苦苣菜总黄酮提取工艺的优化及鉴别模板.doc

第八届“挑战杯”甘肃省大学生
课外学术科技作品竞赛

序号：
编码：

第八届“挑战杯”甘肃省大学生课外学术科技作品竞赛

作 品 申 报 书

作 品 名 称： 苦苣菜总黄酮提取工艺优化及判别
学 校 全 称： 天水师范学院
申报者姓名
（集体名称） 马静静
类别：

√自然科学类学术论文
□ 哲学社会科学类社会调查汇报和学术论文
□ 科技发明制作A类
□ 科技发明制作B类

说 明
1．申报者应在认真阅读此说明各项内容后按要求具体填写。
2．申报者在填写申报作品情况时只需依据个人项目或集体项目填写A1或A2表，依据作品类别（自然科学类学术论文、哲学社会科学类社会调查汇报和学术论文、科技发明制作）分别填写B1、B2或B3表。全部申报者可依据情况填写C表。
3．表内项目填写时一律用钢笔或打印，字迹要端正、清楚，此申报书可复制。
4．序号、编码由“竞赛组委会填写。
5．学术论文、社会调查汇报及所附相关材料必需是汉字（若是外文，请附汉字本），请以4号楷体打印在A4纸上，附于申报书后，字数在8000字左右（文章版面尺寸14.5×22cm）。
6． 每个学校选送参与竞赛作品总数不得超出30件，每人限报一件。硕士作品不得超出作品总数1/2，其中，博士硕士作品不得超出3件。
7．作品申报书须按要求由各校竞赛组织协调机构统一报送。
8．其它参赛事宜请向本届竞赛组织协调机构咨询。
9．报送地址：第八届“挑战杯”甘肃省大学生课外学术科技作品竞赛组委会秘书处办公室（兰州大学团委）
联 系 人：姚志海 王永仁
联络电话：[phone] 8912914
传 真：[phone]
地 址：兰州市天水南路222号 兰州大学团委
邮政编码：730000
A1. 申报者情况（个人项目）

说明：1、必需由申报者本人按要求填写，申报者情况栏内必需填写个人作品第一作者（负担申报作品60%以上工作者）；
2、本表中学籍管理部门签章视为对申报者情况确实定。
申

报

者

情

况
姓 名
马静静
性别
女
出生年月
1987.8
学校全称
天水师范学院
专 业
生物科学
现 学 历
本科
年级
四
学制
4年
入课时间
.9
作品全称
苦苣菜总黄酮提取工艺优化及判别
毕业论文题目
红茂草抑菌机理
通讯地址
甘肃省天水市天水师范学院57号信箱
邮政编码
741000
联络电话

常 住 地
联络地址
天水师范学院博闻公寓五单元202
邮政编码
741000
单位电话

合作者情况
姓 名
性 别
年 龄
学 历
所 在 单 位
齐晓燕
女
22
本科
天水师范学院
高健
男
22
本科
天水师范学院
资

格

认

定
学校学籍管理部门意 见
是否为7月1日前正式注册在校全日制非成人教育、非在职各类高等院校中国籍学生（含专科生、本科生和硕士）。
√ 是 □ 否
若是，其学号为：
（部门盖章）
年 月 日
指导老师意 见
（1-2名）
本作品是否为课外学术科技或社会实践活动结果
√ 是 □ 否

指导老师署名：
年 月 日

B1．申报作品情况（自然科学类学术论文）
说明：1、必需由申报者本人填写；
2、本部分中科研管理部门签章视为对申报者所填内容确实定；
3、作品分类请按作品学术方向或所包含关键学科领域填写。
4、硕士硕士、博士硕士作品不在此列。
作品全称

作
品
分
类
（ D ）A、机械和控制（包含机械、仪器仪表、自动化控制、工程、交通、建筑等）
B、信息技术（包含计算机、电信、通讯、电子等）
C、数理（包含数学、物理、地球和空间科学等）
D、生命科学（包含生物、农学、药学、医学、健康、卫生、食品等）
E、能源化工（包含能源、材料、石油、化学、化工、生态、环境保护等）
作品撰写目标和基础思绪

本文关键研究提取苦苣菜中总黄酮最好提取工艺, 对芦丁提取材料选择含有一定指导意义。为开发和利用苦苣菜中有效成份提供理论依据。本文采取单原因和正交试验方法探讨乙醇提取法提取苦苣菜中总黄酮最好提取工艺,而且经过对黄酮类进行判别，得出芦丁含量极高
作品科学性、优异性及独特 之 处

采取科学试验方法（如单原因控制变量，设置对照试验等）和严格试验操作技术对所研究问题进行了科学试验，并对试验数据进行科学处理，得出科学试验结果。
本文经过对HPLC流动相来测定苦苣菜中芦丁含量,该法含有样品处理简单、分析周期短、重现性好等优点。
作品实际应用价值和现实意 义

经过研究苦苣菜中总黄酮最好提取工艺,为开发和利用苦苣菜中有效成份提供理论依据。
经过研究苦苣菜中总黄酮最好提取工艺，而且对黄酮类进行判别，对芦丁提取材料选择含有一定指导意义。

学
术
论
文
文
摘

经过单原因分析及正交试验探讨了提取苦苣菜中总黄酮最好条件，试验结果表明，总黄酮最好提取条件为：乙醇浓度为30%、料液比为1：20、提取温度为60℃、提取时间为1.5h，总黄酮含量可达6.141mg/g，本试验操作简单，重现性好，平均回收率为97.94%，相对标准差为4.87%。经过对苦苣菜粉末中总黄酮判别，得出芦丁含量达成2.528mg/g

作品在何时、何地、何种机构举行会议上或报刊上发表、所获奖励及判定 结 果

无

请提供对于了解、审查、评价所申报作品含有参考价值现有技术及技术文件检索 目 录

1．Jia Z，Zhang PF，Tao BQ, et al. Study on flavones of theflower of Juglans regia [J]. Chin Pharm J, , 44(7):496-497.
2．Nissim Garti, Kiyotaka Ssto1Crystallization and polymorphismof fats and fatty acids [M]1New York:MarcelDekker INC, 1988.
3．周桂芬 ,张　涵 ,吕圭源. 苦苣菜中黄酮类化合物含量测定[J]中华中医药学刊, ，26(1)：218-220.
4．郑和权,周守标．马兰总黄酮提取工艺优化及不一样部位含量测定[J]. 安康学院学报，，34（11）：185-189．
5． 汤波,刘火安,贾云．竹叶总黄酮提取物分离纯化方法研究[J]. 时珍国医国药，，19（10）：2419-2420．
6．苏健,王宝琴.银杏叶及其制剂中黄酮苷及内酯类活性成份 含量测定方法研究进展[J].中国中医药信息杂志，,26（4）：189-202．

申报材料清单（申报论文一篇，相关资料名称及数量）

申报研究论文一篇

科研管理
部门签章

年 月 日

C．目前中国外同类课题研究水平概述
说明：1、申报者可依据作品类别和情况填写；
2、填写此栏有利于评审。
黄酮类化合物是以黄酮（2-苯基色原酮）为母核而衍生一类黄色色素。其中包含黄酮同分异构体及其氢化还原产物。黄酮类化合物在植物界分布很广，在植物体内大部分和糖结合成苷类或碳糖基形式存在，也有以游离形式存在。
黄酮类化合物中有药用价值化合物很多，如槐米中芦丁和陈皮中陈皮苷，能降低血管脆性，及改善血管通透性、降低血脂和胆固醇，用于防治老年高血压和脑溢血。由银杏叶制成舒血宁片含有黄酮和双黄酮类，用于冠心病、心绞痛诊疗。全合成乙氧黄酮又名心脉舒通或立可定，有扩张冠状血管、增加冠脉流量作用。很多黄酮类成份含有止咳、祛痰、平喘、抗菌活性。护肝，解肝毒、抗真菌、诊疗急、慢性肝炎，肝硬化。
Kim等首先报道银杏双黄酮可显著减轻小鼠关节炎症反应。早期研究发觉基质金属蛋白酶9可直接降解骨和软骨,促进血管再生,和RA关节骨和软骨破坏关系亲密在关节软骨破坏中也起关键作用。以后黄酮类化合物开发应用才得到较大发展。
近几年来，中国外学者对其进行了大量研究，刘利和潘一乐在春秋桑“叶总黄酮含量分析及提取工艺优化”一文中采取分光光度法测定了不一样品种春、秋桑叶总黄酮含量，在单原因试验基础上，经过正交试验，优化了桑叶总黄酮提取工艺。康新平在在“新疆锁阳中总黄酮提取工艺优化及含量测定”一文中法以总黄酮含量为指标,以芦丁为对照品, 用分光光度法比较了回流法、超声法、煎煮法从锁阳干燥肉质茎中提取黄酮类化合物提取效率,采取正交表进行试验优化了超声法提取工艺。郑和权和周守标在“马兰总黄酮提取工艺优化及不一样部位含量测定”一文中以马兰全株为材料利用超声波辅助法进行黄酮类化合物提取,采取正交试验法分析比较乙醇体积分数、料液百分比、水浴温度和提取时间对总黄酮提取量影响。
她们全部利用不一样条件优化了总黄酮提取方法，探讨了提取黄酮最好提取条件，使不一样物种中总黄酮得到最大利用，为开发和利用总黄酮提供了很好理论依据。
应用范围：
1在医学上应用：
1）黄酮类化合物能够诊疗心脑血管系统部分疾病，有降血脂、胆固醇作用，还含有抑制血栓和扩张冠状动脉等作用，可用于诊疗高血压、动脉硬化。由银杏叶制成舒血宁片含有黄酮和双黄酮类，用于冠心病、心绞痛诊疗。
2）另外，黄酮类化合物能增强机体非特异免疫功效和体液免疫功效，黄酮类化合物能够经过对巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞（NK）、LAK细胞、细胞因子和影响胸腺来进行免疫调整作用。
3）黄酮类化合物抗菌抗病毒作用已经得到医药界肯定，这方面进行研究较多，如银杏黄酮、槲皮素、桑色素、山奈酚、木樨草素和杨梅黄酮等全部有抗病原微生物和抗病毒作用。
2黄酮类化合物在食品工业中应用
1）天然甜味剂
甜度为蔗糖950倍，而且此两种甜味剂回味无苦味，可直接用于多种食品，并含有保健作用。
2）天然抗氧化剂
研究表明，黄酮类化合物均含有较强抗氧化能力。
3）着色剂
天然色素黄酮多呈黄色，同时又含有很宽溶解性，既含有水溶性黄酮类化合物，又有脂溶性黄酮类化合物，所以完全能够依据食品加工需要来选择适宜黄酮类化合物作为着色剂。萧伟祥等利用低级绿茶或茶末制取了纯天然茶黄色素和茶绿色素，并确定其中关键成份是黄酮类化合物。
4）保健食品
因为黄酮化合物含有多个保健功效，大家开发出多种保健食品。
3在化妆品行业中应用
近几年黄酮类化合物已经得到很大发展，现在中国还没有对苦苣菜中总黄酮提
取工艺研究报道，本文采取单原因和正交试验方法探讨乙醇提取法提取苦苣菜中总黄酮最好提取工艺，为开发和利用苦苣菜中有效成份提供理论依据。

D．推荐者情况及对作品说明
说明：1、由推荐者本人填写；
2、推荐者必需含有中级专业技术职称，其中一名必需含有高级以上专业技术职称，并是和申报作品相同或相关领域教授学者或专业技术人员（教研组集体推荐亦可）；
3、推荐者填写此部分，既视为同意推荐；
4、推荐者所在单位签章仅被视为对推荐者身份确实定。
推荐者情况
姓 名
王廷璞
性别
男
年 龄
44
职称
教授
工作单位
天水师范学院生命科学和化学学院
通讯地址
甘肃省天水市莲亭路60号
邮政编码
741000
单位电话
0938－8367717
移动电话

推荐者所在
单位签章

（签章） 年 月 日
请对申报者申报情况真实性作出阐 述
马静静同学所呈交论文，是经过大量文件积累，在导师指导下，独立进行研究所取得结果。除文中已经注明引用内容外，本论文不包含任何其它个人或集体已经发表或撰写过科研结果。论文数据真实可靠.
请对作品 意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您评价
黄酮类化合物作为天然植物中一个有效成份,起源广泛,药理作用显著，部分已进入临床使用,但提取工艺还需深入研究探讨，本文经过对HPLC流动相来测定苦苣菜中芦丁含量,该法含有样品处理简单、分析周期短、重现性好，内容真实，数据可靠，推荐参与大学生论文挑战杯竞赛。
其它说明

推荐者情况
姓 名
赵菲佚
性别
男
年 龄
38
职称
副教授
工作单位
天水师范学院生命科学和化学学院
通讯地址
甘肃省天水市莲亭路60号
邮政编码
741000
单位电话
0938－8367717
移动电话

推荐者所在
单位签章

（签章） 年 月 日
请对申报者申报情况真实性作出阐 述

本论文全部数据均为申报学生在老师指导下完成，试验方法及过程参考已发表文件及国家相关标准，试验设有对照及反复，数据进行了统计分析,结果真实可靠。

请对作品 意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您评价
本项目在参考已经有对苦苣菜总黄酮提取工艺基础之上，对影响其产率多种原因做了优化探讨，以乙醇浓度、温度、浸泡时间、料液比为考察原因，使用了正交设计方法，取得了对苦苣菜总黄酮提取最优原因组合。在该优化条件下有着样品前处理简单、提取时间短、产物成份稳定特点。本项目标完成对苦苣菜总黄酮工业提取工艺含有一定指导作用，有着较大实际应用价值。

其它说明

学校组织协调机构

确定并盖章

（团委代章）
年 月 日
校主管领导或校

主管部门确定盖章

（盖 章）
年 月 日

E．组织委员会秘书处资格和形式审查意见

组委会秘书处资格审查意见

审查人（署名）
年 月 日

组委会秘书处形式审查意见

审查人（署名）
年 月 日

组委会秘书处审查结果

□合格 □不合格

责任人（署名）
年 月 日

F. 作品打印处
苦苣菜总黄酮提取工艺优化及判别
马静静 高健 齐晓艳
指导老师: 王廷璞 赵菲佚
（天水师范学院生命科学和化学学院，甘肃天水741000）
【摘要】 经过单原因分析及正交试验探讨了提取苦苣菜中总黄酮最好条件，试验结果表明：总黄酮最好提取条件为，乙醇浓度为30%、料液比为1：20、提取温度为60℃、提取时间为1.5h，总黄酮含量可达6.141mg/g，本试验操作简单，重现性好，平均回收率为97.94%，相对标准差为4.87%。经过对苦苣菜粉末中总黄酮判别，得出芦丁含量达成2.528mg/g。
【关键词】： 苦苣菜; 总黄酮 ; 提取工艺; 优化; 判别
The Identitication and optimization of process for extracting total flavonoids in Conches Oleraceus L
Ma JingJing　 Qi XiaoYan 　Gao Jian
Supervisor: Wang Tingpu Zhao Feiyi
(Department of Life Science and chemistry of Tianshui Normal University, Tianshui， Gansu 741000)
Abstrac: In this paper, the optimal parameters for extracting total flavonoids in Conches Oleaeus L were assaied using orthogonal experimental design of signal factor.The results showed that the optimal parametters were combination of 30% ethanol concentration, 1:10 ration of solid to liquid and 60℃ temperature of imerge extract for 1.5h.The yield of total foavonoids were up to 6.141mg/g employed this method.Moreover, the content of Rutin in total extracts were presented at 2.528mg/g.For the quality control of assay, the fidelity factor and RSD were 97.94% and 4.87%, respctively. Together,this novel assay is simple and reproducible and shoewed its potential applications in industry.
key words: Sonchus Oleraceus Total flavonoids Extraction technology Optimization Identification

苦苣菜 (Sonchus oleraceus L1) 系菊科 (Composite) 苦苣属 (Sonchus) 1～2 年生草本植物。味苦, 性寒[1]。含有清热解毒, 凉血止血等作用。主治肠炎、痢疾、黄疸、咽喉肿痛、吐血、尿血等症[2]苦苣菜水提液对动物耐缺氧和急性心肌缺血含有显著保护作用 [3] 。苦苣菜总黄酮对试验性肝损伤含有显著保护作用,苦苣菜酸性提取物含有抗肿瘤作用[4]民间常将其用于诊疗黄疸性肝炎,而且资源丰富,相关键开发利用价值。多年来，苦苣菜这一资源已受到广泛重视,被制成消暑保健食品、罐头等,畅销中国外，并跻身于美国市场上最畅销“十大天然药用植物”之一[5]，含有广泛发展前景。
黄酮类化合物是广泛存在于自然界一大类化合物，含有增强心血管功效、抗肿瘤、增强免疫力、延缓衰老等作用[4，5 ] , 黄酮类化合物还含有降血脂、止血、抑制血小板聚集等多个药理作用。所以广泛用于医药、食品等行业, 含有极广开发应用前景。所以对苦苣菜中总黄酮进行测定、提取有一定意义。
现在中国还没有对苦苣菜中总黄酮提取工艺研究报道，本文采取单原因和正交试验方法探讨乙醇提取法提取苦苣菜中总黄酮最好提取工艺，为开发和利用苦苣菜中有效成份提供理论依据。
以前芦丁测定方法报道中多利用其显色反应用比色法测定[6]，但存在操作繁,易受干扰及显色体系不够稳定缺点。本文经过对HPLC流动相[7]：甲醇：水：乙酸=42:57:1。流速：1ml/min;检测波长：368nm; 样品进样量：20ul。来测定苦苣菜中芦丁含量，该法含有样品处理简单、分析周期短、重现性好等优点,而且苦苣菜中含量达2.528mg/g。
1材料和方法
1．1材料
1.1.1试验材料: 苦苣菜在2月10日采集于甘肃会宁山区，菊科苦苣菜属苦苣菜，洗净，干燥，用粉碎机粉碎，过40目筛，贮藏于广口瓶备用。
1.1.2试剂: 芦丁标准品（南京替斯艾么生化试剂厂出品）；无水乙醇；硝酸亚硝酸盐（AR）；氢氧化钠（AR）；三氧化铝(AR) ；色谱纯甲醇
1.1.3 仪器: 756紫外-可见光分光光度计(上海第三分析仪器厂)； Biofuge 台式高速离心机；电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏试验设备)； 电热恒温水浴锅(北京泰克仪器)；岛津分析天平（岛津制作所）；DS-1高速组织捣碎机（上海精科实业）；Agilent-1100型液相色谱仪（美国安捷伦企业制造）
1.2．方法
1.2.1 标准曲线建立[8]
正确称取芦丁对照品10mg，置于25ml容量瓶中，用30%乙醇在60℃恒温水浴溶解并定容，正确吸收0.0ml ； 0.2ml ；0.4ml ； 0.6ml ；0.8ml ； 1.0ml 置于容量瓶中，加50% NaNO2 溶液 0.3ml，放置50min，再加入10% Al(NO3)3 溶液0.3ml ，放置5min，加4% NAOH 溶液 4.0ml，加水至刻度，摇匀，放置30min，分别再510 nm 处测定不一样浓度下吸收值作标准曲线，得到芦丁浓度和吸光度A关系曲线以下: C=6.430A+0.012 R=0.998 图所表示：( 试验数据见附表 表（1）)

图1直线回归方程曲线图
Fig. 1 The curve of linear regression equation
1 2.2苦苣菜总黄酮制备和含量测定[9]
正确称取1.0g研细苦苣菜末，加30ml 30%乙醇，60℃下浸泡1h，趁热抽滤，滤渣再加入20ml溶剂； 浸泡0.5h，抽滤，合并滤液。3500 r/min 离心20min，然后取滤液用乙醇定容到50 ml备用，测定其含量[10]（方法同标准曲线相同方法测定）,计算提取率e（ 试验数据见附表 表（2））

（Y 黄酮类物质质量浓度 mg/ml ； V 原提取液体积； W 苦苣菜用量a 稀释倍数 ）
依据所测定溶液吸光度，用曲线方程计算出Y。
1.2.3回收试验[11]
取已知含量苦苣菜供试样品溶液6份, 每份分别加入一定量芦丁对照品溶液, 按供试样品溶液制备方法进行含量测定，回收率为97.98%，结果表明该方法加样回收率良好。（试验数据见附表 表3）
*100%
1.2.4重现率试验
取苦苣菜粉末1g。按前述方法提取后加入标准芦丁对照品2ml，同前样品测定方法操作按标准曲线方法测定吸光度，求出总黄酮含量，结果表明本试验结果重现率高，RSD=4.87%,试验方法可靠。（试验数据见附表 表4）
1.2.5 乙醇提取法单原因及正交试验设计
经过对乙醇提取法提取工艺中乙醇浓度、料液比、提取温度，提取时间等影响苦苣菜中总黄酮提取量原因进行单原因及正交试验,确定最好工艺参数。
表 1 正交试验原因及水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

水平
Standard
A 乙醇浓度Ethanol Concentration
B 温度Temperature
C 时间
Time
D 料液比
Solid-liquid ratio
1
15%
60℃
1h
1：10
2
30%
70℃
1.5h
1：20
3
45%
80℃
2h
1：30
1.2.6 定性试验------总黄酮判别
(1)颜色反应
1)浓氨水反应：取样品溶液点在滤纸上，将滤纸在浓氨水上方熏0.5min ，立即在紫外光下观察，呈极显著黄褐色荧光斑点。
2)乙酸镁反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加10%乙酸镁甲醇溶液，吹干，紫外光下呈黄色斑点
3)HCL-Mg反应：取乙醇提取液1ml 于试管中加 Mg ，在加入浓盐酸数滴，1～2min 内微热即可显示紫红色。
(2) 纸层析
取样品溶液10ml 点在滤纸上，用正丁醇：醋酸：水=4：1：5 为展开剂，上行展开5 h ，取出晾干，喷10%氯化铝乙醇，吹干后紫外光下，可见荧光斑点，其中A,B,C为试验组，O为对照组。X为未知斑点，用浓氨水显色处理。
(3) 苦苣菜中黄酮类（芦丁）高效液相色谱测定
1)配制样品溶液：提取苦苣菜总黄酮，加30%乙醇定容到100ml，用孔径为45um微孔滤膜过滤HPLC样品液。
2)配制对照品溶液：称10mg芦丁标准对照品，用30%乙醇定容到50ml对照液。
3)选择色谱条件：色谱柱C18(4.6mm*200mm*5um)；柱温：室温；流动相：甲醇：水：乙酸=42:57：1；流速：1ml/min；检测波长：368nm 样品进样量：20ul。
4)配制线性关系：取标准品5mg溶于12.5ml30%乙醇中，得第一个标准品应用液0.4mg/ml。再依次稀释两倍，依次配制5个对照品应用液。在色谱条件下进样2ul2次，求出平均峰面积。
5)精密度试验
　　以标准曲线中间浓度0.100mg/ml (2.0μg/20μl)为样品,在色谱条件下反复进样6次，分析测定芦丁含量，统计保留时间,进行统计分析,结果表明,保留时间和芦丁含量RSD均在5%以下，表明本试验条件含有良好重现性,色谱条件合理。
6)反复性试验
分别五次吸收苦苣菜总黄酮类样品，每次进样20ul，打印高效液相色谱图谱，统样品峰高，列表计算相对标准方差（RSD）分析试验可反复型，结果如表（5）本试验结果重现性高，RSD=2.286%，试验方法可靠。
2 结果和分析
2.1. 单原因试验
2.1.1 乙醇浓度对提取影响
正确称取6份（1.00g）苦苣菜粉末，分别用15% ，30% ，45%， 60% ，75% ，90%乙醇溶液，以1:50料液比，浸泡相同量样品1.5小时。过滤，定容到50ml，测定其吸光度A值,结果图(1)所表示（试验数据见附表 表（5））

图 2 乙醇浓度对提取影响
Fig. 2 Effect of ethanol concentration on extraction
从图标可得悉：伴随乙醇浓度提升，黄酮类物质提取量增加（15%-30%），当乙醇浓度是30%时，黄酮得率最高。在试验中发觉伴随乙醇浓度增加，黄酮类化合物溶解度减小， 同时部分醇溶性杂质，色素，亲脂性成份溶出量增加，这些化合物竞争同乙醇，水分子结合，从而造成黄酮得率下降，而且不利于黄酮类物质深入提纯[13，14]。所以选30%乙醇浓度浸泡最为适宜。
2 .1.2提取时间对浸泡影响
正确称取6份（0.10g）苦苣菜粉末，用30%乙醇溶液，以1:50料液比，分别浸泡0.5h、1h、 1.5h 、2h 、2.5h 、3h , 过滤，定容到50ml，测定其吸光度A值。结果图（2）所表示（试验数据见附表 表（6））

图 3 提取时间对浸泡影响
Fig. 3 Effect of extraction time on concentration
从图表能够得出伴随浸泡时间延长，黄酮得率增加，当浸泡时间是1.5h时，黄酮得率达最大，延长浸泡时间，黄酮得率下降，但伴随提取时间继续延长,总黄酮含量反而降低,可能是因为提取时间太长,有部分乙醇挥发而造成沸点逐步增大,从而破坏一些黄酮类化合物[15] 。故从提取工艺角度来看，我们选择1.5h左右作为考虑对象。
2.1.3 料液比对提取影响
正确称取6份（1.00g）苦苣菜粉末，分别以料液比（1：10 ，1：20，1：30， 1：40，1：50，1：60）以30%乙醇提取，提取时间1.5h，测定其吸光度A，结果图所表示：（试验数据见附表 表7）

图 4 料液比对提取影响
Fig. 4 Effect of solid-liquid ratio on extraction
从图表能够得出伴随料液比增加，黄酮得率下降，当料液比为1：30以上时，增加料液比，黄酮得率略有下降，考虑到生产成本，料液比以1：10为佳。
2.1.4 浸提温度对提取影响
正确称取6份（0.10g）苦苣菜粉末，回流温度分别为30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃, 以1：10料液比浸泡1.5h, 趁热过滤，滤液稀释5倍，测定其吸光度A值。结果图所表示（试验数据见附表 表8）
图左侧字看不清。要在原图上修改

图 5 浸提温度对提取影响
Fig. 5 Effect of temperature on extraction
从图表能够得出伴随温度升高，黄酮得率也在升高，60℃达成最高可能是过高高温有利于黄酮物质溶出，而且过高温度会造成部分不稳定黄酮类化合物分解，故选择60℃左右为宜。
2.2提取方法正交设计方案，得出结果（生物统计）（四原因水平）
在试验中，因为各原因之间相互交叉影响，所以为全方面考虑乙醇提取法工艺参数,依据单原因试验结果,确定以乙醇浓度、回流时间、回流温度、料液比四种原因进行正交试验设计[17]，以测定苦苣菜样品中总黄酮含量。试验设计及结果见下（试验数据见附表 表9）
表 2 正交试验设计结果
Table 2 Design of orthographic experiment

试验
水平
总黄酮（mg/g）
Test

Levels
Total flavonoids
A
B
C
D

1
15
60
1
1:10
2.569
2
15
70
1.5
1:20
2.21
3
15
80
2
1:30
5.114
4
30
60
1.5
1:30
5.107
5
30
70
2
1:10
1.978
6
30
80
1
1:20
6.141
7
45
60
2
1:20
4.608
8
45
70
1
1:30
2.335
9
45
80
1.5
1:10
1.524
T1
3.298
3.428
3.682
2.024

T2
4.06
2.174
2.947
4.32

T3
2.822
4.26
3.9
4.185

R值
1.238
2.086
0.953
2.296

以上单原因试验基础上，确定提取次数为三次，对影响苦苣菜中总黄酮提取效果原因上进行L9(34)正交试验，并对试验结果进行统计分析，结果如上表，从极差分析结果来看，影响苦苣菜中总黄酮提取效率原因主次次序是：D>B>A>C,最好组合A2B3C1D2,即乙醇浓度为30%，温度为80℃，提取时间为1h,料液比为1：20。因为最好组合不在试验设计中，需做验证试验。
2.3 验证试验
按上面优化工艺A2B3C1D2平行提取三次，平均得率为6.065 mg/g,表明试验所确定最好工艺为较优工艺。
总而言之得出提取苦苣菜总黄酮最好提取工艺，既乙醇浓度为30%，提取温度为80℃，提取时间为1H,料液比为1：20。
2.4定性检测结果 对苦苣菜中提取样品分别进行显色、还原、络合反应
表 3 黄酮类化合物定性判定

项目Item
反应类型
显色反应 还原反应 络合反应
（color reaction） ( reduction reaction) (complex reaction)
试剂 浓氨水 Hcl-Mg Mg(Ac)2
现象 黄褐色 紫红色 黄绿色
由以上特征能够判定样品中可能含有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇类化合物。
Table (3) Qualitative identification of lavonoids compound
2.5纸层析定性分析

图6 纸层析图谱
Fig 6 The fingerprint of filter-paper chromatography
结果分析;
粗黄酮纸层析结果表明，苦苣菜黄酮纸层析展开关键斑点a 和b Rf 值和芦丁标准品相同(Fro= 0. 57) , 说明在该黄酮中, 关键成份是芦丁, 图中另有一微小斑点X和氨水显色呈棕黄色, 属黄酮或酚类物质, 具体成份尚待确定。A、B、C 三种粗黄酮点样并展开,A、B 两样品均无拖尾现象, 而样品C 严重拖尾, 说明其中杂质过多。
2.6 苦苣菜中黄酮类（芦丁）高效液相色谱测定
结果分析：
以芦丁标准品对峰面积作回归曲线，得回归方程y=21264x+81.64，R2=0.993

图7 回归方程曲线图
Fig 7 The curve of linear regression equation
在色谱条件测样品中芦丁含量,含量为苦苣菜中总黄酮55.44%,即2.525mg/g

高效液相色谱芦丁标准品图谱
The HPLC spectrogram of rutin standard

样品高效液相色谱谱图
The HPLC spectrogram of rutin sample
结果分析
测得样品峰面积是1260.58521，代入回归方程得样品中含芦丁为0.055mg/ml，芦丁标准品含量为0.1mg/ml。则苦苣菜中总黄酮含芦丁为55.44%，含量丰富，是提取芦丁优良材料，而且分布广泛，取材方便，廉价实惠。图谱中出现tR，显著性差异不大，色谱分离芦丁标准品峰形对称,并和相邻杂质峰能够达成基线分离，定量值正确，值得探讨及加深研究，并加以应用。
2.7 精密度试验
表 4 精密度试验
Table 4 The assay of precision

试验号(Test No)
标准品峰高(Standard peak heigh