坏死杆菌外膜囊泡诱导羊中性粒细胞自噬和NLRP3炎性小体的研究.pdf

第45卷第12 期2023年12 月doi:10.3969/j.issn.1008-0589.202209023坏死杆菌外膜囊泡诱导羊中性粒细胞自噬和NLRP3炎性小体的研究中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary MedicineVol.45,No.12Dec.2023毕栏，赵鹏宇，王天硕，于思雯，肖佳薇，郭东华*（黑龙江八一农垦大学动物科技学院/农业农村部东北寒区牛病防治重点实验室，黑龙江大庆16 3319)摘要：为探究坏死杆菌(Fn)外膜囊泡(OMV)对羊中性粒细胞自噬及NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体激活的影响，本研究提取并纯化FnOMV，经透射电子显微镜观察并测定纯度后，以5g/mL的OMV刺激羊中性粒细胞1h、2 h、4h、6 h，以未刺激的细胞作为对照组，经姬姆萨染色和倒置光学显微镜观察羊中性粒细胞形态。电镜观察可见OMV为球形囊泡状结构且纯度较高。姬姆萨染色结果显示，细胞为典型的杆状核和分叶核样中性粒细胞。光学显微镜观察结果显示，对照组羊中性粒细胞为圆形，而5g/mLOMV刺激组细胞出现细胞肿胀、体积变大变形的现象，且刺激2 h6 h 上述细胞变化更明显。采用荧光定量RT-PCR检测OMV刺激后的羊中性粒细胞中炎性小体相关基因NLRP3、Ca s p a s e-1、G SD M D、IL-1、IL-18，自噬相关基因mTOR、Be c l i n 1、M A PILC3B、P62mRNA的相对转录水平。结果显示，与对照组相比，OMV刺激1h时GSDMDmRNA的相对转录水平极显著升高(P0.0001)，其他炎性小体相关基因mRNA的相对转录水平无显著变化；刺激2 h时GSDMDmRNA的相对转录水平显著下降(P0.05)，炎性小体相关基因NLRP3、Ca s p a s e-1、IL-1、IL-18 mRNA 的相对转录水平均显著升高(P0.05)；刺激4h和6 h时GSDMDmRNA的相对转录平极显著下降(P0.0001)，NLRP3、IL-1mRNA的相对转录水平均显著升高(P0.05)，Ca s p a s e-1、IL-18 m RNA 的相对转录水平均无显著变化。自噬相关基因mTOR、Be c l i n 1、MAPILC3B、P6 2 m RNA 的相对转录水平在不同刺激时间后均显著升高(P0.05)。上述结果表明，5g/mL的FnOMV刺激羊中性粒细胞2 h可激活NLRP3炎性小体；5g/mL的FnOMV可在基因水平上启动羊中性粒细胞自噬并形成自噬小体。本研究为Fn的致病机制研究奠定了基础。关键词：坏死杆菌；外膜囊泡；NLRP3炎性小体；自噬中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：10 0 8-0 58 9(2 0 2 3)12-12 7 2-0 7Autophagy and NLRP3 inflammasome induced byFusobacterium necrophorum OMV in sheep neutrophilsBI Lan,ZHAO Peng-yu,WANG Tian-shuo,YU Si-wen,XIAO Jia-wei,GUO Dong-hua*(College of Animal Science and Veterinary Medicine,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Key Laboratory of Bovine Disease Control inNortheast China Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Daqing 163319,China)Abstract:To investigate the effects of outer membrane vesicle(OMV)of Fusobacterium necrophorum on autophagy andNOD-like receptor protein 3(NLRP3)inflammasome activation of sheep neutrophils.OMV was extracted and purified.After the*Corresponding author收稿日期：2 0 2 2-0 9-2 7基金项目：黑龙江省自然科学基金项目(LH2021C070)作者简介：毕栏(1997-)，女，黑龙江牡丹江人，硕士研究生，主要从事牛坏死杆菌病发病机制及疫苗研究*通信作者：E-mail：d h _g u o 12 6.c o m第12 期毕栏，等.坏死杆菌外膜囊泡诱导羊中性粒细胞自噬和NLRP3炎性小体的研究1273purity of OMV was identified by transmission electron microscope,sheep neutrophils were treated with OMV at a concentration of5g/mL for 1 hour,2 hours,4 hours and 6 hours.The sheep neutrophils was stained by Giemsa staining and observed under ainverted optical microscope.The results of Giemsa staining showed that the cells were neutrophils with typical rod-shaped andlobulated nuclei.The results of optical microscopy showed that the sheep neutrophils in the mock group were round,while thecells in the 5g/mL OMV stimulation group showed cell swelling,enlargement and deformation.The relative transcription levelsof mRNA for the inflammasome-related genes NLRP3,Caspase-1,GSDMD,IL-1 and IL-18,and autophagy-related genes mTOR,Beclin 1,MAPILC3B and P62 in sheep neutrophils were detected by fluorescence quantitative PCR(qRT-PCR).The results ofqRT-PCR showed that compared with the mock group,the relative transcription level of GSDMD mRNA was significantlyincreased at 1 hour(P0.0001),and the relative transcription levels of other inflammasome-related genes were not significantlychanged.The relative transcription level of GSDMD mRNA decreased significantly after stimulation for 2 hours(P0.05),and therelative transcription levels of inflammasome-related genes NLRP3,Caspase-1,IL-1 and IL-18 mRNA increased significantly(P0.05).After stimulation for 4 hours and 6 hours,the relative transcription level of GSDMD mRNA decreased significantly(P0.0001),the relative transcription levels of NLRP3 and IL-1 mRNA increased significantly(P0.05),and the relativetranscription levels of Caspase-1 and IL-18 mRNA did not change significantly.The relative transcription levels ofautophagy-related genes mTOR,Beclin 1,MAPILC3B,and P62 mRNA were significantly up-regulated after different stimulationtimes(P0.05).The above results showed that 2 hours stimulation with 5g/mL OMV could activate NLRP3 inflammasome insheep neutrophils.5g/mL of OMV could initiate autophagy of sheep neutrophils at the genetic level and form autophagosomes.This study provides a reference for the study of the pathogenic mechanism of F.necrophorum.Key words:Fusobacterium necrophorum;outer membrane vesicles;NLRP3 inflammasome;autophagy坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum，Fn)属于拟杆菌科，梭杆菌属，是一种革兰阴性、杆状、严格厌氧菌。Fn无芽孢、无运动性，在自然界分布广泛，是牛羊等反动物瘤胃、泌尿生殖道的正常菌群。Fn可独立引起感染，也可与其他病原菌(主要是节瘤拟杆菌)协同致病2 ，是一种机会性病原体。Fn主要引起牛羊鹿等反刍动物的腐蹄病和肝脓肿3、猪的坏死性皮炎、人的Lemierres综合征等疾病4。Fn主要是从受损的瘤胃壁进入门脉循环从而到达肝脏中，导致反动物发生肝脓肿，给畜牧养殖业造成严重的经济损失5。但是Fn导致肝脓肿的致病机制至今还不明晰，因此对Fn致病机制的研究具有重要的现实意义。Fn的致病机理主要与其分泌的毒力因子有关，包括白细胞毒素、溶血素、内毒素、皮肤坏死毒素以及一些胞外酶等6 。这些致病因子能够帮助细菌侵袭宿主细胞，从而引起各种损伤，包括炎症、自噬、细胞凋亡等7 。细菌外膜囊泡(Outer membranevesicle，O M V)是革兰阴性菌在生长过程中释放到胞外的囊泡状结构18 。由于OMV中含有多种细菌衍生成分，包括酶、毒力因子、细菌特异性抗原和各种病原体相关分子模式(PAMP)，如脂多糖(LPS)、脂蛋白、DNA、RNA、肽聚糖等9，因此OMV能够参与细菌感染性疾病的致病过程。自噬(Autophagy)是真核细胞内普遍存在的一种自我保护机制。其发生过程主要分为起始、延伸、成熟和降解4个阶段。NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体广泛分布于多种细胞中，包括巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、上皮细胞等，能够被病原体相关分子模式(PAMP)和损伤相关分子模式(DAMP)等信号激活，并参与多种炎症疾病的致病过程12 。例如，脑膜炎奈瑟球菌的OMV能够刺激人中性粒细胞分泌IL-1l13,还能够激活骨髓源巨噬细胞(BMDM)的NLRP3炎性小体14。Karmakar等发现在小鼠的中性粒细胞中可通过自噬依赖机制释放IL-115，因此在不同的条件下，自噬与NLRP3炎性小体是相互调节的。目前对Fn OMV在Fn致病过程中的作用机制尚不明确，由于在Fn侵袭宿主细胞的过程中，机体的先天性免疫细胞，如中性粒细胞、巨噬细胞等首先发挥作用。因此，本研究在基因水平上探究Fn OMV对羊中性粒细胞自噬及NLRP3炎性小体的影响，为Fn的致病机制研究提供参考依据。1274中国预防兽医学报2023年1材料与方法1.1主要实验材料FnA25标准菌株购自美国ATCC公司，由黑龙江八一农垦大学兽医分子病理学实验室保存。绵羊外周血采集自黑龙江八一农垦大学动物科技学院购买的健康小尾寒羊(已通过血凝实验检测无布鲁氏菌病)。OptiPrep分离液购自挪威Axis-Shield公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒和PBS购自Biosharp生物公司；革兰染色液试剂盒购自北京奥博星生物技术有限公司；苛氧厌氧菌肉汤培养基购自山东拓普生物工程有限公司；脑心浸液肉汤培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司；绵羊外引物名称上游引物序列(5-3)Primer nameForward primer sequenceNLRP3CTCTGGTTGGTCAGTTGCTGTCTCCaspase-1ACACCTTGAACTGCCCAGCTTTAGGSDMDCTTGCACTCACGGTTCTGGAGACIL-1AGTGATGGCTTGCTACAGTGATGAGIL-18CTGTTCAGATAATGCACCCCAGACCmTORAGAGCACCGAGAACAGCCCTACMAPILC3BCGCTTACAGCTCAATGCTAATCBeclin 1TCAGCCTGAGGAACAGATGGAGTCP62TCAGCCTGAGGAACAGATGGAGTC-actinGATCTGGCACCACACCTTCTACAAC1.3FnOMV的提取、纯化及电镜观察冬参照文献铺于六孔板中，约510%个/孔，将OMV以5g/mL加16，将Fn菌液于48 50 0 g条件下离心2 0 min，入六孔板中，分别刺激羊中性粒细胞1h、2 h、4h、收集上清液经0.2 2 m的滤膜过滤后收集滤液。将6 h，未刺激组作为对照组(Mock组)。OMV刺激结滤液在42 130 0 0 g条件下离心2 h，弃上清液，束后，用光学显微镜观察各时间点的细胞形态。将沉淀用无菌PBS重悬即为粗提OMV。用长针头注1.5OMV对羊中性粒细胞NLRP3炎性小体相关基射器向离心管底部分别注入2 mL浓度为40%、35%、因转录水平影响的qRT-PCR检测利用TRIzol试剂30%、2 5%、2 0%的OptiPrep分离液，将粗提OMV置提取1.4中收集的OMV刺激后各时间点的羊中性粒于分离液的底层，在41350 0 0 g条件下离心16 h细胞及对照组羊中性粒细胞RNA，采用反转录试剂后，从上至下依次吸取不同浓度的OptiPrep稀释液，盒对各RNA样品反转录为cDNA作为模板，采用表1用无菌PBS将不同浓度的OptiPrep稀释液稀释10 倍中NLRP3、Ca s p a s e-1、G SD M D、IL-1、IL-18 引物,后，在42 0 0 50 0 g条件下离心2 h，弃上清液，利用qPCR试剂盒检测各组细胞中上述NLRP3炎性小将沉淀重悬于无菌PBS中即为纯化OMV，-8 0 保体相关基因转录水平，以-actin为内参基因通过存备用。2-AA法分析OMV对羊中性粒细胞NLRP3炎性小体相根据BCA蛋白浓度检测试剂盒说明测定纯化关基因的影响。OMV的浓度，经透射电子显微镜观察纯化OMV的1.6OMV对羊中性粒细胞自噬相关基因转录水平形态及纯度。影响的qRT-PCR检测参照1.5方法采用表1中mTOR、1.4OMV刺激后羊中性粒细胞的形态观察察利用MAP1LC3B、Be c l i n 1、P6 2 引物，利用qPCR试剂盒绵羊外周血中性粒细胞分离试剂盒分离中性粒细检测各组细胞中上述自噬相关基因转录水平，分析胞，经姬姆萨染色观察后，将羊外周血中性粒细胞OMV对羊中性粒细胞自噬相关基因的影响。周血中性粒细胞分离试剂盒和快速姬姆萨染色液购自索莱宝生物科技有限公司；RPMI-1640培养基购自Sigma公司；反转录试剂盒和荧光定量PCR(qPCR)试剂盒购自TaKaRa公司。1.2引物的设计与合成根据NCBI登录的NLRP3(101107699)、Ca s p a s e-1(1116 7 52 10)、GSDMD(101117254)、I L-1(443539)、I L-18(4432 0 6)、mTOR(100271659)、M A P1LC 3B(10 110 5939)、Be c li n 1(100913170)、P6 2 (10 0 135450)、-actin(443052)基因序列，采用Primer5.0设计引物(表1)，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。表1 引物序列Table1Primer sequence下游引物序列(5-3)Reverse primer sequenceGGTCAGGGAATGGTTGGTGCTTAGTACCCATACCACCCCTTGCTTCTCATTGCATCGTGGAACTGGAAGGTGCAGGTGTTGGGTGCAGCTCTTCTGGTTACAGCCAGACCTCTAGTGAGGGAACGGAAGAAGCCTTGGACAGTCATCCTTCTCGCTTTCATACAAGAGACTGGAGTTCACCTGTAGACGAGAGACTGGAGTTCACCTGTAGACGGATCTGGGTCATCTTCTCACGGTTG第12 期毕栏，等.坏死杆菌外膜囊泡诱导羊中性粒细胞自噬和NLRP3炎性小体的研究12751.7数据的统计与分析所有的试验结果均以3次独立试验的平均值+标准差来表示，并采用GraphPadPrism8中的onewayANOVA分析各组数据的差异性。*为P0.05，差异显著；*为P0.01、*为P0.001、*为P0.0001，均表示差异极显著。2 结 果2.1FnOMV的提取、纯化及电镜观察结果20%、2 5%、30%和35%OptiPrep分离液中提取的OMV混合，根据BCA试剂盒操作步骤得出蛋白浓度标准曲线公式：y=1943.6x-10.144(R2-0.998)。根据标准曲线可知，提取的OMV浓度为6 2 8.8 7 44g/mL。为鉴定密度梯度离心法提取的FnOMV纯度，对FnOMV经透射电镜观察分析。结果显示，FnOMV为球形囊泡状结构且纯度较高(图1)，可用于后续试验。2.2OMV刺激后羊中性粒细胞的形态观察对分离的绵羊中性粒细胞经姬姆萨染色后观察可见，细胞为典型杆状核和分叶核样中性粒细胞，细胞核为紫色，细胞质为淡红色(图2 A)，符合中性粒细胞形态和染色特征，表明可用于后续试验。通过光学显微镜观察OMV刺激后不同时间羊中性粒细胞形态的变化，结果显示，对照组细胞为小圆形，而5g/mL的OMV刺激1h时细胞出现轻微肿胀及变形，刺激2 h、4h 和6 h时细胞肿胀变形最为明显(图2 B2 F)，表明FnOMV可以使羊中性粒细胞形态发生改变。将从图1FnOMV透射电镜观察结果(30 0 0 0)Fig.1 Transmission electron microscopy results ofFn OMV(30 000)BA：绵羊中性粒细胞的姬姆萨染色(油镜，10 0 0 x)；B：对照组的绵羊中性粒细胞；CF：O M V 刺激1h、2 h、4h、6 h 的绵羊中性粒细胞；红色箭头：正常细胞；蓝色箭头：变形细胞；绿色箭头：变大细胞(10 0)A:Giemsa staining of sheep neutrophils(oil lens,1 0o0 x);B:Mock group sheep neutrophils;C-F:OMV stimulation sheep neutrophils for 1 hour,2 hours,4 hours and 6 hours;Red arrow:Normal cells;Blue arrow:Deformed cells;Green arrow:Enlarged cells(100 x)图2 羊中性粒细胞姬姆萨染色及FnOMV对羊中性粒细胞形态影响的观察结果Fig.2 The results of giemsa staining of sheep neutrophils and the effect of OMV of Fn on the morphology of sheep neutrophils2.3OMV对羊中性粒细胞NLRP3炎性小体相关基因转录水平影响的qRT-PCR检测结果通过qRT-PCR方法检测OMV刺激后不同时间羊中性粒细胞中炎性小体相关基因 NLRP3、Ca s p a s e-1、G SD-MD、I L-1、I L-18 m RNA 的相对转录水平，结果显示，5g/mL的OMV刺激羊中性粒细胞后，与对照1276中国预防兽医学报2023年组相比，1 h组GSDMD mRNA的相对转录水平极显著升高(P0.05)；2 h 组GSDMDmRNA的相对转录水平显著下降(P0.05)，炎性小体相关基因 NLRP3、Ca s p a s e-1、IL-1、IL-18 m RNA 的相对转录水平显著或极显著升高；4 h组和6 h组GS-DMD mRNA的相对转录平极显著下降(P0.05,*:P0.05,*:P0.01,*:P0.001,*:P0.0001,the same as below.AE:NLRP3、Ca s p a s e-1、G SD M D、I L-1、I L-18 m RNA相对转录水平A-E:The relative transcription levels of NLRP3,Caspase-l,GSDMD,IL-1,IL-18 mRNA图3qRT-PCR检测OMV对羊中性粒细胞NLRP3炎性小体相关基因转录水平的影响Fig.3The effect of OMV on the transcription level of NLRP3inflammasome related genes in sheep neutrophils by qRT-PCR2.4OMV对羊中性粒细胞自噬相关基因转录水平影响的qRT-PCR检测结果通过qRT-PCR检测OMV刺激后不同时间羊中性粒细胞中自噬相关基因mTOR、Be c lin 1、M A P1LC 3B、P6 2 m RNA 的相对转录水平，分析FnOMV对羊中性粒细胞自噬的影响。结果显示，与对照组相比，自噬相关基因mTOR、Beclin 1、M A P1LC 3B、P6 2 m RNA 的相对转录水平均显著或极显著升高(P0.05、P 0.0 1、P 0.0 0 1、P0.0001)，呈先升高后下降的趋势(图4)。表明FnOMV可在基因水平上启动羊中性粒细胞自噬。A250072000-1500-1000-500-0-Mock 24B15710-50Mocki246Time/hourD2015-dI-TIJo105-Mock1246Time/hournnsB*Time/hourC250200150-nsnsns200-150-100-50-Mocki24Time/hourD250-*200-150-100-10050-50-00Mock246Time/hourAD：m T O R、Be c lin 1、M A PI LC 3B、P6 2 m RNA 相对转录水平A-D:The relative transcription levels of mTOR,Beclin 1,图4qRT-PCR检测OMV对羊中性粒细胞自噬相关基因转录水平Fig.4 The effect of OMV on the transcription level of autophagyrelated genes in sheep neutrophils by qRT-PCR3 讨 论目前，细菌OMV提取方法主要包括EDTA法、EDTA-去污剂法7 、超滤浓缩法、Optiprep密度梯度离心法等18 ，EDTA法提取的OMV能够保留外膜蛋白(OMP)的天然构像，同时也保留了大部分脂多糖(LPS)，毒性较高，限制了OMV的应用；EDTA-去污剂法提取的OMV去除了大部分的LPS，毒性较低，但去污剂可能会改变OMP的天然构像，使其免疫原性降低；超滤浓缩法提取的OMV要经过超滤管的多次浓缩，因此OMV中会存在许多细胞碎片。根据本实验室前期开展的Fn OMV的提取鉴定及蛋白组分研究结果，本研究所采用的OMV提取方法为Op-tiprep密度梯度离心法，直接从菌液离心上清液中提取，是Fn在自然生长中向外周环境分泌的OMV，提取过程简单方便，且OMV中的蛋白也属于自然构像，该提取方法提取的OMV能够在最大程度上保证*Mock1246Time/hourMAP1LC3B,P62 mRNA的影响第12 期毕栏，等.坏死杆菌外膜囊泡诱导羊中性粒细胞自噬和NLRP3炎性小体的研究1277OMV中蛋白的最大活性。NLRP3是炎性小体的关键组成部分19。淋病奈瑟氏球菌OMV、尿路致病性大肠杆菌OMV、铜绿假单胞菌OMV均可激活NLRP3炎性小体2 0 ，但FnOMV能否激活先天免疫细胞中性粒细胞中NLRP3炎性小体尚无报道，因此本研究通过检测NLRP3炎性小体及下游相关基因的转录水平，初步探究FnOMV在羊中性粒细胞炎性小体激活中的作用。结果显示，用5g/mL的FnOMV刺激羊中性粒细胞2 h时，NLRP3、Ca s p a s e-1、IL-1、IL-18 mRNA 的相对转录水平均显著或极显著上调，表明Fn的OMV可对羊中性粒细胞NLRP3炎性小体的激活发挥作用。GSDMD是细胞焦亡的执行者，在被活化的Cas-pase-1或Caspase-11切割后，其N端能在细胞膜上形成孔洞，引起包括IL-1、I L-18 在内的炎性因子的释放，从而导致细胞焦亡的发生2 1。有文章表明在胞浆中LPS的作用下，Caspase-11能够被激活，并且Caspase-11在经典NLRP3炎性小体的上游发挥作用2 1。本研究中5g/mL的FnOMV刺激羊中性粒细胞后GSDMD mRNA的相对转录水平在刺激1 h时极显著升高，其原因可能是OMV首先激活了Caspase-11非经典炎性小体信号通路的结果，导致Caspase-11直接切割GSDMD诱导细胞焦亡。随后活化的Caspase-11激活下游的NLRP3炎性小体介导炎性细胞因子IL-1、I L-18 的分泌。细胞自噬主要包括自噬的启动，自噬小体形成，自噬小体与溶酶体融合形成吞噬溶酶体等几个过程。关于自噬的启动目前研究较好的是雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途径和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)途径，哺乳动物mTOR是负调控真核生物细胞自噬的靶点，可阻止细胞自噬的激活，由于mTOR处于整个自噬过程的起点，因此细胞内的很多通路能够影响mTOR的活性，如AMPK信号通路。有研究表明鼠伤寒沙门氏菌的OMV可通过AMPK途径启动细胞自噬2 。本研究中5 g/mL的Fn OMV刺激羊中性粒细胞后mTORmRNA的相对转录水平极显著上调，表明OMV抑制自噬的启动，但是VPS34复合物中的Beclin1mRNA相对转录水平显著上调，表明自噬已启动，这种现象的出现可能是AMPK激活或其他途径激活所导致的。本研究发现FnOMV可以上调自噬相关基因和NLRP3炎性小体相关基因的转录水平。有研究发现细胞自噬的发生较为迅速，如在饥饿条件下，自噬小体在约10 min出现，约1h达到高峰，半衰期约为0.5 h，自噬小体向自噬溶酶体转变需要7 min8 m i n 2 3。本研究发现FnOMV刺激羊中性粒细胞1h时MAP1LC3B mRNA相对转录水平最高，P62 mRNA相对转录水平最低，但均显著高于对照组，表明FnOMV能够引起羊中性粒细胞自噬小体形成；随着刺激时间的延长P62 mRMA相对转录水平逐渐升高，表明P62持续在羊中性粒细胞中积累使得自噬小体不能与溶酶体融合形成自噬溶酶体。在Fn OMV刺激羊中性粒细胞2 h时，MAP1LC3BmRNA相对转录水平最低，P62mRNA相对转录水平最高，NLRP3炎性小体相关基因NLRP3、Ca s p a s e-1、IL-1、IL-18mRNA相对转录水平显著升高，表明在OMV刺激2 h时自噬小体数量最少，自噬发生程度最低，NLRP3炎性小体激活最强，表明FnOMV诱导羊中性粒细胞自噬小体的形成先于NLRP3炎性小体的激活，且NLRP3炎性小体的激活降低了自噬小体的形成水平。在OMV刺激羊中性粒细胞4h和6 h后，NLRP3炎性小体下游基因Caspase-1和GSDMD mRNA的相对转录水平未显著升高，其原因可能是细胞发生了凋亡或坏死。综上所述，本研究首次证实5g/mL的FnOMV刺激羊中性粒细胞2 h可以激活NLRP3炎性小体；5g/mL的Fn OMV可以在基因水平上启动羊中性粒细胞自噬并形成自噬小体，且自噬小体的形成先于NLRP3炎性小体激活，为Fn致病机制的研究提供参考依据。参考文献：1】孟祥玉，佟盼盼，冯二凯，等.梅花鹿致病性源坏死梭杆菌的分离与鉴定J.中国预防兽医学报，2 0 18，40(4)：353-356.2郭东华，王君伟，孙玉国，等.牛腐蹄病坏死梭杆菌H05菌株白细胞毒素基因的原核表达及其免疫活性分析 .中国预防兽医学报，2 0 0 7，2 9(6)：435-438.3 TADEPALLI S,STEWART G C,NAGARAJA T G,et al.Leukotoxin operon and differential expressions of the leukotoxingene in bovine Fusobacterium necrophorum subspecies J.Anaerobe,2008,14(1):13-18.4 DE SMET K,CLAUS P E,ALLIET G,et al.Lemierres syn-drome:a case study with a short review of literature J.Acta1278中国预防兽医学报2023年Clin Belg,2019,74(3):206-210.5 TADEPALLI 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