枯草芽孢杆菌母药统一标准.doc

G25
Q

江苏苏滨生物农化有限公司公司原则

Q/320922 BN 032-

1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌母药

-08–18发布 -08–30实行
江苏苏滨生物农化有限公司 发布

前 言

本原则按照 GB/T1.1—《原则化工作导则 第1某些：原则构造和编写》和GH/T2467.8—《农药母药产品原则编写规范》进行编制而成。
本原则附录A为规范性附录。
本原则附录B为资料性附录。
本原则由江苏苏滨生物农化有限公司提出并起草。
本原则重要起草人：赵福兵、许军、沈文权。

Ⅰ

引 言

1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌母药是我公司自行研制开发微生物发酵产品。
1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌母药通过加工可以重要用于防治水稻纹枯病、稻曲病。
经测定1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌母药对大白鼠经口毒性LD50雌、雄性均＞4640mg/kg，经皮毒性为LD50雌、雄性均＞2150mg/kg。

Ⅱ

1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌母药
本品有效成分其她名称、构造式和基本物化参数如下：
a)枯草芽孢杆菌
中文通用名称：枯草芽孢杆菌—+菌株编号。
拉丁学名：Bacillus subtilis。
分类地位：细菌（Bacteria）；厚壁菌门（Firmicutes）;芽孢杆菌纲（Bacilli）；芽孢杆菌目（Bacillales）；芽孢杆菌科（Bacillaceae）；牙孢杆菌属（Bacillus）。
形态学特性：菌体呈杆状，单个、成对或短链排列，大小为0.7µm～0.8µm×2.0µm～3.0µm，无荚膜，周生鞭毛，能运动；芽孢0.6µm～0.9µm×1.0µm～1.5µm，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大；革兰氏染色阳性；菌落圆或不规则形，表面粗糙不透明，可以起皱，呈奶油色或污白色。
有效成分重要存在形式：芽孢。
重要生物活性：抑菌（防病）。
培养保存条件：最适生长温度为30℃—37℃；适合培养基为营养琼脂（NA）或营养肉汤（NB）培养基；适当贮存温度为0℃—4℃。

1 范畴
本某些规定了细菌微生物农药枯草芽孢杆菌母药规定、实验办法、检查与验收以及标志、标签、包装、贮运。
本某些合用于以芽孢为重要活性成分粉状枯草芽孢杆菌母药。
2 规范性引用文献
下列文献中对于本文献应用是必不可少。凡是注日期引用文献，仅注日期版本合用于本文献。凡是不注日期引用文献，其最新版本（涉及所有修改单）合用于本文献。
GB/T 1601-1993农药pH值测定办法
GB/T 1604-1995商品农药验收规则
GB/T 1605-商品农药采样办法
GB 3796-农药包装通则
GB/T 8170- 数值修约规则与极限数值表达和鉴定
GB/T16150-1995 农药粉剂、可湿性粉剂细度测定办法
3 术语和定义
下列术语和定义合用于本文献。
3.1 枯草芽孢杆菌母药Bacillus subtilis technical concentrates(TK)
由枯草芽杆菌纯菌种经发酵而获得高含量芽孢菌粉，普通状况下还会包括随着发酵过程少量生物组分和化学杂质。
3.2 菌落形成单位 colony forming units（cfu）
是将枯草芽孢杆菌母药用水稀释后得到菌泫通过涂布办法，让其单个芽孢分散在琼脂平板上，待培养后每活芽孢形成一种菌落，即一种菌落形成单位（cfu），通过肉眼观测菌落数量来推算单位微生物农药样品中活芽孢含量。
3.3 杂菌数 number of microbial contaminants
枯草芽孢杆菌母药样品中，除枯草芽孢杆菌菌落以外其她微生物菌落数之和。
3.4 杂菌率 rate of microbial contaminants
枯草芽孢杆菌母药样品中除枯草芽孢杆菌外，其她菌（真菌和细菌等）量占总菌量百分率。
3.5 贮存稳定性 storage stability
枯草芽孢杆菌母药在室温和（或）低于室温下贮存一定期间后，产品活菌数占其标明值相对百分率。
4 规定
4.1 外观：普通为灰白色或棕褐色粉状物，由于发酵基质不同颜色偶有差别，但应为均匀疏松粉末，不可有团块。
4. 2 枯草芽孢杆菌母药质量控制项目指标应符合表1规定。
表1 枯草芽孢杆菌母药质量控制项目指标
项 目
指 标
含孢量，亿cfu/g
1000±50
杂菌率，% ≤
2.5
pH值范畴
5.0～8.0
干燥减量，% ≤
5．0
细度（通过45µm实验筛），% ≥
90
贮存稳定性a，% ≥
80
a为定期检查项目3个月检测一次。
5 实验办法
除另有阐明，本办法所用试剂均为化学纯及以上，所用溶液均为水溶液。
5.1 抽样
按照GB/T 1605规定进行样品采集，用随机数表法拟定抽样包装件，最后抽样量不少于100g。采样时必要特别注意样品代表性和避免污染，采样容器和采样工具应通过消毒灭菌，样品采集后应及时进行检查，若不能及时检查，需贮存在4℃冰箱中。
5.2 菌种鉴别
依照代表菌株形态学和生理生化特性进行菌种鉴别，并可辅助脂肪酸分析、Biolog、16SrRNA序列分析等手段。当对鉴别成果有争议或需要进行法律仲裁检查时，应到具备菌种鉴定资质单位，将待检菌种与模式菌种进行比对，出具菌种鉴定报告，作为仲裁根据。
鉴别办法见附录A。
5.3 含孢量测定
5.3.1 办法提示
采用平板菌落计数法。将母药润湿、稀释后，均匀涂布在培养基平板上，待各芽孢菌体形成菌落后，记录菌落总数，以单位样品（g）中菌落形成单位数（cfu）表达活芽孢含量（cfu/g）。
5.3.2 试剂和溶液
试剂：Tween-20或Triton X-100；
溶液：0.05%Tween-20或0.05%Triton X-100。
5.3.3 重要仪器、设备
天平：精度为0.01g
移液器：20µL～200µL,200µL～1000µL；
高压蒸汽灭菌器；
超净工作台；
恒温振荡器；
恒温培养箱。
5.3.4 实验环节
5.3.4.1 样品准备
在无菌操作条件下，将样品搅拌均匀，精确称取3.0g样品，溶入27.0mL含0.05% Tween-20或0.05%Triton X-100无菌水中浸泡30minb后，振荡30min，得到稀释10倍样品溶液，标记为0号。然后参照表2（以稀释7次为例）进行梯度稀释。
表2 梯度稀释示例
编号
0
1
2
3
4
5
6
7
灭菌水体积，mL
27.0
9.0
9.0
9.0
9.0
9.0
9.0
9.0
加入上一稀释浓度溶液体积，mL
---
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
合计稀释倍数
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
5.3.4.2 涂板计数
将上述各梯度稀释液分别吸取100μL于NA平板上，并用L形玻棒均匀涂布在整个平板表面，每1稀释度做3次重复，然后置于37℃培养24-48h后，选取适当稀释度，取菌落数在30～300个之间平板进行计数。
5.3.5 菌落总数计算办法
5.3.5.1 若只有一种稀释度平板上菌落数在适当计数范畴内，则计算该稀释度3个重复平板菌落数平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g实验中菌落数。如第7号稀释度3个平板菌落数分别为98、100、102，则该试样菌落数：
N= [(98+100+102)÷3]×108×10=1.0×1011cfu/g
5.3.5.2 如有两个持续稀释度平板菌落数均在适当计数范畴之类，则按式（1）计算：
N=∑C / [(1×n1+0.1×n2) ×0.1×d] …………………………………… (1)
式中：
N—单位样品(g) 中菌落数（cfu/g）
∑C—平板（含适当范畴菌落数平板）菌落数之和
n1—第1个适当稀释度调查平板数
n2—第2个适当稀释度调查平板数
d—第1稀释度稀释因子
示例：
如果第1稀释度（10-7）菌落数（cfu）为110、105、100，第2稀释度（10-8）菌落数（cfu）为15、16、17，则依照式（1）计算。
N=（110+105+100+15+16+17）/[（1×3+0.1×3）×0.1×10-8]=1.1×1011cfu/g
5.4 杂菌率测定
按5.3办法进行测定，NA培养基检测样品中细菌杂菌；选取PDA培养基检测样品中真菌杂菌。然后记录总可见杂菌菌落数量，杂菌率按式（2）计算。
X=
N1+N2
×100……………………………………………………(2)
N1+N2+N3

式中：
X——杂菌率，单位为百分率（%）；
N1——细菌杂菌菌落数总和，单位为cfu；
N2——真菌杂菌菌落数总和，单位为cfu；
N3——有效成分枯草芽孢杆菌菌落数总和，单位为cfu。
5.5 pH值测定
按GB/T 1601-1993规定进行。
5.6 细度测定
按GB/T 16150-1995中2.2规定进行。
5.7 干燥减量测定
5.7.1仪器、设备
扁形称量瓶：直径40mm；
电热干燥箱：控温范畴（50℃～200℃），误差±2℃；
干燥器。
5.7.2 实验环节
称取试样10g（精准至1mg），置于预先恒重称量瓶中，将此瓶放入105℃±2℃电热恒温干燥箱内干燥，1h后取出，在干燥器中冷却至室温，称重。
5.7.3 测定成果
干燥减量按式（3）计算。
W =
m-m1
×100……………………………………………………(3)
m
式中：
W——干燥减量，单位为百分率（%）；
m——试样质量，单位为克(g)；
m1——干燥后试样质量，单位为克(g)。
5.8 贮存稳定性
5.8.1 办法提纲
将试样密闭放置于 5℃贮存24个月或20℃—25℃贮存12个月后，对含孢量进行测定，计算其占标明值百分率，规定不低于80%。
5.8.2 仪器、设备
冰箱；
恒温箱：控温范畴（0℃～50℃），控温误差±2℃；
玻璃瓶：带有密封盖或瓶塞，能充分保证其密封性。
5.8.3 实验环节
将20g试样放入玻璃瓶中，使其铺成平滑均匀层，密封后置于5℃冰箱中放置24个月或20℃～25℃恒温箱中放置12个月后按5.3办法测定样品中含孢量，并计算其占标明值百分率。
6 产品检查与验收
应符合GB/T 1604-1995规定。极限值解决应按GB/T8170-中4.3.3规定进行。
7 标志、标签、包装、贮运
7.1 1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌母药标志、标签和包装，应符合GB3796-中关于规定，并应有农药生产批准证书号、原则号、农药登记证号、商标和使用范畴。
7.2 包装：1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌母药内衬塑料袋硬纸桶（或牛皮纸袋、编织袋），每桶（袋）不超过25kg。也可依照顾客规定或订货合同，采用其他形式包装，但要符合GB 3796-规定。
7.3 贮运：贮运时严防日晒及35℃以上高温，置于阴凉干燥处。运送时，注意轻放，防止破损。不得与有毒有害物质混装、混运。
7.4 安全：在使用阐明书或包装标签上应注明毒性、防护办法等。
7.5 保质期：在正常贮运条件下，质量保证期从生产日期算起，二年内产品含孢量不低于标明值80%。

附 录 A
（规范性附录）
菌种鉴别办法

A1 重要仪器设备和材料
除常规微生物实验操作所需要设备和培养条件外，其她还涉及：天平（感量0.0001g）；生物显微镜（10×100倍）；高压灭菌锅；恒温培养箱；移液器；移液管，试管（15mL）及试管架；菌落计数仪（可选）；匀质器；L—玻璃棒；培养皿（Ф9cm）；载玻片；盖玻片等。
A2 重要培养基和试剂
A2.1 试剂
结晶紫、乙醇、草酸氨、碘、碘化钾、丙铜、番红、过氧化氢、氢氧化钠、肌酸、D—葡萄糖、L—阿拉伯糖、D—木糖、D—甘露醇、溴甲酚紫、可溶性淀粉、对二甲基氨基苯甲醛、浓硫酸、浓盐酸、L—酪氨酸0.5g、FeCl3、氯化钠、硝酸钾、a-萘酸、二苯胺、乙醚、马尿酸钠、柠檬酸钠、丙二酸钠等。
A2.2 培养基
蛋白胨水培养液（pH7.6）、营养琼脂培养基（NA）（pH7.0～7.4）、营养肉汤培养基（NB）（pH7.0～7.4）、厌养培养基、明胶培养基（pH7.2～7.4）、丙酸盐培养基（pH7.0～7.4）、柠檬酸盐培养基（pH7.0～7.4）、苯丙氨酸培养基（pH7.0），制备办法参见附录B。
A3 形态学特性鉴别
A3.1 染色
将在NA培养基上生长18h～24h目的菌涂片，空气干燥（非热固定）后，进行革兰氏染色，蓝紫色为阳性，红色为阴性。
A3.2 菌体观测
用生物显微镜观测菌体形态、鞭毛着生状况、运动状况及芽孢形态等。
A3.3 菌落形态观测
在NA培养基上生长，30℃培养48h后，观测菌落形态和产色素等。
A4 生理生化特性鉴别
枯草芽孢杆菌及其近似种重要生理生化特性见表1。

表1 枯草芽孢杆菌及其近似种重要生理生化特性
序号
特 征
枯草芽
孢杆菌
蜡质芽
孢杆菌
地衣芽
孢杆菌
巨大芽
孢杆菌
球形芽
孢杆菌
苏云金芽孢杆菌
01
接触酶反映
+
+
+
+
+
+
02
厌氧生长
-
+
+
-
-
+
03
V—P反映
+
+
+
-
-
d
04
产

酸
D—葡萄糖
+
+
+
+
-
+
L—阿拉伯糖
+
-
+
d
-
-
D—木糖
+
-
+
d
-
-
D—甘露醇
+
-
+
d
-
-
05
葡萄糖产气
-
-
-
-
-
-
06
水解
明胶
+
+
+
+
d
+
淀粉
+
+
+
+
-
+
07
运用
柠檬酸盐
+
+
+
+
d
+
丙二酸盐
-
ND
+
ND
ND
ND
08
酪氨酸水解
-
+
-
d
-
d
09
苯丙氨酸脱氨酶
-
-
-
d
+
-
10
卵黄反映
-
+
-
-
-
d
11
硝酸盐还原反映
+
+
+
d
-
+
12
吲哚反映
-
+
-
-
-
-
13
马尿酸反映
-
-
+
ND
ND
ND
14
pH
5.7

6.8

15
7%NaCl生长反映
+
d
+
d
d
+
16
55℃生长反映
-
-
+
-
-
-
注：“+”为阳性反映，“-”为阴性反映；“d”表达可以浮现“+”或“”两种状况，“ND”表达未开展过该项实验。
A4.1 接触酶反映：取少量37℃下培养24h斜面菌种，涂片在已滴加3%过氧化氢玻片上，如有气泡产生为阳性，无气泡则为阴性。
A4.2 厌氧生长反映：用接种环将一小环新鲜菌培养物穿刺接种于厌氧培养基，30 ℃下培养3d左右观测，仅在表面生长为阴性，如沿穿刺线生长或在下部生长为阳性。
A4.3 V—P反映：将菌种接入NB培养液中，37℃振荡培养24h，取培养液与40%NaOH等量混合，加少肌酸（即0.5mg～1.0mg）后，剧烈振荡，10min后若浮现红色，则为V—P阳性反映。
A4.4 产酸实验：分别配制含10%D—葡萄糖、L—阿拉伯糖、D—木糖、D—甘露醇水溶液，然后用等体积蛋白胨水培养液稀释至浓度为5%，并调节pH至7.0，然后加入少量0.04%溴甲酚紫溶液，并接入纯培养待检测菌株，37℃下培养7d后观测批示剂颜色变化，若变黄，表达产酸；若有气泡产生阐明产气。
A4.5 淀粉水解实验：灭菌前在NA培养基中加入0.2%可溶性淀粉，取新鲜斜面培养物点种于上述平板，30℃下培养2d～5d待形成明显菌落后，在平板上滴加碘液平板呈蓝黑色，菌落周边如有不变色透明圈，表达淀粉水解阳性；仍是蓝黑色为阴性。
A4.6 明胶液化实验：将菌株接种于明胶培养基斜面上，于20℃温箱中培养，2d、7d、10d、14d和30d在20℃以上室温观测菌生长状况和明胶与否液化。如菌已生长，明胶表面无凹陷且为稳定凝块，则明胶水解阴性；如明胶凝块某些或所有在20℃如下变为可流动液体，则为明胶水解阳性。
A4.7 柠檬酸盐运用实验：在柠檬酸盐培养基上划线接种，37℃培养3d～5d，培养基为碱性（批示剂变蓝色或桃红色）者为阳性，否则为阴性。
A4.8 丙酸盐运用实验：用幼龄菌种接种丙酸盐培养基，37℃培养1d～2d，培养基由绿变蓝为阳性；培养基不变色者为阴性。
A4.9 酪氨酸水解实验：灭菌前在NA培养基中加入0.5%L—酪氨酸，然后将测试菌接种于该培养基平皿上，培养7d～14d，酪氨酸结晶被水解而变透明为阳性，否则为阴性。
A4.10 苯丙氨酸脱氨酶实验:将菌株在苯丙氨酸培养基斜面上于37℃培养24d，然后将10%FeCl3溶液滴4滴～5滴于生长菌斜面上，当斜面上冷凝水中产生绿色时为阳性反映，即表白已经形成了苯丙酸铜，不变则为阴性。
A4.11 卵黄反映：将鸡蛋表面用70%酒精擦洗干净，在无菌条件下取卵黄加入等量生理盐水，摇匀后，取10mL悬液加入到融化、约50℃～55℃200mL培养基中，然后制成卵黄平板过夜后备用。取18h-24h斜面或培养液中菌体点种在上述平板上，37℃培养24h-48h后观测，如菌落四周或下面有不透明圈浮现，表达卵磷脂分解生成脂肪，阐明卵磷脂酶阳性。
A4.12 硝酸盐运用反映：灭菌前在NB培养液中加入0.1%硝酸钾，调节pH至7.0～7.6。将菌株接种于硝酸盐液体培养基中，置室温培养1d、3d、5d，当培养液中滴入A液、B液（参观附录B），如溶液变为粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色等表达有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。如果无红色浮现，可滴加1滴～2滴二苯胺试剂，此时如呈蓝色反映，则表达培养液中仍无硝酸盐，又无亚硝酸盐反映，表达无硝酸盐还源作用；如不呈蓝色反映，表达硝酸盐和形成亚硝酸盐都已还原成其她物质，故仍应按硝酸盐还原阳性解决。
A4.13 吲哚反映：将新鲜菌种接入蛋白胨水培养液中培养1d、2d、4d、7d，沿管壁缓缓加入3mm～5mm高寇氏吲哚反映试剂于培养液表面，在液层界面发生红色，即为阳性反映。如颜色不明显，可加入4滴-5滴乙醚并摇匀，使乙醚分散于液体中，然后静止半晌，待乙醚浮至液面后再加吲哚试剂。
A4.14 马尿酸盐水解反映：NB培养液中加入1%马尿酸钠，接入新鲜菌种，培养4周～6周后，取1mL培养物与1.5mL50%硫酸混合，若浮现结晶，则表达马尿酸盐形成安息香酸，为马尿酸盐水解阳性反映。
A4.15 pH反映实验：用盐酸分别调节NB培养液pH至5.7和6.8，然后接入新鲜菌液一环，同步接种普通NB培养液（pH7.2）作对照。适温培养1d～3d后观测生长状况。该培养液规定十分澄清，pH应精确，最佳用pH计调测。
A4.16 NaCl反映实验：用灭菌试管配制含表7%氯化钠NB培养液，然后在各试管中接种10微升菌液，37℃培养48h后肉眼观测并记录菌生长状况。
A4.17 温度反映实验：将新鲜菌液接入NB培养液中，然后置于55℃温度下进行培养，并设不接菌培养液作对照，3d后观测生长状况。

附 录 B
（资料性附录）
稀释液和培养基制备

B1 稀释液
B1.1 结晶紫混合液
甲液：结晶紫，2.0g；乙醇（95%），20mL；
乙液：草酸铵，0.80g；蒸馏水，80mL；
将甲乙两液相混，静置48h后过滤使用。
B1.2 碘液
碘，1.0g；碘化钾，2.0g；蒸馏水，300mL。先用蒸馏水少量（3mL～5mL）深解碘化钾，再投入碘片，待碘所有溶解后，加水稀释至300mL。
B1.3 格里斯氏（GRIESS）试剂
A液：对氨基苯磺酸，0.5g；稀醋酸（10%）左右，150mL。
B液：a-萘乙酸，0.1g；蒸馏水，20mL；稀醋酸(10%)左右，150mL。
B1.4 二苯胺试剂
二苯胺0.5g深于100mL浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释。
B1.5 寇氏（Kovacs’ reagent）吲哚试剂
对二甲苯氨基苯甲醛，8g；乙醇，760mL；浓盐酸，160mL。
B2 培养基
B2.1 成分
B2.1.1 蛋白胨水培养液（pH7.6 ）
蛋白胨10g，氯化钠5.0g，蒸馏水，1000mL。
B2.1.2 营养琼脂培养基（NA）（pH7.0～7.4）
牛肉膏，3.0g；蛋白胨，5.0g；琼脂，20.0g，蒸馏水，1000mL。
B2.1.3 营养肉汤培养基（NA）（pH7.0～7.4）
牛肉膏，3.0g；蛋白胨，5.0g；蒸馏水，1000mL。
B2.1.4 厌养培养基
酪素水解物，20g；NaCl，5g；疏基醋酸钠，1g；甲醛次硫酸钠，1g；琼脂，15g；蒸馏水，1000mL。
B2.1.5明胶培养基（pH7.2～7.4）
蛋白胨，5g；明胶，100g～150g；水，1000Ml。
B2.1.6 丙酸盐培养基（pH7.0～7.4）
酵母膏，1.0g；硫酸铵，2.0g；磷酸氢二钾，0.6g；磷酸二氢钾，0.4g；NaCl，2.0g；丙二酸钠，3.0g；溴百里酚蓝，0.025g；水，1000mL。
B2.1.7 柠檬酸盐培养基（pH7.0～7.4）
氯化钠，1.0g；七水硫酸镁，0.2g；磷酸二氢氨，0.5g；柠檬酸钠，2g；0.01%酚红液；1000mL。
B2.1.8 苯丙氨酸培养基（pH）
酵母膏,3g；磷酸氢二纳，1g；氯化钠，5.0g；琼脂，12g；L-苯丙氨酸，1g；水，1000mL。
B2.2 制法
将上述成分溶解，分装于三角瓶中，塞上棉塞包扎好后于（121±1）℃下高压灭菌20min。