod-shaped. The phenotypic properties, biophysical characterization, 16S rRNA gene sequence analysis and phylogenetic analyses showed that 80 strains could be placed into five phylogenetic groups (γ-Proteobacteria, α-proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes and Bacteroidetes), 16 genera, and 24 species. Amomg them, 49 isolates belong to γ-Proteobacteria, occupy 61.25% (49/80) of total isolates; 15 isolates belong to Firmicutes, occupy 18.75% (15/80) of total isolates; 10 isolates belong to α-proteobacteria, occupy 12.5% (10/80) of total isolates; 7 isolates belong to Actinobacteria, occupy 8.75% (7/80) of total isolates and 1 isolates belong to Bacteroidetes, occupy 1.61.25% (1/80) of total isolates. Pseudomonas was the predominant genera, occupy 43.75% (35/80) of total isolates.
The 16S rRNA gene sequences of 59 isolates have showed similarity of lower than 98.7% to Pseudomonas xinjiangensis, Pseudomonas sabulinigri, Pseudomonas azotifigens, Pseudomonas pelagia, Rhizobium rosettiformans, Microbacterium hydrocarbonoxydans, Microbacterium sedminis, Halomonas meridiana, Halomonas meridiana, Halomonas desiderata, Nesterenkonia aethiopica, Nesterenkonia suensis, Nocardioides alkalitolerans, Planococcus maritimus, Pontibacter salisaro, Planomicrobium koreense and Pantoea brenneri respectively, are presumed to be potentially novel species.
Polyphasic approach using to KBL-4-9 showed that, strain KBL-4-9 cells are Gram-staining-negative, short-rod shaped, have no flagella, strictly aerobic, accumulate PHB in cell. Growth occurs between 4 and 45 ℃; The optimum temperature for growth is 37 ℃. The pH range for growth is 6.0-9.0, with an optimum pH 7.0. Growth occurs in the presence of 0-3 % (w/v) NaCl. Optimum NaCl1%. KBL-4-9 nearest relative of the strain Pseudomonas xinjiangensis S3-3T with 97.2%, 16S rRNA gene sequence similarity, 41.2% DNA–DNA relatedness. The G+C content of the genomic DNA was 60.4%. The major fatty acids were C16:0, Summed Feature 8, C17:0 cyclo, C19:0 cyclo w8c, C12:0, Summed Feature 3, C12:0 3OH and C10:0 3OH. The predominant isoprenoid quinone was Q-10. On the basis of phenotypic properties and phylogenetic inference, strain KBL-4-9T represents a novel species of the genus Pseudomonas, for which the name Pseudomonas Tograkense is proposed. The type strain is KBL-4-9T.
Key words: ancient Kiyik river; Populus Euphratica; endophytic bacteria; Diversity; 16S rRNA; Polyphasic approach

目 录

摘 要 3
Abstract 5
第一章 文献综述 9
1 胡杨概况 9
1.2 胡杨 9
1.3 胡杨林分布状况 9
1.4 Kiyik河胡杨林 9
2 植物内生菌概况 10
2.1 植物内生菌概念 10
2.2 内生菌与宿主植物的关系 10
2.3 植物内生菌代谢产物种类及其功能多样性 11
2.4 植物内生菌多样性研究进展 11
2.5 植物内生菌多样性研究方法 12
3 细菌多相分类研究方法 14
3.1 表型特征分析法 14
3.2 遗传学特征分析法 15
3.3 化学特征分析法 15
4 胡杨内生细菌研究进展 15
5 研究目的与意义 15
6 研究内容与技术路 16
6.1 研究内容 16
6.2 技术路线 16
第二章 Kiyik河胡杨内生细菌的分离鉴定及多样性分析 17
1、实验材料与方法 17
1.1 样品来源 17
1.2 培养基： 17
1.3 生化试剂 18
1.4 试验仪器 18
1.5 引物 18
2、 试验方法 19
2.1 样品的预处理 19
2.2 细菌的分离与CFU值的计算 19
2.3 细菌的纯化 19
2.4 细菌的染色与观察 19
2.5 细菌基因组DNA的提取 20
2.6 16S rRNA基因扩增 20
2.7 系统发育分析 21
2.8 培养基优势度的计算 21
2.9 菌种库的构建 21
3、结果 22
3.1 细菌的分离与纯化 22
3.2 不同培养基上生长情况 26
3.3 基于16S rRNA基因序列基础上的系统发育分析 26
3.4 基于不同培养基上的系统发育分析 34
4、 讨论 36
第三章 一株假单胞菌新种Pseudomonas Tograkense KBL-4-9的多相分类学鉴定 38
1、 试验材料 38
1.1 样品来源 38
1.2 模式菌株 38
1.3 试剂 38
1.4 仪器 38
1.5 引物 38
2、 试验方法 39
2.1 表型特征分析 39
2.2 生理生化特征分析 40
2.3 脂肪酸组分分析 41
2.4 DNA-DNA同源性测定 42
2.5 DNA的G+Cmol%含量测定 43
3、结果 43
3.1 表型特征 43
3.2 生理生化特征分析 44
3.3 脂肪酸组分分析 46
3.4 基于16S rRNA基因序列的系统发育分析 47
3.5 基因组DNA-DNA杂交率 49
3.6 基因组G+C%含量的测定 49
4、讨论 50
缩写表 54
参考文献 56
作者简介 63

第一章 文献综述
1 胡杨概况
1.2 胡杨
胡杨( Populus euphraticu)是隶属于杨柳科杨属一种古老、原始的荒漠特有树种，远在1.35亿年前就已出现，被称为“第三纪活化石”。树高一般15-30米，异形叶，雌雄异株，是干旱荒漠区生长的植物，从生物学特征上表现为表皮角质层较厚，叶面积相对较小，以此减少蒸腾作用带走的水分；根系发达，以获得足够的水分供应其本身的生长和蒸腾耗水[1]。胡杨树干内存液是胡杨对干旱高温环境条件适应性的产物，是植物应对高蒸发量的蓄水储备，是胡杨树利用它发达的根系吸收地下水，通过微管组织输送到树干、树枝及其末端的体内的蓄水[2]。
胡杨对极端环境有很强的抗逆性，在干旱沙漠地区唯一能生存的乔木，有“生而一千年不死，死而一千年不倒，倒而一千年不朽”的强大生命力。胡杨繁殖力高，生长慢、抗逆性强，对于改善生态环境，遏制沙漠化，保护生物多样性等诸多方面具有重要作用，是下游绿色走廊的一道生态屏障[3]。
1.3 胡杨林分布状况
胡杨广泛分布于阿尔及利亚，中国，埃及，印度，伊朗，伊拉克，以色列，利比亚，巴基斯坦，阿拉伯叙利亚共和国，土耳其，土库曼斯坦等的近20个欧、亚、非洲国家。中国仍是当今世界上胡杨分布范围最广、数量最多的国家。新疆分布着目前全世界上最大的天然胡杨林。其面积近3 0万公顷，约占全国胡杨林总面积的90％和全世界胡杨林总面积的55％以上，是极其珍贵的自然资源[4]。
1.4 Kiyik河胡杨林
在塔河中游（沙雅县至尉犁县）主河道的南面，塔克拉玛干沙漠的北部边缘荒漠区，遗留着历史上由于塔河改道而干枯的6条较大的废弃古河道遗迹。其中之一的Kiyik河流域没有人类建造的房屋，牲畜的圈棚和水井的遗迹，是未受人类活动影响的净土；古河道沿岸，不同程度的分布着依靠地下水维系生命的衰败状胡杨林。Kiyik河道是塔河中游的废弃343年的废弃古河道，由于Kiyik河和尉犁县卡尔区尕乡之间分布着直线距离29Km以上的沙丘荒漠（没有行车的道路），断流年代比较久远，脱离了塔河水系，因此分布在Kiyik河流域的胡杨林形成了在时间和空间上相对隔离封闭的生态体系。与塔河主河道相比kiyik河胡杨的长势较弯曲茎部分支多，表皮更粗糙，明显表达出了胡杨适应恶劣环境的形态特征。
2 植物内生菌概况
2.1 植物内生菌概念
植物内生菌一词由希腊语中的《endo》（在…之内）和《phyton》（植物）组成。内生菌概念最早是由De Bary在1866年提出，他认为生活在植物组织内的微生物为内生菌[5]，用以区分生活在植物表面的表生菌（Epiphyte）。1986年Carroll[6] 将内生菌定义为：是生活在活的植物组织内而对植物不引起明显病害症状的真菌，强调了内生菌与植物的互惠共生的关系。在1992年，Petrini[7]进一步扩大了内生菌的概念范畴，将内生菌定义为在其生活史中某一段时期生活在植物组织内，并对寄主不引起明显病害症状。其后，在1997年Hallmann等人指出[8]，植物内生菌是指从表面消毒的植物组织中分离而得到或从植物内部获得的，但它们的存在并未使植物的表型特征和功能有任何改变的细菌和真菌。
目前被广泛接受的定义是，能直接在植物组织内观察到或是从严格表面消毒的植物组织中分离得到，抑或是送植物组织中直接扩增到其核酸DNA的，不会使宿主植物表现出至少暂时不会表现明显的病状的微生物[9]。
2.2 内生菌与宿主植物的关系
地球上有约30万种植物，它们分布的环境各也各有差异，这些多种多样的植物为微生物提供了多元化的、极为复杂多样的栖息地。内生菌可以提高宿主植物的一些机制，包括形成的根外菌丝营养吸收，刺激根系生长，促进植物的新陈代谢，促进氮，磷的吸收，固氮，可以改善土壤或根系分泌物[10]。一些内生菌只将一种植物作为宿主，而另一些则有多种宿主植物。Petrini[11]表明，某些内生菌在寄主科水平上有专一性。也有研究中发现，寄主种的水平上有专一性的一些内生真菌。Carroll等人[12]发现分布在法国和瑞士的7种针叶树不同组织中存在不同物种的内生菌，并提出了组织专一性假说。
2.3 植物内生菌代谢产物种类及其功能多样性
植物内生菌代谢产物种类繁多，结构多样并具有各种生物学活性，主要有萜类、生物碱、皂苷类、芳香类、多肽类等[13]。这些代谢产物不仅能促进植物生长、固氮、抗疾病、抗害虫和提高宿主植物抗逆境能力，而且还有些物质有着抗肿瘤、抗病毒和抗菌作用 [13,14] 。
2.4 植物内生菌多样性研究进展
自20世纪30年代发现造成畜牧业重大损失的牲畜中毒是由于食用感染内生菌的牧草后，内生菌的研究才得以广泛地开展起来[15]。植物内生菌几乎存在于所有目前已研究过的植物中，分布广，种类多。研究表明，感染内生菌的植物宿主往往具有生长快速、抗逆境、抗病害、抗动物危害等优势，比未感染植株更具生存竞争力。大量研究表明，植物内生菌的种类、分布、定植都因植物种类不同而异。目前研究的关于微生态的植物已达上百种[16]。涉及藻类、针叶树、灌木和草本等多个类群，其中研究较多的植物有牧草、棉花(Gossypium hirsutum)、小麦(Triticum aestivum)、高粱(Sorghum bicolor)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、马铃薯(Solanum tuberosum)、甘蔗(Saccharum officinarum)、甜菜(Beta vulgaris)等。国际上已有许多从不同植物中分离可培养内生细菌的报道。Fiona Porteous Moorea, Tanja Baracb 等人从生长在BTEX（Benzene, Toluene, Ethylbenzene, Xylene）污染的杨树的根，茎，叶部分取样而分离了具有不同表型的121株内生细菌，用16S rDNA序列鉴定，BOX-PCR基因组DNA指纹技术来确定分离菌株的进化地位，所有分离菌株隶属于21个属，测定了分离菌株对目标污染物，重金属，抗生素的耐性，揭示了杨树内生细菌在提高植物修复过程的潜在特性[17]。Rodrigo Mendes, Aline A, Pizzirani-Kleiner 等人从甘蔗的根际，根内和茎部取样而分离了154株可培养内生细菌并鉴定16S rDNA序列，结果发现所有的分离菌株隶属于4个属，其中伯克霍德菌属（Burkholderia）占优势[18]。Pious Thomas .Ganiga K. Swarna等人通过16S rDNA序列鉴定分离于香蕉茎尖培养物的可培养和免培养内生细菌，这些细菌隶属于5个门和20个不同的属[19]。Anastasia Venieraki , Maria Dimou等人从希腊不同地区的小麦根际中分离了17株可培养固氮菌，隶属于3个属，并且研究促进植物生长的菌株的特性[20]。在国内河北大学生科院的Jigang Han等人把毛竹根际，根表面和根内组织作为样品使用2种培养基分离了182株菌株，鉴定了属于22个属的56个不同的分类单元的16S rDNA序列[21]。首都师范大学生科院的Lei Sun, Fubin Qiu等人把河北省农业试验站的水稻作为样品分离了可培养内生细菌，克隆192株菌株的16S rDNA基因，并鉴定了52个分类单元的基因序列[22]。近年来，从植物内生细菌中分离新的次生代谢活性物质和利用内生菌对植物病原菌进行生物防治成为了国内外研究的热点。截至到2008年在各种植物中发现的可培养植物内生细菌已超过129种，分别属于54个属[23] ,其中分离到的新种也相当可观。
2.5 植物内生菌多样性研究方法[24]
2.5.1 以生化技术为基础的研究方法
1) 平板计数和形态分析
通过人工配制的简单营养基质对土壤中的微生物进行定时定温培养，然后对生长的菌落进行计数、并通过形态构造和生理生化特性来鉴定种属。该方法直观快捷，而且可以提供具有代谢活性、异养类型等种群信息。然而，微生物在实际土壤生境中的生长与温度、pH 值、养分和种间的相互作用有很大关系，简单的人工模拟环境是无法满足其生长要求的。因此，这种方法仅能培养出极少数( 少于 1% ) 的微生物。
2) 群落水平生理学指纹( CLPP) 或单一碳源利用模式法( SSCU)
是基于某一微生物群落所含有的酶可催化利用特定的碳源基质，然后通过测定其利用能力和模式来评价微生物种群多样性。Garlan和Mills[25]于1991年首次提出该技术，经BIOLOG公司商业化后在土壤微生物群落功能多样性的评价研究中得到了广泛的应用[26]。BIOLOG 公司根据不同的检测目的开发了 ECO( 生态板) 、GP( 革兰氏阳性板) 、GN( 革兰氏阴性板) 、FF( 丝状真菌板) 和 MT 等一系列微平板。每个平板上有 96 个微井，其中 95 个微井的干膜上都含有碳源基质和氧化还原染料，一个不含碳源的微井用作对照。当微生物利用碳源进行呼吸时释放出的 NADH 还原染料并使其变色，然后通过测定氧化还原燃料的变色速率来推测微生物的呼吸速率，最终达到评价能利用碳源基质的微生物种类和利用程度的目的。
3) 生物标记法
生物标记法主要是利用微生物细胞内某种生化成分的结构特点来区别微生物种类。这种方法避免了传统培养法的缺陷，能比较客观地评价微生物多样性。方法的主要步骤是通过提取土壤微生物中的某种生化成分并纯化，然后利用气、液相色谱等化学手段对该种化学成分进行分类鉴定。常用的微生物多样性生物标记法有: 磷脂脂肪酸分析法和呼吸醌指纹法。
2.5.2 现代分子生物学技术
1) 荧光原位杂交技术( FISH)
利用探针可以直接和环境土壤样品、纯培养菌落进行原位杂交，获得自然和人工状态下微生物种类、相对丰度和空间分布信息。
2) 土壤宏基因组学
Handelsman等[27]于1998年首次提出宏基因组学的概念，即不需要经过培养、分离单一种类的微生物，而是利用现代基因组技术直接研究自然状态中环境微生物群落。土壤宏基因组学的主要任务之一就是揭示土壤微生物群落多样性。通过16S rRNA基因文库的构建和系统化分析来研究土壤微生物群落种类和存在丰度，并且挖掘有用的基因，使土壤微生物多样性分析更趋于完整客观。该方法的步骤主要包括土壤 DNA 的提取克隆文库的构建和筛选。
3) 基因指纹图谱技术
基因指纹图谱技术是基于基因在长度、成分和结构上的多态性，利用电泳方法将复杂的 PCR 扩增片断分离成简单的基因条带图谱，然后根据条带信息进行基因分析的技术。包括限制性片断长度多态(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、核糖体间隔区分析( ribosomal intergenic spacer analysis，RISA)、随机扩增多态性DNA( random amplified polymorphic DNA，RAPD)变性剂浓度梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)、温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel electrophoresis，TGGE)、时间温度梯度凝胶电泳(temporal temperature gradient gel electrophoresis，TTGE)和DNA单链构象多态性(single strand conformation polymorphism，SSCP)等技术。
3 细菌多相分类研究方法[28]
3.1 表型特征分析法
细菌的表型分类依据主要是形态特征和不同实验条件下的生长情况及代谢特征。
3.1.1 形态学特征
形态学特征易于观察和比较，尤其是在具有图书形态结构的细菌中；再说，许多形态学特征依赖于多基因的表达，具有相对的稳定性；最后根据形态学特征分类方法简单、快速、价廉。因而形态学特征被用作细菌分类和鉴定的重要依据之一。
3.1.2 生理生化特征
对原核生物生理生化特征的比较也可以说是间接进行基因组之间的比较。但是影响原核生物生理生化特征的因素多，因此根据生理生化特征来判断相关性或进化地位时，必须与其他特征尤其是基因型特征综合分析。
生理特征是指，细菌在固定条件下生长能力。而生化特征一般分为糖（醇）类代谢、氨基酸和蛋白质代谢、碳氮源利用能力、磷酸酯酶和DNA酶、溶血酶和凝固酶等其他酶活性及抑菌能力等。
3.1.3 蛋白质分析[29]
研究蛋白质组成差异最常用的方法是全细胞可溶性蛋白质电泳分析。关系密的菌株在一定生长期，细胞内蛋白质种类有很高的相似性。对同等条件下培养的细胞可溶性蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，可以得到反映生物基因组成的蛋白质图谱信息，进而分析获得菌株蛋白质图谱的多样性特征。用该方法可以区分种或种以下水平的菌株。在细菌多相分类研究中通常采用可溶性蛋白或全表蛋白提取液进行电泳图谱比较，或比较通过酶切电泳迁移率。
3.2 遗传学特征分析法
3.2.1 16S rRNA基因序列分析
提取基因组DNA，扩增出16S rRNA基因，再把PCR产物克隆到载体上进行测序，与16S rRNA数据库中的序列信息进行比较，确定其进化地位，从而鉴定微生物种类。
3.2.2 DNA碱基组分分析
染色体DNA的G+C含量也就是DNA的四种碱基G、C、A、T的组成具有特异性且不受菌龄和外界因素的影响，是细菌多相分类中的重要指标。一般认为同种细菌之间G+C含量差异不大于3%，同属种之间的差异不超过10%，因此G+C含量测定在判断细菌属水平分类上的的意义较重要[20]。
3.3.3 DNA-DNA同源性分析
核酸杂交技术，在1960年由Marmur, Doty等人[30][31]首次提出，Carl L. Schildkraut等人[32]应用于DNA-DNA同源性研究之后的大约50年里，被作为原核生物物种鉴定界限的金标准[33]。多相分类学研究中通常两株菌DNA同源性在70%以下可判断其为不同的物种，而在70%以上的同源性为同一种不同变种的细菌[25]。
3.3 化学特征分析法
化学分类是指研究微生物细胞不同化学特性，并利用这些特殊性对生物个体进行分类鉴定。在微生物细胞中存在的某些化学物质与该生物，具有分类学意义的化学物质的存在状况可以作为鉴定微生物的指标。细菌化学特征分析包括脂肪酸、分枝酸、呼吸醌和细胞壁肽聚糖组分的分析。
4 胡杨内生细菌研究进展
本研究室毕业的卡依尔等人在2010年，从Ugan古河道胡杨中分离出了不同形态的，分别属于厚壁菌门、放线菌门、α-变形菌纲和γ-变形菌纲等4个大类群，18个属32个种的62株可培养细菌，其中有9个潜在新种。为植物内生菌增加了10个属18个种。
5 研究目的与意义
上述研究初步对胡杨林极端环境下微生物类群进行了研究。为了进一步补充和完善干旱极端环境下微生物类群分布特性，全面系统的弄清胡杨林片区可培养细菌的类型，种群结构，分布状况，构建菌种系统发育树，挖掘出一批当地新菌种和罕见菌种，进行目前kiyik河上游细菌分离鉴定以及多样性分析的研究。
本研究的目的是采集kiyik河古河道胡杨林胡杨茎杆液样，经过筛选得到纯化菌株，用现代分子生物学的方法对分离到的菌株进行多相分类，以确定分离菌株的分类学地位，并采用16S rRNA基因序列基础上进行系统发育分析，研究微生物的多样性。
本研究的意义在于：（1）由于受到的人类影响少，期待从原始环境中发现中国新记录种和潜在的国际新种；（2）对于所鉴定的细菌进行筛选，选择对于我们生产生活具有重要意义的产物进行研究。
6 研究内容与技术路
6.1 研究内容
从塔里木河中游已断流343 年的Kiyik古河道沿岸的原生态胡杨林的3棵胡杨作为采样目标，抽出胡杨树干内存液，用四种培养基（LB、NB、MA、KB）进行可培养细菌的分离与纯化，鉴定16S rDNA序列，分析塔河中游胡杨内生细菌的多样性与群落结构；分离拯救一批不可多得的珍稀菌种和土著菌种，并挖掘出对宿主植物具有生防功能的菌种资源。
6.2 技术路线

第二章 Kiyik河胡杨内生细菌的分离鉴定及多样性分析

1、实验材料与方法
1.1 样品来源
本课题组在2011年4月从分布在塔河中游（沙雅县至尉犁县）主河道南面的Kiyik古河道胡杨林中采集了胡杨茎杆液样品。采样点GPS位置分别是A: N40°42′8″E 85°23′22″，B: N40°43′22″E 85°19′18″，C: N40°43′19″E 85°19′09″。样品地理位置及采集过程见图1。

图1 采样点地理位置
1.2 培养基：
本研究共选用了LB、NB、KB和MA等四种培养基，配方如下：

1.3 生化试剂
Taq聚合酶、dNTP和引物均购自上海生工生物工程有限公司，酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）和氯仿/异戊醇（24:1）在实验室自己配，其余化学试剂均购自乌市沙区伟业责任有限公司。
1.4 试验仪器
苏州安泰空气技术有限公司的SW-CJ-IF生物超净工作台、上海跃进医疗器械一厂的PYX-DHS-50×65恒温培养箱、德国基因公司的Eppendorf Mastercycler PCR仪、美国OLYMPUS公司的CX21FS1 OLYMPUS显微镜、北京六一仪器厂的DYY-III-3A水平电泳槽、sigma公司小型超速低温离心机、美国Alphaimage公司的Alphaimage2200TM凝胶成像仪。
1.5 引物
表1 扩增16S rRNA基因序列所采用的引物及序列

2、 试验方法
2.1 样品的预处理
将两个采样位点的胡杨茎杆液样品以等比例混合，配成混合液样。
2.2 细菌的分离与CFU值的计算
混合液样中取出10ml，添加至90ml灭菌过的生理盐水中，37℃下以120rpm震荡25min，以稀释涂布平板法[35]分别涂布在LB、NA、MA和KB等四种培养基上，在37℃下培养2到7d。选出生长的菌落数在20-300个范围之间的平板进行计数，并计算出每种培养基的CFU/ml值。
2.3 细菌的纯化
选择出在菌落颜色、形状、边缘、隆起状况等特性上有差异的菌株，使用平板划线法获得纯培养物。
2.4 细菌的染色与观察[20]
2.4.1 简单染色
1) 载玻片上滴一滴生理盐水，将沾有菌苔的接种环置于载玻片上的生理盐水中涂抹，使形成均匀薄膜。
2) 将涂片自然干燥。
3) 涂菌面向上，快速通过火焰3-4次。
4) 载玻片上滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位静止1min即可。
5) 将染液用水小心冲洗，至洗脱液无色为止。
6) 用吸水纸吸取多余水分，自然干燥。
7) 将制备好的样片置于显微镜下进行观察、记录。
2.4.2 革兰氏染色[36]
1) 用接种环挑取少许细菌，涂布在载玻片上的一滴生理盐水中，干燥。
2) 滴一滴结晶紫混合染液2min后，用水洗。
3) 碘液作用1min，水洗，吸干。
4) 用95%乙醇脱色流滴至洗脱液无色（大约30s）。
5) 用番红染液2-3min，水洗，干燥。
6) 镜检。深紫色为革兰氏阳性，红色为革兰氏阴性细菌。
2.5 细菌基因组DNA的提取
2.5.1 裂解液法[37]（方法一）：
1) 菌株在10ml液体培养基中培养至对数生长期，将1.5ml菌液12000rpm离心5min，收集菌体。
2) 加1000ml预冷丙酮，8000rpm离心2min。
3) 弃上清，沉淀加500μlTE，震荡混匀，8000rpm离心5min。
4) 将沉淀溶于800μl裂解液，吹打混匀。
5) 冰浴5分钟，之后置于70-75℃温育30min，加入200μl 5mol/L氯化钠溶液，1400rpm离心10-15min。
6) 上清加200μl酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），颠倒（4到5次）混匀。1400rpm离心10min。
7) 上清加两倍体积的预冷无水乙醇，14000rpm离心7m