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目 录

综合试验一 土壤中稀有放线菌分离和纯化
及抗生菌体外抗菌判定
综合试验二 玉米淀粉液化、糖化及酒精发酵
综合试验三 甜酒酿造

综合试验一
土壤中稀有放线菌分离和纯化
及抗生菌体外抗菌判定

一 土壤中稀有放线菌分离和纯化
1 试验目标
了解采集土样要求和方法，掌握由土壤中分离稀有放线菌基础原理和操作技术，学习并掌握土壤稀释法和微生物纯培养技术。
2 试验原理
筛选放线菌是新抗研究关键课题之一。迄今为止，已发觉抗生素有80%皆来自于放线菌。放线菌关键存在于土壤中，并在土壤中占有相当大百分比。通常地，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富土壤中数量居多。通常，伴随地理分布、植被及土壤性质不一样，放线菌种类、数量和拮抗性也各不相同。
土壤是微生物大本营，其中放线菌多以链霉菌为主，所以大家通常将除链霉菌以外其它放线菌统称为稀有放线菌。若以常规方法进行分离，得到几乎全部是链霉菌。然而，当采取加热处理土样、选择特殊培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提升稀有放线菌取得率。
由土壤中分离放线菌方法很多，其中包含稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本试验关键采取稀释法，并经过选择特殊培养基方法，来取得少许稀有放线菌。
3 仪器和材料
（1）培养基：葡萄糖天门冬素琼脂，精氨酸琼脂，高氏1号琼脂，以上每种培养基皆用500ml三角瓶分装250ml。
（2）灭菌物品：牛皮纸袋，培养皿，1ml、5ml吸管，250ml三角瓶分装90ml无菌水（含30粒玻璃珠），18×180mm试管分装9ml无菌水，牙签，玻璃刮铲，18×180mm试管中分装10 ml 1‰K2Cr2O7母液。
（3）其它：采土铲，细目筛，药勺，称量纸，试管架，小天平，记号笔。
4 试验步骤
（1）采土：选择适宜采样地点。用采土铲去除表土，取5～10cm深处土壤约150g左右，装入无菌牛皮纸袋中，并注明采样日期、地点、土壤类型、植被和采样人姓名等。
（2）土样预处理：新鲜土样应合适风干，并喷施小剂量杀虫剂以防培养过程中虫卵发育影响。
（3）制备平板：每组取10套无菌培养皿，将冷却至50℃左右各培养基，分别倒入平皿，每皿约15～20ml。每种培养基中需加入20ppmK2Cr2O7溶液。在皿盖上注明培养基种类及组号。
（4）制备土壤稀释液：每组称取10g土样，放入90ml无菌水中，得到土壤原液。手摇15～20min后，静置1min。再用无菌吸管取1ml上清液，置于9ml无菌水中，充足混匀，则得到10－2稀释液。依这类推，制备10－3、10－4稀释液（通常地，较肥土壤使用10－3～10－5稀释液，而瘦土则使用10－2～10－4稀释液）。
（5）铺平板：用1ml无菌吸管分别取0.1ml 10－3～10－5稀释液，置于培养基平板中央。然后，再用无菌玻璃刮铲均匀涂布，静置10min。每1稀释度3个反复，每1种培养基10套平板。并注明各稀释度。
（6）培养及观察：将各平板置于28℃恒温箱中倒置培养14天。要求分别在第2天、7天和14天进行观察，并依据菌落大小、气生菌丝有没有、气生菌丝和基质菌丝颜色及可溶性色素有没有等培养特征，选择单菌落放线菌进行纯培养，同时在平板后面对应位置上作好标识。
（7）纯培养：立即将选定单菌落接入高氏1号琼脂斜面，每个菌株接1支斜面。必需时，中间可加1次划线分离培养，然后再转斜面。
5 结果和讨论
将试验结果填入下表。

思索题
1、在分离土壤放线菌时为何要选择多个培养基？
2、在培养基中添加K2Cr2O7有何作用？
二 抗生菌体外判别
1 试验目标
了解抗生素产生菌体外筛选法原理，学习并掌握抗生菌判别方法。
2 试验原理
由土壤中分出放线菌需深入判别是否为需要抗生菌。首先应依据筛选目标确定试验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。常见方法有琼脂块法和滤纸片法。其关键依据是扩散原理，即观察在抗生菌周围是否会出现显著抑菌圈。抑菌圈大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性强弱。本试验选择了这两种方法。
3 仪器和材料
（1）培养基：500ml三角瓶中分装300ml黄豆饼粉琼脂，18×180mm试管分装4ml黄豆饼粉浸汁，300ml三角瓶分装150ml细菌培养基，150ml三角瓶分装50ml马铃薯培养基。
（2）试验菌：
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
大肠杆菌（Escherichia coli）
金黄色葡萄球菌（Staphlococcus aureus）
深红酵母（Ruodotorula rubra）
（3）待测菌株：
琼脂培养物：将融化黄豆饼粉琼脂倒入无菌培养皿，制成平板。用记号笔在平皿后面画一直线，将平皿一分为二，分别注明待测菌株编号。并根据编号将待测菌株密集划线接入平板。同法接入华美链霉菌（Streptomyces splendens）和金霉素链霉菌（Streptomyces aureofaciens）作为对照菌，28℃下培养7天
发酵液：将待测菌株和对照菌分别接入黄豆饼粉培养液，作好标识，28℃下振荡培养7天。
（4）灭菌物品：培养皿，打孔器，镊子，圆滤纸片，15×150mm试管分装5ml无菌水，1ml吸管，无菌漏斗。
（5）其它：接种用具，游标卡尺，记号笔，摇床。
4 试验方法
4.1 琼脂块法
（1）分别取枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各1支，加入5ml无菌水
制成菌悬液，备用。
（2）取9套无菌培养皿，向每套培养皿中分别加入1ml试验菌悬液，然后加入约12ml冷却至45℃左右细菌培养基，快速在试验台上摇匀，制成指示菌平板。每1种指示菌3个反复，并注明指示菌及测定菌株位置。
（3）用无菌打孔器将待测菌株和对照菌黄豆饼粉琼脂培养物切块，每种培养物9块。
（4）用无菌接种针，将待测菌株和对照菌琼脂块分别移入各指示菌平板对应位置上，菌面朝上，间隔均匀摆放。
（5）静置20min后，放入恒温箱，37℃下培养18～24h。
（6）用游标卡尺测量抑菌圈直径，并观察抑菌圈透明程度和边缘整齐程度。
4.2 滤纸片法
(1) 向深红酵母菌斜面中加入5ml无菌水，制成菌悬液。
(2) 向已冷却至45℃左右马铃薯培养基中加入0.5ml深红酵母菌悬液，摇匀后，倒3个指示菌平板，并在平皿后面标明测定菌株位置，备用。
(3)过滤各测定菌株发酵液。
(4) 用无菌镊子取无菌圆滤纸片，蘸取各测定菌株发酵滤液，放入指示菌平
板对应位置上，每1测定菌株3个反复。
(5) 静置20min后，28℃下培养2天。
(6) 用游标卡尺测量抑菌圈直径，并观察抑菌圈透明程度和边缘整齐程度。
5 结果
将试验所得结果填入下表，抑菌圈直径以mm来表示。

思索题
1、为何在移入琼脂块和滤纸片后不立即保温培养？
2、抑菌圈小是否就意味着菌株抑菌活性差？为何？
试验进度安排
第一天：设备准备，土壤采样，培养基准备
第二天：培养基准备，分离稀有放线菌体
第三天：土壤稀释法和微生物纯培养
第四天：琼脂块法筛选，滤纸片法筛选培养
第五天：试验结果观察 总结 汇报撰写

综合试验二
玉米淀粉液化、糖化及酒精发酵

1 试验目标及要求
要求学生掌握用酶法从淀粉原料到水解糖制备原理及方法，淀粉水解糖酒精发酵方法。掌握粗淀粉含量和还原糖、酒精含量化学测定方法。
2 试验原理
发酵过程中，有些微生物不能直接利用淀粉，所以，当以淀粉为原料时，必需先将淀粉水解成葡萄糖，才能供发酵使用。通常将淀粉水解为葡萄糖过程称为淀粉糖化，所制得糖液称为淀粉水解糖。发酵生产中，淀粉水解糖液质量，和生产菌生长速度及产物积累直接相关。
能够用来制备淀粉水解糖原料关键有薯类(木薯、甘薯)淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉等，依据原料淀粉性质及采取水解催化剂不一样，水解淀粉为葡萄糖方法可分为酸解法、酸酶结正当和酶解法。试验室中常采取酶解法制备淀粉水解糖。
酶解法是指利用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖过程。酶解法制葡萄糖可分为两步：第l步是利用α-淀粉酶将淀粉液化为糊精及低聚糖，使淀粉可溶性增加，这个过程称为液化；第2步是利用糖化酶将糊精或低聚糖深入水解，转变为葡萄糖过程，在生产上称为糖化。淀粉液化和糖化全部是在酶作用下进行，故也称为双酶水解法。利用酒精酵母将可酵糖转化为酒精过程称为发酵。
2.1 酶法液化原理
淀粉酶法液化是以α-淀粉酶为催化剂，该酶作用于淀粉α-1,4糖苷键，从内部随机地水解淀粉，从而快速将淀粉水解为糊精及少许麦芽糖，所以也称内切淀粉酶。淀粉受到α-淀粉酶作用后，其碘色反应发生以下改变：蓝→紫→红→浅红→不显色(即碘原色)。
酶法液化以生产工艺不一样分为间歇法，半连续和连续式；液化设备有：管式、罐式、喷射式。加酶方法有：一次加酶、二次加酶、三次加酶。依据酶制剂耐温性分为中温酶法、高温酶法、或中温酶和高温酶混正当。本试验采取：中温酶法，间歇式，罐式，二次加酶法。
2.2 酶法糖化原理
淀粉糖化是以糖化酶为催化剂，该酶从非还原末端以葡萄糖为单位顺次分解淀粉α-1，4糖苷键或α-1，6糖苷键。因为是从链一端逐步地一个个地切断为葡萄糖，所以称为外切淀粉酶。
淀粉糖化理论收率：因为在糖化过程中，水参与反应，故糖化理论收率为111.1％。
（C6H10O5)n+H2O nC6H12O6

162 18 180

淀粉糖化实际收率计算：
淀粉转化率：淀粉-葡萄糖转化率是指100份淀粉中有多少份淀粉被转化为葡萄糖。
淀粉转化率计算：
DE值：用DE值表示淀粉水解程度或糖化程度。糖化液中还原性糖以葡萄糖计，占干物质百分比称为DE值。
DE值计算：
还原糖用裴林氏法或碘量法测定，浓度表示：葡萄糖g/100ml糖液；
干物质用阿贝折光仪测定，浓度表示：干物质g/100g糖液。
影响DE值原因：
糖化时间：最初糖化时，糖化速度快，DE值显著上升；但24h后，当DE值达成90％以上时，糖化速度显著放慢。
液化DE值和糖化DE值关系：
液化程度应控制合适，太低或太高均不利。原因是液化程度低，则粘度大，难操作；同时，因为液化程度低，底物分子少，水解机会少，影响糖化速度；液化程度低，易发生老化；但液化超出一定程度，则不利于糖化酶和糊精生成络合结构，影响催化效率，造成糖化液最终DE值低。故应在碘试本色前提下，液化DE值越低，则糖化液最高DE值越高。通常液化DE值应控制在12-18％。
酶制剂用量和糖液DE值关系：
糖化时间和糖化酶用量关系表
糖化时间（h）
6
8
10
16
24
32
48
72
糖化酶用量（U/g淀粉）
480
400
320
240
180
150
120
100
为加紧糖化速度，能够提升酶用量，缩短糖化时间。但酶用量太高，反而使复合反应严重，最终造成葡萄糖值降低。在实际生产中，应充足利用糖化罐容量，尽可能延长糖化时间，降低糖化酶用量。
2.3 酒精发酵原理
以淀粉为原料，采取酸水解、酸酶结合水解或酶水解方法，能够将淀粉转化为葡萄糖等可酵糖。利用酒精酵母胞内酒化酶系，葡萄糖被转化为酒精即酒精发酵。以生产工艺不一样，酒精发酵可分为间歇式、半连续式、连续式过程，多种过程又能够细分为多个形式。本试验采取酶法糖化、一次添加间歇式方法进行酒精发酵。
3 试验仪器、设备和材料
（1）1000ml烧杯
（2）真空过滤装置
（3）烘箱
（4）量杯
（5）量筒
（6）分光光度计
（7）水浴锅
（8）滴定管
（9）电炉
（10）白瓷板
（11）三角瓶
（12）阿贝折光仪
（13）玉米粉
（14）α-淀粉酶
（15）糖化酶
（16）pH试纸
（17）酒精活性干酵母
（18）酒精蒸馏装置及酒精计
4 试验步骤
4.1 淀粉水解糖制备
4.1.1 淀粉液化
配制30％淀粉乳，调整pH值至6.5，加入氯化钙(对固形物0.2％)，在3个1000ml烧杯中分别加入淀粉乳700ml并分别加入液化酶12U/g淀粉、16U/g淀粉、20U/g淀粉，在猛烈搅拌下，先加热至72℃，保温15min，再加热至80℃~90℃（视酶特征而定），并维持30min，以达成所需液化程度(DE值：15-18％)，碘反应呈棕红色。液化结束后，观察液位，再升温至100℃，保持10-15min，以凝聚蛋白质，改善过滤。统计液化时间。
4.1.2 淀粉糖化（糖化酶用量对糖化影响）
液化结束后，快速将料液用盐酸将pH调至4.2-4.5，同时快速降温至60℃。将液化醪混匀后均分为3份，分别加入糖化酶320U/g淀粉、400U /g淀粉、480U/ g淀粉，60℃保温，每隔2小时，取样做酒精试验。当用无水酒精检验无糊精存在时，即为糖化终点，统计糖化时间，同时将料液pH调至4.8-5.0，并将料液加热至80℃，保温20min．然后将料液温度降至60-70℃，开始过滤。
4.1.3 过滤
将烧杯内料液冷却至60-70℃；趁热采取真空过滤（也可用滤布压滤），热水洗涤(60-70℃)滤饼；过滤结束后，洗净过滤相关设备。量取糖液体积；取样分析还原糖浓度。
4.2 酒精发酵
4.2.1 酒精酵母活化：称取2g蔗糖，溶于100ml经煮沸并冷却水中，加入1g活性干酵母于培养箱中30℃活化2hr，备用。
4.2.2 清糖液发酵：将4.1方法制备淀粉水解糖调整浓度为15%左右，于500ml三角瓶中加入该糖液200ml，用无菌吸管取5ml活化酵母，摇匀，密封三角瓶，置入培养箱中于32℃发酵24hr后得到发酵成熟醪，蒸馏，测定酒精含量。
4.2.3 混合醪发酵：
（1）液化：称取2份各50g玉米粉，置于500ml三角瓶中，混匀，记下液面刻度，加入α-淀粉酶（酶用量为4U/g淀粉原料）进行液化，得到糊化醪。液化温度为85℃，液化时间为30min，然后冷却至58~60℃，保温。
（2）糖化：在糊化醪中分别加入糖化酶200U/g淀粉原料和400U/g淀粉原料，在58~60℃保温糖化30min得到糖化醪。
（3）发酵：将糖化醪冷却至30℃，用无菌吸管接入活化酵母液5ml，摇匀，密封容器，置入培养箱中于32℃发酵50hr左右后得到发酵成熟醪，蒸馏，测定酒精含量。
5 试验分析项目和方法
5.1 淀粉原料含水量测定
5.1.1 原理
样品中水分受热后产生蒸汽压，高于空气在电热干燥箱中分压，水分便从样品中挥发出来。样品干燥速度取决于这个压差大小，在此条件下失去关键是试样中游离水。试样水分通常是指在100℃左右直接干燥情况下，所失去总量。在此条件下失去重量不仅是水分，还有微量挥发性物质。
5.1.2 仪器和设备
（1）分析天平
（2）称量瓶
（3）干燥器
（4）电热恒温干燥箱

5.1.3 测定步骤
正确称取约2克试样，置入经100-l05℃干燥恒重后称量瓶中，在100-105℃烘箱中干燥3-4小时，取出，置入干燥器中冷却至室温，称重。再于相同温度下干燥1小时左右，同上操作，直至恒重。
计算

式中 W0：称量瓶重（g）
W1：干燥前试样和称量瓶重（g）
W2：干燥后试样和称量瓶重（g）
5.1.4 说明
（1）原料水分测定通常需采取100-105℃烘箱中直接干燥，其结果较为正确。对生产过程中水分快速测定，可采取更高温度下干燥(如120-140℃)或红外灯下干燥，以缩短分析时间。
（2）测定水分时，称量恒重指试样连续两次干燥后，称量之差不超出2mg。
5.2 淀粉原料中粗淀粉含量测定
5.2.1 原理
淀粉经酸或水解生成葡萄糖：

所生成葡萄糖用斐林试剂测定。
斐林试剂由甲、乙液组成。甲液为硫酸铜溶液，乙液为氢氧化钠和酒石酸钾钠溶液。平时甲、乙液分别贮存，测定时甲、乙液等体积混合。混合时，硫酸铜和氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀：
2NaOH+CuSO4=Cu(OH)2↓+Na2SO4
所生成氢氧化铜沉淀和酒石酸钾钠反应，生成酒石酸钾钠铜络合物，使氢氧化铜溶解：

酒石酸钾纳铜络合物中二价铜是一个氧化剂，能使还原糖中羰基氧化，而二价铜被还原生成一价氧化亚铜沉淀：

反应终点用次甲基蓝指示剂显示。因次甲基蓝氧化能力较二价铜弱，故待二价铜全部被还原后，过量一滴还原糖立即使次甲基蓝还原，溶液蓝色消失以示终点：

5.2.2 试剂
5.2.2.1 斐林试剂
甲液：称取69.3克硫酸铜(CuSO4·15H2O)，用水溶解并稀释至1000毫升，如有不溶物可用滤纸过滤。
乙液：称取346克酒石酸钾钠，100克氢氧化钠，用水溶解并稀释至1000毫升。
5.2.2.2 2％盐酸溶液
量取4.5毫升浓盐酸，用95.5毫升水稀释。
5.2.2.3 20％盐酸溶液
量取20毫升浓盐酸，缓慢倒入80毫开水中。
5.2.2.4 20％氢氧化钠溶液
称取200克氢氧化钠，用水溶解并稀释至1000毫升。
5.2.2.5 1％次甲基蓝溶液
称取1克次甲基蓝，加100毫升水，加热溶解，贮存于棕色瓶中。
5.2.2.6 0.2％标准葡萄糖溶液
正确称取2克无水葡萄糖(预先于100~l05℃烘干)，用水溶解，加5毫升浓盐酸，用水定容至1000毫升。
5.2.3 仪器和设备
（1）三角瓶
（2）长玻璃管(约1米)
（3）容量瓶
（4）分析天平
（5）干燥器
（6）电热恒温干燥箱
（7）滴定管
（8）称量瓶
（9）移液管
（10）pH试纸
（11）电炉
（12）水浴锅
5.2.4 测定步骤
5.2.4.1 试样水解
粗淀粉测定中试样水解：正确称取试样1.5~2克，置入250毫升三角瓶中。加l00毫升2%盐酸溶液，轻轻摇动三角瓶，使试样充足湿润。瓶口按上回流冷凝器或长玻璃管(约1米)，于沸水浴中回流水解3小时(图2-1)。取出，快速冷却，用20％氢氧化钠溶液中和至中性或微酸性(用pH试纸试验)。滤纸过滤滤液用500毫升容量瓶接收，用水充足洗搽残渣，然后用水定容至刻度，摇匀，为供试糖液。
5.2.4.2 斐林试剂校正
吸收斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加20毫升水，并从滴定管中加入约24毫升0.2％标准葡萄糖溶液(其量应控制在后滴定时消耗0.2％标准葡萄糖溶液在1毫升以内)，摇匀，于电炉上加热至沸，并保持微沸2分钟。加2滴1％次甲基蓝溶液继续用0.2％标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1分钟内完成。总耗糖量为v毫升。

图2-1 水解装置
校正值计算：
先求得10毫升斐林试剂相当葡萄糖克数(F)，
F=CV
式中 C：标准葡萄糖溶液浓度(g/ml)
再从斐林试剂糖量表(见附表2-1)查得V毫升时相当葡萄糖克数(F0)，斐林试剂校正值f为：

5.2.4.3 定糖
吸收斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加20毫升水，并从滴定管中预先加入适量水解糖液(其量应控制在后滴定时消耗水解糖液在1毫升以内)，摇匀，于电炉上加热至沸，并保持微沸2分钟。加2滴1％次甲基蓝溶液，继续用水解糖液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1分钟内完成。

5.2.5 计算
从附表2-1查得10毫升斐林试剂消耗水解糖液体积相当于100毫升水解糖液中所含葡萄糖量（G），则1毫升水解糖液中含葡萄糖量为G/100，再乘以斐林试剂校正值，即为1毫升水解糖液中实际含葡萄糖量：

式中 500：试样稀释体积（ml）
W：试样重量（g）
0.9：葡萄糖和淀粉换算系数

附表2-1 斐林试剂糖量表

消耗糖液
体 积
(毫升)
相当葡萄
糖 量
(毫克)
100毫升糖液中所含葡萄糖量
(毫克)
消耗糖液
体 积
(毫升)
相当葡萄
糖 量
(毫克)
100毫升糖液中所含葡萄糖量
(毫克)
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
49.1
49.2
49.3
49.3
49.4
49.5
49.5
49.6
49.7
49.8
49.8
49.9
49.9
50.0
50.0
50.1
50.2
50.2
327
307
289
274
260
247.4
235.8
225.5
216.1
207.4
199.3
191.8
184.9
178.5
172.5
167.0
161.8
156.9
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
50.3
50.3
50.4
50.4
50.5
50.5
50.6
50.6
50.7
50.7
50.7
50.8
50.9
50.9
51.0
51.0
51.0
51.1
152.4
148.0
143.9
140.0
136.4
132.9
129.6
126.5
123.6
120.8
118.1
115.5
113.0
110.6
108.4
106.2
104.1
102.2

5.3 测定液化反应终点(碘反应)；
5.4 糖化终点测定(无水乙醇检验)；
5.5 还原糖测定
5.5.1 原理
原糖测定采取快速法。其反应和粗淀粉测定相同，不一样点为斐林试剂甲液中硫酸铜量较小，适适用于含糖量较少试样。另外，斐林试剂中加入亚铁氰化钾(黄血盐)，使红色氧化亚铜沉淀生成可溶性复盐，反应终点更为显著。
Cu2O+K4Fe(CN)6+H2O=K2Cu2Fe(CN)6+2KOH
(淡黄色)
5.5.2 试剂
5.5.2.1 斐林试剂
甲液：称取35g硫酸铜，0.05g次甲基蓝，用水溶解并定容至1000ml。
乙液：称取117g酒石酸钾钠，126.4g氢氧化钠，9.4g亚铁氰化钾，用水溶解并定容至1000ml。
5.5.2.2 0.1%标准葡萄糖溶液
精密称取1.0000g经95~105℃烘干无水葡萄糖，用少许水溶解，加入5ml盐酸，用蒸馏水定容至1000ml，摇匀。
5.5.3 仪器和设备
（1）三角瓶
（2）容量瓶
（3）分析天平
（4）干燥器
（5）电热恒温干燥箱
（6）滴定管
（7）称量瓶
（8）移液管
（9）电炉
5.5.4 测定步骤
5.5.4.1 斐林试剂标定
吸收斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加10毫升水，并从滴定管中预先加入约20毫升0.1%标准葡萄糖溶液(其量控制在后滴定时消耗0.1%标准葡萄搪溶液1毫升以内)，摇匀，于电炉上加热至沸，立即以4~5秒钟1滴速度继续用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1分钟内完成，总耗糖量为V0毫升。
5.5.4.2 定糖
预备试验：吸收斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加入V1毫升试样稀释液(含葡萄糖量约为5~15毫克)及适量0.1%标准葡萄糖溶液，摇匀，以下同标定时操作，总耗糖量为V2毫升。
正式试验：吸收斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加V1毫升试样稀释液和(V2-1)毫升0.1%标准葡萄糖溶液，补加[(V0+10)-(V1+V2)]毫升水，摇匀，以下同标定时操作，总耗糖量为V毫升。
反复测定两次，取总消耗标准葡萄糖液体积平均值V ml。
5.5.5 计算

式中 V0：斐林试剂标定值(毫升)
V：斐林试剂测定值(毫升)
C：标准葡萄糖溶液浓度(克/毫升)
n：试样稀释倍数
v1：所取试样稀释液体积(毫升)
5.5.6 说明
(1) 滴定速度、三角瓶壁厚度和热源稳定程度等，对测定精密度影响很大。平行测定滴定毫升数相差不应超出0.1ml，故在标定、预备、正式测定过程中，试验条件应努力争取一致。
(2) 滴定过程应该一直保持在微沸状态下进行。沸腾后继续滴定至终点毫升数应控制在0.5~lml内，不然应重新测定。
(3) 样品液中还原糖浓度不宜过高或过低，依据预备试验结果，应将样品液稀释至还原糖含量在1%左右为宜。
(4) 滴定至终点蓝色褪去以后，就不应再滴定，因四甲基蓝指示剂被还原褪色后，当接触空气时，又会被氧化重现篮色。
(5) 斐林溶液和还原糖之间反应因受溶液碱性、加热湿度和时间和副反应等影响，而没有严格定量关系，不能由当量定律来求出试样中还原糖含量，只熊依据在相同试验条件下消耗对应标准还原糖量或由严格相同试验条件下得出还原糖检索表上查得对应还原糖量来进行计算。所以用廉-爱农法定糖时，必需先用对应标准还原糖标定斐林溶液。
5.6 酒精含量测定
采取国家标准方法——蒸馏法。
用量筒量取成熟发酵醪100ml置于500ml蒸馏烧瓶中，加入蒸馏水100ml，装好蒸馏装置，加热，保持发酵成熟醪一直处于微沸状态，用100ml量筒搜集馏出液100ml，停止蒸馏。用酒精计测定馏出液酒度，同时测定馏出液温度，方便对酒精度进行温度校正。
5.7 α-淀粉酶活力测定
5.7.1 原理
液化型淀粉酶(即α-1，4-糊精酶，俗称α-淀粉酶)能将淀粉分子键α-1，4-葡萄糖苷键任意切断成长短不一短链糊精，和少许麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色特异反应逐步消失，以该颜色消失速度计算酶活力。
5.7.2 试剂
5.7.2.1 原碘液
称取碘(I2)11g，碘化钾(KI)22g，先用少许蒸馏水使碘完全溶解后定容至500m1，贮于棕色瓶内。
5.7.2.2 稀碘液
取原碘液2m1，加入KI 20g，用蒸馏水溶解定容至500ml，贮于棕色瓶内。
5.7.2.3 2%可溶性淀粉
正确称取2.000g可溶性淀粉(以绝干计)，然后用少许蒸馏水调匀，渐渐倾于煮沸蒸馏水中，加热煮沸至透明为止，冷却定容至100ml。此溶液需当日配制。
5.7.2.4 0.02mol/L pH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液
称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·H2O) 45.2g和柠檬酸(C6H8O7·H2O)8.07g，用蒸馏水溶解定容至1000ml，配好后应以酸度计或精密试纸校正pH。
5.7.2.5 标准终点色溶液
A液 正确称取氯化钴(CoCl·6H2O)40.2439g和重铬酸钾(K2Cr2O7) 0.4878g，以蒸馏水溶解定容至500ml。
B液 正确称取铬黑T(C20H 12N2NaO7S)10mg，以蒸馏水溶解定容至100mI。
使用时取A液40m1和B液50ml混合。此混合液宜冰箱保留，使用15天后需要重新配制。
5.7.3 操作步骤
5.7.3.1 待测酶液制备
取发酵液滤液用pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液合适稀释，供测定用。
5.7.3.2 测定
取2ml标准终点色溶液滴于白磁板空穴内，作为比较颜色标准。
取20ml 2%可溶性淀粉和5m1pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，放于20×200mm大试管中，在60℃恒温水浴中预热4-5min．然后加入预先稀释好酶液0.5m1，立即统计时间，充足摇匀。定时用滴管取出反应液约0.5m1，滴于预先充满比色稀碘液(约1.5ml)磁扳空穴内，当穴内颜色反应由紫色逐步变为红棕色，和标准终点色相同时，即为反应终点，并统计时间t(min)。
5.7.4 计算
1m1酶液于60℃，pH6.0条件下，用1 h液化可溶性淀粉克数来表示（g可溶性淀粉/m1·h）。

式中 60：60min
20：可溶性淀粉毫升数
n：稀释倍数
t：测定统计时间(min)
2%：淀粉浓度
0.5：测定时用酶量
5.7.5 注意事项
（1）酶反应全部时间控制在2~2.5min之间（酶活力10~15单位）。
（2）为统一起见，可溶性淀粉使用同一厂家生产化学纯试剂。
（3）测定时照明采取40W日光灯，灯和白磁板间距以60 cm为宜。
5.8 糖化酶活力测定
5.8.1 原理
糖化型淀粉酶（即淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶）有催化淀粉水解作用，从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1，4-糖苷键生成葡萄糖，反应生成葡萄糖用次碘酸钾法定量测定，以表示糖化性淀粉酶活力。
5.8.2 试剂
5.8.2.1 0.1mol/L pH4.6醋酸钠缓冲液
称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)6.7g和冰醋酸(CH3COOH)2.6m1，用蒸馏水溶解，定容至1000m1。上述缓冲液应以酸度计或精密试纸校正pH。
5.8.2.2 0.1mol/L硫代硫酸钠溶液
(1)配制：称取硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)24.82g和硫酸钠0.2g溶于煮沸后冷却蒸馏水中，定容至1000ml，即得0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶中密封保留，配制后应放置一星期标定使用。0.05mol/L溶液则用蒸馏水稀释制得。
(2)标定：取在120℃下干燥至恒重标准重铬酸钾0.25g．精密称量。置碘量瓶中，加水50m1使溶解，加碘化钾2g。轻轻振摇使溶解，加1mol/L硫酸溶液40m1摇匀，密塞。在暗处放置10min后用蒸馏水250ml稀释，用此液滴定至近终点时，加淀粉指示液3ml，继续滴定至蓝色消失而显亮绿色。并将滴定结果用空白试验校正。每1ml0.1mol/L硫代硫酸钠液相当于4.903mg重铬酸钾。依据本液消耗量和重铬酸钾用量，计算硫代硫酸钠当量浓度。本溶液需每个月标定一次。
5.8.2.3 0.1mol/L碘液
称取碘化钾(K1)36g，溶解在100m1蒸馏水中，再加入碘(I2)12.98g溶解，定容至1000ml贮存于棕色瓶中。
用标准0.05mol/L硫代硫酸钠溶液标定碘液。
吸收10ml待标定碘液放入250m1碘量瓶中，以0.05m/L硫代硫酸钠滴定至淡黄色时，加入1%淀粉指示剂l-2滴，继续滴定至无色为终点。

式中 N1：硫代硫酸钠浓度(mol/L)
V1：消耗硫代硫酸钠毫升数
V：碘液毫升数
5.8.2.4 0.1mo1/L氢氧化钠溶液
称取4g氢氧化钠(NaOH)加蒸馏水溶解，定容至1000ml。
5.8.2.5 1mol/L硫酸溶液
量取浓硫酸5.6ml，慢慢加入于80 m1蒸馏水中，冷却后定容至l00ml，摇匀。
5.8.2.6 20%氢氧化钠溶液
称取20g氢氧化钠，溶解定容至100ml。
5.8.2.7 2%可溶性淀粉
称取可溶性淀粉2g，然后用少许蒸馏水调匀，渐渐倾入巳沸蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至l00ml，此溶液需当日配制。
5.8.3 操作方法
5.8.3.1 待测酶液制备
取发酵液滤液用pH4.6醋酸钠缓冲液合适稀释，供测定用。
5.8.3.2 测定
于甲、乙两支比色管中(50ml)，分别加入20%可溶性淀粉溶液25m1及0.1mol/L pH4.6醋酸-醋酸钠缓冲液5ml，摇匀，40℃恒温水浴中预热(5-10min)。在甲管中加入酶液2ml(酶活总量约100-170单位)，立即记时间，摇匀。在此温度下正确反应1h后，立即各加20%NaOH溶液0.2m1，摇匀，将两管取出快速用水冷却，并于乙管中补加酶液2m1。
取上述反应液5m1放入碘量瓶中，正确加入0.1mol/L碘液10ml，再加入0.1mol/L氢氧化钠15ml(边摇摆)。暗处放置15min，加入1mol/L硫酸2m1，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至无色为终点。
5.8.4 计算
糖化酶活力单位定义：在40℃、pH4.6条件下，1小时水解可溶性淀粉产生1毫克葡萄糖所需酶量为一个糖化酶活力单位。

式中 A：空白所消耗硫代硫酸钠毫升数
5：样品所消耗硫代硫酸钠毫外数
N：硫代硫酸钠摩尔浓度
90.05：1ml l mol/L硫代硫酸钠所相当葡萄糖毫克数
1/2：折算成1m1酶液量
32.2：反应液总体积毫升数
5：吸收反向液毫升数
n：稀释倍数
5.8.5 注意事项
（1）酶液制备时，酶液浓度最好控制在消耗0.05mol/L硫代硫酸钠（空白和样品）差数为3~6ml左右(以每毫升约50~90单位为宜)。
（2）为统—起见可溶性淀粉使用浙江菱湖淀粉厂生产化学纯试剂配制，如暂不能购制，而需使用其它厂生产可溶性淀粉时，必需做对照试验。
6 数据处理
在具体统计试验数据基础上完成试验汇报。计算淀粉转化率和淀粉出酒率。
7 试验结果和讨论
糖化酶用量及糖化时间对糖化效果影响；
液化和糖化时温度及pH对试验效果影响。
糖化酶用量对出酒率影响？

试验进度安排
第一天：试验准备：仪器、药品、玻璃器皿，试验原料。
第二天：淀粉液化，糖化，过滤
第三天：酒精发酵操作
第四天：测定用试剂配置，多种指标测定
第五天：多种指标测定，试验总结，汇报撰写

综合试验三
甜酒酿造
1 试验目标及要求
要求学生掌握甜酒酿造原理及工艺步骤；掌握甜酒酿造过程中酒曲中糖化酶活力测定方法；成品总糖、还原糖含量、酒精度及总酸度测定原理及方法。
2 甜酒概述
甜酒酿造，关键采取甜酒曲。甜酒曲是糖化菌及酵母制剂，其所含微生物关键有根霉、毛霉及少许酵母。在发酵过程中根霉产生糖化酶，首先将糯米中淀粉分解成葡萄糖，蛋白质分解成氨基酸，接着少许酵母又将葡糖糖经糖酵解路径转化成酒精。这么就制成了香甜可口、营养丰富甜酒酿。
甜酒酿是米酒曲最初产品，它是各类酒类制作雏形，除了食用外，还有两种用途，一是作为料酒使用，如川式火锅，豆瓣酱中添加；二是制作馒头，如河南周口米酒馒头、浙江金华米酒馒头。另外，甜酒曲还能够在调料发酵中使用，所以，甜酒曲用户有甜酒酿工厂、家庭、餐饮单位、调料生产单位。
甜酒酿作为料酒使用，关键是利用其良好口感独特风味，在调味过程中，它既含有一定酒香，又有酸、甜口味，能起四处腥膻异味、提鲜增香等作用，使菜肴风味独特，口味柔和，已经成为烹饪菜肴时不可缺乏调味品。
甜酒酿在制作馒头中使用，最关键代表在河南周口和浙江金华，含有很强地方传统色彩，通常全部称之为米酒馒头。米酒馒头制作方法有很多个，有是直接利用甜酒曲长时间发酵面团，制作馒头；有是利用甜酒酿中酒水作为面团用水，在添加合适酵母，制作馒头，这种发方法在金华最经典；还有是将甜酒酿和面粉共同长时间发酵，制作馒头。即使方法不尽相同，但这些馒头全部含有甜酒酿特有醇香风味，而且口感细腻，是很含有民族传统特色食品。
甜酒曲用于调料发酵，关键是利用甜酒曲中根霉极强糖化性能。比如酱品制作，它是以淀粉质和蛋白质材料作为关键原料，在制作过程中起关键作用是根霉菌株产生糖化霉系和蛋白酶系，经过糖化作用，将淀粉质分解成糖；经过蛋白酶系对蛋白质水解发酵作用，产生多种氨基酸，这么就形成了酱类甜味和鲜味。然后再经过酵母酒精发酵作用和细菌乳酸发酵作用，就得到了风味各异酱品。