草地早熟禾PpSWEET1b基因克隆及功能研究.pdf

第 46 卷 第 1 期Vol.46 No.1 2024 年 1 月Jan.2024中 国 草 地 学 报Chinese Journal of Grassland草地早熟禾 PpSWEET1b基因克隆及功能研究张然1，2，李根1，牛奎举1，钱永强2，马晖玲1，*（1.甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070；2.中国林业科学研究院生态保护与修复研究所/国家林业和草原局草原研究中心，北京 100091）摘要：SWEETs糖转运蛋白是一类在真核生物和原核生物中均存在的促进糖通过细胞膜流动的转运蛋白之一，参与调控植物的生长发育和胁迫响应过程。以草地早熟禾品种蓝月为材料，以叶片 cDNA 为模板克隆 PpSWEET1b基因，采用花序侵染法转化拟南芥，获得了 PpSWEET1b拟南芥过表达株系，并研究干旱和低温胁迫对转基因和野生型拟南芥生长、生理及基因表达的影响。结果表明：干旱和低温胁迫下，PpSWEET1b过表达植株生长状态均优于野生型，叶片 MDA含量显著低于野生型，但葡萄糖含量较野生型显著增加，抗旱性和抗寒性明显增强；PpSWEET1b过表达植株可能协同 SWEET2和 SWEET3共同参与了对低温的响应。此外，以叶片 DNA为模板克隆了 PpSWEET1b基因的启动子序列，顺式作用元件预测发现，其含有多个与胁迫和激素响应、光响应相关的元件。综合以上结果表明，草地早熟禾 PpSWEET1b基因在耐旱和耐寒方面发挥着重要作用，可为草坪草抵抗非生物胁迫生物育种提供新的优异基因资源。关键词：草地早熟禾；基因克隆；遗传转化；功能验证；非生物胁迫中图分类号：S688.4 文献标志码：A 文章编号：1673-5021（2024）01-0011-14糖代谢是连接蛋白质、脂类、核酸和次生物质代谢的整个生物代谢的中心。其不仅在植物的“源-库”关系及养分的储存和运输中担当重要职责，同时也在信号转导和抗逆性中起着至关重要的作用1。糖不能通过植物生物膜系统独立运输，需要相应糖转运蛋白的协助2。糖 外 排 转 运 蛋 白（Sugars will eventually be exported transporters，SWEETs）是一类不依赖于环境pH 值，仅利用细胞内外的浓度差来促进糖在细胞膜上的浓度梯度扩散，从而参与植物光合产物运输和分配的转运蛋白3。研究发现，寒冷、干旱等环境因子可诱导植物SWEET糖转运蛋白基因的表达，从而提高糖转运蛋白的活性，使组织中可溶性糖（如蔗糖、果糖、葡萄糖或半乳糖）的含量迅速增加46。冷胁迫显著抑制茶树（Camellia sinensis）中CsSWEET2，-3 和-16 的表达，但能够显著诱导 CsSWEET1 和CsSWEET17 基因的表达7。对拟南芥（Arabidopsis thaliana）的研究发现，AtSWEET4，-11，-12，-16 和-17积极参与地上部或根系的生长发育，并通过分配糖的运输参与非生物胁迫的耐受过程8。与野生型相比，拟南芥 AtSWEET4基因敲除和过表达株系的电导率发生了显著变化，且 AtSWEET4介导的己糖（葡萄糖和果糖）积累是保护植物细胞免受冷冻胁迫的主要原因9。迄今为止，已有多种植物的 SWEET基因家族成员被确定，如水稻（Oryza sativa）有21条、小麦（Triticum aestivum）有 59 条、玉米（Zea mays）有24 条 SWEET 基因家族成员被确定10。在草地早熟禾（Poa pratensis）中共鉴定到 13 条 PpSWEETs糖转运蛋白基因，通过对非生物胁迫下 PpSWEET基因家族的表达模式分析发现，PpSWEET1b 基因在干旱、低温、盐、重金属镉和高温胁迫下均出现明显的上调表达，表明其在草地早熟禾抵抗非生物胁迫的糖转运过程中发挥了重要作用11。Xuan 等12提出，单个的 SWEET 蛋白太小，无法单独转运糖，因此需要低聚形成至少一个同二聚体和异二聚体以产生功能性的孔来运输糖，PpSWEET1b 是否协同或影响其他 SWEET蛋白基因的表达进而共同参与逆境调控也有待研究。生物体内存在多个水平的基因表达调控，严格控制代谢基因的协调表达对于调控其生长发育过程至关重要13。在基因表达激活和抑制中，转录调控主要DOI：10.16742/j.zgcdxb.20230117*通信作者，E-mail：mahl 收稿日期：2023-04-27；修回日期：2023-06-19基金项目：国家自然科学基金项目（31760699）；草业生态系统教育部重点实验室开放课题（KLGE-2022-16）；甘肃省自然科学基金（21JR7RA824）；甘肃省教育科技创新项目“优秀研究生创新之星”项目（2021CXZX-346）作者简介：张然（1995-），女，山西绛县人，博士，主要从事草种质资源与育种研究，E-mail：.11中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 1 期是通过基因启动子及其顺式作用元件来控制的14。以启动子作为研究对象，通过克隆启动子掌握其序列特征，对于了解其内在的重要功能元件及对调控区域的精准定位具有重要意义15。常见的应激反应元件包括 ABA 响应元件 ABRE（ACGTGG/T）、脱水反应元件 DRE（A/GCCGAC）、干旱诱导元件 Myb（CAACTG）、低温诱导元件 LTR（CCGAAA）等16。研究表明：脱落酸响应转录因子 OsbZIP72可直接与水稻 OsSWEET13 和 OsSWEET15 基因的启动子结合并激活它们的表达，调节蔗糖的转运和分布，以 调 控 水 稻 对 干 旱 和 盐 胁 迫 的 响 应17；番 茄（Solanum lycopersicum）SWEET 糖转运蛋白基因上游启动子区发现了许多与胁迫和激素反应相关的顺式作用元件，且不同器官如叶片、根系、绿果和红果中的多个 SWEET基因在高糖、高盐、高温和低温条件下的表达均发生了显著变化18。草坪草因其独特的观赏性、娱乐性及良好的生态效应深受人们的喜爱，被广泛种植于庭院、公园、运动场等，但其在生长发育过程中容易遭受到干旱、寒冷等环境胁迫，严重影响草坪的坪用质量及观赏价值。草地早熟禾是常见的冷季型草坪草之一，因其优异的草坪质量被广泛应用于世界各地，但其抗旱性较差，在干旱、半干旱及水分供应不足地区的推广应用受到严重制约1920。草地早熟禾品种蓝月（Bluemoon，美国）因其叶质细腻、绿期长、需肥量低、耐贫瘠、耐超低修剪、易养护等特性被广泛应用于北方草坪建植。之前的研究发现，干旱条件下，蓝月品种叶片和根系 PpSWEET1b基因均出现显著的上调表达，猜测其可能参与了草地早熟禾对干旱胁迫的响应。因此，本研究通过克隆草地早熟禾PpSWEET1b基因及其启动子序列，构建PpSWEET1b基因的植物过表达载体，并利用花序侵染法转化拟南芥，获得PpSWEET1b基因的拟南芥过表达株系，通过对比转基因株系和野生型植株在不同非生物胁迫下的表型及 SWEET1/1b 与同族 SWEET2 和 SWEET3 基因的表达模式，探究 PpSWEET1b 基因在植物抵抗非生物胁迫中的作用，为进一步研究 SWEET 糖转运蛋白在植物生长发育及胁迫响应中潜在的分子机制奠定理论基础。1材料与方法1.1试验材料草地早熟禾采用盆栽法育苗，土壤基质为蛭石和营养土（体积比 3 1）。将消毒后的种子均匀播种在育苗钵中培养，培养条件为：光照时间16 h，光照强度 6000 lx，温度 25；黑暗时间 8 h，温度 20；湿度为65%。培养20 d后采集叶片提取DNA和RNA。拟南芥野生型材料为哥伦比亚品种，将拟南芥种子置于 1.5 mL 离心管中，加 1 mL 无菌水后放置于 4 冰箱春化 2 d，用移液枪将其点播在含草炭土（丹麦）的育苗盆中，每盆 4 粒，覆保鲜膜保持湿度。生长条件为：光照时间 16 h，光照强度 6000 lx，温度 22；黑暗时间 8 h，温度 20；湿度为 65%。生长 7 d 后揭去保鲜膜，每 3 d 浇水一次，生长 20 d后，水与拟南芥营养液交替浇灌。拟南芥抽苔开花后，为促进腋生花序生长，剪去主苔花序。花蕾较多时，剪去已结果荚的花序后再进行后续转基因实验。1.2试验设计1.2.1草地早熟禾 DNA、RNA提取及 cDNA合成DNA 提取采用天根生物科技有限公司（中国）的新型植物基因组 DNA 提取试剂盒（离心柱型），货号为 Cat#DP320-02。RNA 提取采用天根生物科技有限公司（中国）的总 RNA 提取试剂盒（离心柱型），货号#DP419，使用 Nanopro 2010/2020 超微量紫外可见分光光度计（中国北京）检测 RNA 浓度和纯度。采用 Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒（Takara，大连）将RNA反转录成 cDNA。1.2.2草地早熟禾 PpSWEET1b基因克隆利用草地早熟禾 PpSWEET1b基因的开放性阅读框序列（Open reading frame，ORF）进行 In-fusion克隆引物设计（https： 物序 列 如 表 1 所 示。利 用 Takara 大 连 有 限 公 司 的PrimeSTAR Max DNA Polymerase 高保真酶（货号 R045A）进行 PCR 产物扩增，反应总体系 50 L，包括草地早熟禾 cDNA 1 L，上、下游引物各 1 L，PrimeSTAR Max Premix（2）25 L，ddH2O 22 L。反应程序为：98 持续 10 s，55 持续 5 s和 72 持续 60 s，35次循环。1.2.3草地早熟禾 pBI121-PpSWEET1b 过表达载体构建pBI121-eGFP 载体为本实验室保存，酶切位点选择 Xba 和 BamH。限制性内切酶购自 Takara大连有限公司，载体线性化步骤按照制造商的说明12张然 李根 牛奎举等 草地早熟禾 PpSWEET1b基因克隆及功能研究书进行，双酶切反应程序，37 保温 20 min。使用中美泰和生物技术（北京）有限公司的 In-fusion 克隆试剂盒（货号 C5891-25）进行目的片段与载体的连接反应，具体步骤按照说明书进行。1.2.4PCR产物胶回收、测序及阳性鉴定将 PCR 产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳，采用Takara 胶回收试剂盒（货号 Cat#9762）进行 PCR 产物胶回收。使用北京聚合美生物科技有限公司的M5 HiPer pTOPO-Blunt Cloning Kit（货号 MF021-01）构建克隆载体，反应程序为：室温反应 5 min；反应 体 系 为：纯 化 后 的 PCR 产 物 3 L，M5 HiPer pTOPO-Blunt Vector 1 L，10Enhancer 1 L，ddH2O加至 5 L。大肠杆菌转化：将反应连接液加入到 100 L刚冻融的大肠杆菌感受态细胞中，轻弹管底混匀，冰浴30 min，然后 42 热激 60 s，冰浴 2 min。加入 900 L无抗生素的 LB液体培养基，置于 37、200 r/min摇床培养 1 h，4000 r/min 离心 1 min 后移去 900 L 上清液，将菌体与剩余培养基混匀后吸取 100 L 涂于含有氨苄抗生素的 LB 固体培养基上，37 过夜培养。挑取单克隆菌斑，置入 5 mL 含抗生素的 LB 液体培养基中，37、200 r/min摇床过夜培养。菌液阳性鉴定：使用北京聚合美生物科技有限公 司 的 2M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix（with blue dye）新型蓝色染料高保真 Taq 酶 mix 进行菌液PCR 扩增，货号 MF002-plus-10。20 L PCR 反应总体积包括菌液 1 L、8 L ddH2O、M13 通用引物上、下游各 0.5 L（10 mol/L）和 2M5 HiPer plus Taq HiFi PCR Mix（with blue dye）10 L。反应过程在PCR 仪上进行，反应程序为：95 预变性 3 min，94 变性25 s，55 退火25 s和72 延伸1 min，35次循环，72 延伸 5 min后 4 保持。阳性克隆菌液利用北京擎科生物科技有限公司的高纯度质粒 DNA小提试剂盒（货号 Cat#PM020550）进行质粒提取，具体步骤按照说明书进行，然后送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。1.2.5草地早熟禾 PpSWEET1b 基因启动子区克隆及顺式元件预测以草地早熟禾品种蓝月叶片 DNA为模板，使用Takara大连有限公司的染色体步移试剂盒（Genome Walking Kit，货号6108）获取草地早熟禾PpSWEET1b基因启动子序列。设计的具有高退火温度的下游特异性引物如表2所示，分别命名为PpSWEET1b-Pro-SP1、PpSWEET1b-Pro-SP2、PpSWEET1b-Pro-SP3。拟 南 芥、水 稻、玉 米 和 二 穗 短 柄 草（Brachypodium distachyon）的 SWEET1b 基 因 启 动子序列转录起始位置之前 2000 bp区域从 Phytozome数据库中查找并下载，结合扩增得到的草地早熟禾PpSWEET1b 基因的启动子序列，利用 PlantCARE网站（https：bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行顺式作用元件的预测分析。1.2.6PpSWEET1b基因转化拟南芥采用热激法将 pBI121-PpSWEET1b 质粒转化到农杆菌 GV3101 感受态细胞（购自北京博迈德基因技术有限公司，货号 BC314-01）。利用花序侵染法转化拟南芥，以含 50 mg/L 卡那霉素的 1/2 MS固体培养基作为筛选培养基，直至获得 T3代植株全部为绿色抗性植株，得到转基因拟南芥纯合植株。1.2.7转基因植株在非生物胁迫下的功能验证将拟南芥转基因 T3代种子（OE）和野生拟南芥种子（WT）均置于 1.5 mL 离心管中，加 1 mL 无菌水后置于 4 冰箱春化 2 d，取出后 12000 r/min 离心 1 min，然后用 75%乙醇消毒 2 min，无菌水冲洗 5次，20%次氯酸钠溶液消毒 10 min，无菌水冲洗 5次。加入少量 ddH2O 水悬浮种子，用移液枪点播于表 1与植物过表达载体相结合的 PpSWEET1b基因 In-fusion克隆引物Table 1PpSWEET1b gene In-fusion clone primers combine to plant overexpression vector过表达载体Overexpression vectorpBI121-PpSWEET1b上游引物(5-3)Primer forward sequence(5-3)CACGGGGGACTCTAGAATGGAGGATGTGGCCAAGTTC下游引物(5-3)Primer reverse sequence(5-3)GACCACCCGGGGATCCCACCTGGCTGTCCATCTTGC注：下划线代表酶切位点。Note：The underline represents the enzyme cleavage site.表 2草地早熟禾 PpSWEET1b启动子序列扩增引物Table 2Primers for sequence amplification promoter regions of PpSWEET1b in Kentucky bluegrass引物名称Primer namePpSWEET1b-Pro-SP1PpSWEET1b-Pro-SP2PpSWEET1b-Pro-SP3引物序列(5-3)Primer forward sequence(5-3)TTCTTCTCCTTCGACGAACCCATTGTGTGTGGATGGATGGATGGATCGAGTGTGACGGCCTATT13中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 1 期1/2 MS 固体培养基，每皿 6 粒（转基因种子和野生型种子各 3粒），放置于甘肃农业大学草业学院生长室竖立生长。生长条件为：光照时间 16 h，光照强度6000 lx，温度 22；黑暗时间 8 h，温度 20；湿度为65%。发芽 15 d 后选取长势健康、均一的幼苗进行胁迫处理。试验设置 3 组处理，分别是对照（22、1/2 MS固体培养基培养）、干旱处理（22、含 100 mmol/L甘露醇的 1/2 MS固体培养基培养）、低温处理（7、1/2 MS 固体培养基培养），每组处理 4 个重复。分别于处理第 3 d 和第 7 d 拍照，并测定 WT 和 OE 单株叶片和根系鲜重，以及叶片丙二醛（MDA）和葡萄糖含量。于处理第 3 d 采集 OE 和 WT 植株总叶片及总根系用于 RNA 提取，取样后迅速冷冻在液氮中，储存在80 冰箱，每个处理 3个重复。1.2.8RNA提取和实时定量 PCR分析RNA 提取使用天根生物科技有限公司（中国）的总 RNA 提取试剂盒（离心柱型），货号#DP419，使用 Nanopro 2010/2020 超微量紫外可见分光光度计（中国北京）检测 RNA 浓度和纯度。然后使用宝 生 物（Takara）大 连 有 限 公 司 的 反 转 录 试 剂 盒PrimerScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）合成 cDNA，货号 R047A。实时定量 PCR（qRT-PCR）使用天根生化科技（北 京）有 限 公 司 的 荧 光 定 量 试 剂 盒 SuperReal RreMix Plus（SYBR Green），货号FP206-02。20 L反应总体积包括 5 L稀释模板（20 L cDNA 用 180 L ddH2O稀释 20倍）、3 L ddH2O、1 L上游和 1 L下游 引 物（10 mol/L）、10 L 2SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）。反应过程在 LightCycler96仪器（中国上海 Roche）上进行。反应程序为：95 预变性 15 min，95 变性 10 s 和 58 退火 30 s，40 次循环。熔解曲线分析保留默认，为 95 持续 1 s，65 持续 15 s，95 持续 1 s。每个样品设 4 次技术重复。使用 2CT方法计算相对基因表达值11。草地早熟禾 PpSWEET1b、拟南芥 AtSWEET1，-2 和-3 及内参基因 AtACT21的特异性引物设计见表 3，由兰州天启基因生物科技有限公司合成。1.3数据分析采用 SPSS 19.0 Windows 版（SPSS Inc.，USA）分析数据，进行单因素方差分析和邓肯多重比较（P0.05）及 T检验分析，采用 GraphPad Prism 8.0.2软件绘图。2结果与分析2.1PpSWEET1b基因克隆及过表达载体构建以草地早熟禾 cDNA 为模板，采用无缝克隆引物扩增得到草地早熟禾 PpSWEET1b 的扩增产物（图 1-a），连接载体转化后对阳性克隆测序得到产物长度为 813 bp，并构建了 pBI121-PpSWEET1b的过表达载体并进行测序验证，目的条带如图 1-b。2.2草地早熟禾 PpSWEET1b 基因启动子克隆及不同物种 SWEET1b基因启动子顺式作用元件分析本研究利用基因组染色体步移技术获得了草地早熟禾 PpSWEET1b 基因的启动子序列，序列长度为2259 bp。结合测序完成的拟南芥、二穗短柄草、水稻和玉米的 SWEET1b序列对 PpSWEET1b的启动子序列进行顺式作用元件的预测及分析，结果如表 4所示。PpSWEET1b基因启动子中共预测到 17个与胁迫和激素响应相关、7个与光响应相关的顺式作用元件。其中，草地早熟禾PpSWEET1b启动子预测结果中有 11个与胁迫和激素响应相关的顺式作用元件与玉米预测结果相同，PpSWEET1b与 BdSWEET1b启动子区均含有ERE和STRE元件，与AtSWEET1b和 OsSWEET1b启动子区同时具有 TCA 作用元件。与拟南芥、水稻、玉米和 二穗短柄草相比，草地早熟禾 PpSWEET1b基因启动子序列中特有的与胁迫和激素响应相关顺式作用元件有 LTR、TC-rich repeats和 WUN-motif，光响应元件中 PpSWEET1b 特有的是Gap-box。表 3qRT-PCR引物Table 3Primers for qRT-PCR基因GenePpSWEET1bAtSWEET1AtSWEET2AtSWEET3AtACT登录号GenBank accession No.MT544310AT1G21460AT3G14770AT5G53190AEE76147.1上游引物(5-3)Primer forward sequence(5-3)GGTGCCATACAACATGACGCTTGGTGGTAAAGACGAAGAGTGTGGTTGGAGTGATTGTAGTGTTACATTTGTTCCGGTGATTGACAATTGATGCAAACAATGACG下游引物(5-3)Primer reverse sequence(5-3)AGCACAGGAAGATCACCACGGACCGATTAGACCATAGACGCTCAAGAACCCGACAAAGTACTTCATAACGACGAGAGGAGCCATTGCTTAATTCCACGGACAAAC14张然 李根 牛奎举等 草地早熟禾 PpSWEET1b基因克隆及功能研究2.3pBI121-PpSWEET1b的拟南芥遗传转化拟南芥转化实验过程如图 2所示。将含阳性重组质粒的农杆菌菌液采用花序侵染法转化拟南芥后收集全部成熟的种子，记作 T0代；将部分 T0代种子消毒后点播在含 50 mg/L 卡那霉素的 1/2 MS 固体培养基上，剩余 T0代种子置于 4 冰箱保存，内置变色硅胶。将在抗性培养基上生长良好的拟南芥进行移栽，待其长出 78 片真叶时，取最底端叶片进行DNA 提取及 PCR 检测，得到的目的条带约 800 bp，与预期大小一致（图 3），继续培养获得 T1代种子。2.4干旱胁迫对野生型和 PpSWEET1b 过表达拟南芥植株的影响2.4.1干旱胁迫下野生型和 PpSWEET1b 过表达株系的形态特征如图 4 所示，正常温度及培养基培养条件下，WT 和 OE 植株的生长状态无明显差异，均为绿色叶片，生长状态良好。干旱处理 3 d 后，WT 植株叶片出现明显的发黄和萎蔫，而 OE 则表现为叶色变浅，部分叶片呈现浅黄色，叶片微微卷曲，根系生长均受到影响；WT 和 OE 叶片和根系鲜重较其对照表 4不同物种中 SWEET1b启动子元件分析Table 4The cis-acting element analysis of SWEET1b promoter in different species基因名Gene nameAtSWEET1BdSWEET1bOsSWEET1bPpSWEET1bZmSWEET1b登录号GenBank accession No.AT1G21460Bradi2g24850LOC_Os05g35140MT544310Zm00001d038226胁迫、激素相关元件Motifs related to stress response and hormoneABRE(2)、ABRE3a(2)、ABRE4(2)、ARE(5)、as-1(3)、CGTCA-motif(3)、ERE(2)、MYB(4)、Myb(1)、MYB-like(4)、MYB recognition site(1)、MYC(3)、TCA(2)、TCA-element(1)、TGA-element(1)、TGACG-motif(3)ABRE(2)、ARE(1)、as-1(1)、AuxRR-core(1)、CGTCA-motif(1)、DRE core(1)、ERE(1)、MYB(1)、MYC(5)、P-box(1)、STRE(1)、TCA-element(1)、TGACG-motif(1)ABRE(2)、ARE(1)、as-1(3)、AuxRR-core(1)、CGTCA-motif(3)、DRE core(1)、MBS(2)、MYB(2)、Myb(3)、Myb-binding site(2)、MYB recognition site(1)、MYC(4)、TATC-box(1)、TCA(1)、TCA-element(1)、TGACG-motif(3)、W box(1)ABRE(7)、ABRE3a(2)、ABRE4(2)、ARE(3)、as-1(6)、CGTCA-motif(6)、ERE(2)、LTR(3)、MYB(1)、MYB recognition site(1)、Myb(1)、MYC(6)、STRE(1)、TCA(1)、TC-rich repeats(2)、TGACG-motif(6)、WUN-motif(1)ABRE(4)、ABRE3a(1)、ABRE4(1)、ARE(1)、as-1(2)、CGTCA-motif(2)、MYB(3)、MYB-like sequence(1)、MYB recognition site(1)、MYC(5)、STRE(2)、TGACG-motif(2)、W box(2)光响应元件Motifs related to light responsiveAAAC-motif(1)、AE-box(1)、Box 4(3)、G-Box(1)、G-box(2)、GT1-motif(6)、MRE(3)、TCT-motif(1)ACE(1)、3-AF1 binding site(1)、AT1-motif(1)、Box 4(3)、CAG-motif(1)、G-Box(2)、G-box(2)、MRE(1)、TCCC-motif(3)Box 4(1)、GATA-motif(1)、G-box(3)、GT1-motif(1)、Sp1(1)、TCCC-motif(1)AE-box(1)、AT1-motif(1)、Box 4(1)、Gap-box(1)、G-Box(1)、G-box(5)、TCT-motif(1)chs-CMA1a(1)、chs-CMA2a(1)、chs-CMA2c(1)、C-box(1)、G-Box(1)、G-box(3)注：括号内阿拉伯数字表示该顺式元件的数量。Note：The Arabic numerals in parentheses indicate the number of cis elements.图 1-a中，泳道 1为 DNA Marker 2000，泳道 2为 PpSWEET1b条带；图 1-b中，泳道 1为 DNA Marker 15000，泳道 2为 pBI121-eGFP条带，泳道3为 pBI121-PpSWEET1b条带。In Fig.1-a，Lane 1 shows DNA Marker 2000，and Lane 2 shows PpSWEET1b band；In Fig.1-b，Lane 1 shows DNA Marker 15000，Lane 2 shows pBI121-eGFP band，and Lane 3 shows pBI121-PpSWEET1b band.图 1 草地早熟禾 PpSWEET1b基因克隆（a）及过表达载体构建（b）结果Fig.1Genetic cloning results of PpSWEET1b（a）and overexpress vector construction results（b）15中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 1 期均极显著降低（P0.01），但 OE-T（胁迫处理下的转基因拟南芥植株）叶片和根系鲜重高于 WT-T（胁迫处理下的野生型拟南芥植株），差异显著（P0.05）。干旱胁迫第 7 d，WT 植株叶片黄化现象严重，甚至凋亡，而 OE 植株仅有少量下部叶片发黄，大多叶片颜色仍为绿色，且叶片生长发育状态明显图 2草地早熟禾 PpSWEET1b-T1的拟南芥转化过程Fig.2Arabidopsis thaliana transformation experiment of PpSWEET1b-T1 of Poa pratensis泳道 1：DNA Marker 5000；泳道 2：阴性对照；泳道 3：阳性对照；泳道 413：样本 110。其中，泳道 4、泳道 5、泳道 712为 SWEET1b基因侵染拟南芥阳性苗的 PCR条带。Lane 1：DNA Marker 5000；Lane 2：Negative control；Lane 3：Positive control；Lane 4-13：Sample 1 to10，where Lane 4，Lane 5 and Lane 712 are the PCR band of PpSWEET1b gene infested Arabidopsis thaliana positive seedlings.图 3拟南芥 T1代株系 PCR检测Fig.3PCR test results of T1 generation strains of Arabidopsis thaliana16张然 李根 牛奎举等 草地早熟禾 PpSWEET1b基因克隆及功能研究优于 WT；叶片和根系鲜重的变化趋势同干旱胁迫第 3 d 完全一致，表明 PpSWEET1b 过表达植株较野生型植株有较强的抗旱性。2.4.2干旱胁迫对野生和过表达植株叶片 MDA和葡萄糖含量的影响由图5可以看出，拟南芥WT-CK和OE-CK叶片MDA 含量基本一致，干旱胁迫处理后，叶片 MDA含量显著增加，WT-T叶片 MDA含量比对照极显著增加（P0.01），且显著高于其他处理（P0.05）。OE-CK 叶 片 葡 萄 糖 含 量 显 著 高 于 WT-CK（P0.05），干旱胁迫下 OE-T 和 WT-T 叶片葡萄糖含量较其对照有所提高，野生型植株处理间差异显著（P0.05），胁迫第 7 d 时，OE-T 叶片葡萄糖含量显著高于其他处理（P0.05）。柱状图表示胁迫第 3 d（a）和胁迫第 7 d（b）的植株叶片和根系的鲜重。对照组与胁迫处理组采用 t检验，*表示差异显著（P0.05），*表示差异极显著（P0.01），ns表示差异不显著；不同大写和小写字母表示四组处理间差异显著（P0.05）；WT-CK和 WT-T表示正常处理和胁迫处理下的野生型拟南芥植株，OE-CK和 OE-T表示正常处理和胁迫处理下的转基因拟南芥植株，图 8同。The bar chart represents the fresh weight of plant leaves and roots on the 3rd（a）and 7th day（b）of stress.The control group and the stress treatment group were subjected to t-test，*show significant difference at P0.05，*show significant difference at P0.01，ns shows no significant difference.Different uppercase and lowercase letters indicate significant differences among the four groups of treatments at P0.05 between groups.WT-CK and WT-T represent wild-type Arabidopsis under normal and stress treatments，while OE-CK and OE-T represent transgenic Arabidopsis thaliana under normal and stress treatments，Fig.8 is the same as this.图 4干旱胁迫对野生型和 PpSWEET1b过表达植株形态特征及鲜重的影响Fig.4Effects of drought stress on morphological characteristics and fresh weight of wild-type and PpSWEET1b overexpressing plants图 5干旱胁迫对野生型和 PpSWEET1b过表达植株叶片丙二醛（a）和葡萄糖（b）含量的影响Fig.5Effects of drought stress on the content of malondialdehyde（a）and glucose（b）of wild-type and PpSWEET1b overexpressing plants17中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 1 期2.4.3干旱胁迫下野生和过表达植株 SWEET1/1b的表达分析SWEET1b是SWEET1的同源基因，在野生型拟南芥中测定 SWEET1的表达量作为对照。从图 6可以看出，正常培养条件下，OE植株叶片中 SWEET1b基因的表达量是WT植株的42.92倍，差异显著（P0.05）。干旱胁迫处理后，WT 叶片中的 SWEET1基因的表达量较 CK 极显著上调（P0.01），而 OE植株的表达量较其 CK无明显变化。正常培养条件下，OE 植株根中 SWEET1b 基因的表达量也较 WT 植株高约 544.73倍，差异显著（P0.05）。干旱胁迫均降低了根中 SWEET1/1b的表达水平，WT-T的相对表达量仅为0.1779，而OE-T的相对表达量约为 91.14，较 OE-CK 低 83.27%，差异极显著（P0.01）。2.4.4干旱胁迫下野生和过表达植株 SWEET2和SWEET3的表达分析本研究对 SWEET1 的同族基因 SWEET2 和SWEET3 的表达模式也进行了分析，结果如图 7 所示。正常培养条件下，OE 植株叶片中 SWEET2 的表达水平显著高于其在 WT中的水平（P0.05），干旱胁迫显著上调了 WT 和 OE植株叶片中 SWEET2的表达（P0.05），但 WT-T 和 OE-T 处理间差异不显著。干旱胁迫均降低了根系 SWEET2 的表达水平，WT 和 OE 干旱处理植株表达量较对照分别降低 51.24%（P0.05）和 68.25%（P0.01），处理间表现出 WT-CK 与 OE-CK 差异不显著，WT-T 与OE-T差异不显著。SWEET3基因在 WT 和 OE植株叶片中的表达模式与 SWEET2在根系中的表达模式基本相同，仍表现为干旱胁迫抑制了叶片 SWEET3 基因的表达水平；相反地，干旱胁迫处理后，根系 SWEET3基因的表达在 WT和 OE植株中均受到促进，是正常培养条下的 WT 和 OE 植株的 1.53 倍（P0.05）和 3.77倍（P0.01），处理间表现为 OE-T 根系 SWEET3的表达量最高，显著高于其他处理（P0.05）。2.5低温胁迫对野生型和 PpSWEET1b 过表达拟南芥植株的影响2.5.1低温胁迫下野生型和 PpSWEET1b 过表达植株的形态特征如图 8所示，低温处理 3 d后，WT 和 OE植株的生长均受到抑制，叶片较小，生长状态较差，二者差异不明显；持续处理 7 d后，二者的生长状态表现出明显差异，WT 植株叶片较 CK 仍比较小，叶色发黄，而 OE 植株生长状态有所恢复，叶色深绿，叶片较大，生长