基于网络药理学、分子对接及实验验证探讨黄芩抗胃癌的作用机制.pdf

书书书基金项目：陕西省自然科学基础研究计划项目（）作者简介：崔杨，女，生，博士，讲师，：收稿日期：基于网络药理学、分子对接及实验验证探讨黄芩抗胃癌的作用机制崔杨，王瑾，陈雨琪，张庆洋，周玉婷（陕西中医药大学医学技术学院生物技术教研室，咸阳 ；陕西中医药大学附属医院检验科；通讯作者，：）摘要：目的基于网络药理学、分子对接和细胞实验探讨黄芩治疗胃癌的活性成分及潜在作用机制。方法通过中药系统药理学数据库与分析平台（）获得黄芩的主要活性成分及其作用靶点；在 数据库、在线人类孟德尔遗传数据库（）、治疗靶点数据库（）、数据库中获取胃癌疾病相关靶点；利用 平台及 软件构建黄芩 胃癌交集靶点的蛋白质 蛋白质相互作用网络（），并获得核心靶点；借助 平台对黄芩 胃癌交集靶点进行基因本体（）富集分析以及京都基因和基因组百科全书（）富集分析；利用 软件进行分子对接验证，并用 软件对结果进行可视化处理。用不同浓度的黄芩提取物（，）分别处理胃癌细胞 和 或 后，通过 检测细胞活力并计算黄芩提取物对胃癌细胞的 。细胞分为对照组（）和黄芩组（）进行划痕实验，于，记录细胞迁移。用黄芩提取物（，）处理 细胞 ，通过蛋白免疫印迹实验检测相关蛋白表达。结果网络药理学结果表明，黄芩治疗胃癌的主要活性成分为汉黄芩素、黄芩素、金合欢素、苏荠苎黄酮、千层纸素 ，核心作用靶点为 、。黄芩治疗胃癌涉及的主要生物过程（）有细胞死亡的正调控、凋亡信号通路、化学应激反应等，涉及的 通路主要包括 、信号通路。实验结果显示，与 相比，不同浓度黄芩能够抑制胃癌细胞 和 的生长增殖（），且呈浓度依赖性。细胞划痕实验表明，与对照组相比，黄芩组 细胞的迁移率下降（）。蛋白免疫印迹实验结果显示，与 组相比，黄芩组 蛋白的相对磷酸化水平降低（）；，黄芩组中 蛋白的表达水平升高（）。结论黄芩抗胃癌具有多成分、多靶点、多通路的特点，为黄芩在临床中的应用提供了理论依据。关键词：黄芩；胃癌；网络药理学；分子对接；中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，（，；，；，：）：，（），（），（，），（）（），（，），（），山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 ，（）（），（），（），：；胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，年胃癌的全球发病率和死亡率分别为第五（）和第四（）。尽管我国胃癌发病率和死亡率呈逐年下降趋势，但目前依然高于全球平均水平，严重威胁着人们的生命健康 。由于早期胃癌缺乏特异性的临床症状，检出率较低，导致多数患者在确诊时已处于中晚期。对于中晚期胃癌的治疗，主要以手术、化疗、放疗及靶向治疗为主。但是无论是放化疗还是靶向治疗，都具有一定的毒副作用，治疗效果不佳，患者预后较差。近年来的临床实践表明结合中医药治疗胃癌具有一定的优势，在防治癌前病变、防止并发症、加速术后康复、防止复发转移、放化疗增效减毒、改善生存质量等方面有着明显的效果 。因此，中药抗胃癌的作用受到了越来越多的重视，寻找并开发更多高效低毒的天然中医药物已成为胃癌药物研发的趋势之一。黄芩是唇形科黄芩属多年生草本植物，是一种常见的传统中药。黄芩的主要活性成分是黄酮类化合物及其糖苷 。药用价值及含量较高的有黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、千层纸素 等 。近些年黄芩在防治肿瘤方面的作用也受到了关注，黄芩中的主要活性成分在抗肿瘤方面均有显著作用，具有抗炎，抗氧化，抗病毒，调节多种肿瘤细胞的增殖、凋亡、运动、侵袭和血管生成等功能 ，。已有文献报道指出黄芩提取物 及其有效成分黄芩素 、汉黄芩素 、黄芩苷 等能够抑制胃癌细胞的增殖，诱导胃癌细胞的凋亡，发挥抗胃癌作用。但由于中药具有多成分、多靶点、多通路协同作用的特点 ，目前对于黄芩抗胃癌的分子作用机制还没有系统深入的研究。网络药理学，是一种基于高通量组学数据分析和网络数据库检索的系统生物学与多向药理学相结合的新兴学科 ，旨在通过大数据分析，系统地整合“药物活性成分 疾病靶点 通路”的复杂网络关系，从整体反映药物对疾病的作用机制，为中药分子药理学研究提供新思路 。分子对接技术能够预测药物活性分子与受体蛋白间的相互作用模式和亲和力。因此，本研究将在网络药理学和分子对接研究的基础上，从整体角度探讨黄芩抗胃癌作用的主要活性成分、靶基因和作用通路，并通过体外细胞实验对筛选结果进行初步验证，为黄芩抗胃癌的临床应用提供一定的理论支持。材料与方法 黄芩化学成分及作用靶点信息的获取利用中医药系统药理学平台（数据库）获取黄芩的化学成分，以口服利用度（，），类药性（，）为筛选条件，对活性成分进行初步筛选，获得活性化合物及其作用的蛋白质靶点。通过 蛋白质数据库（：?）将化合物作用的蛋白质靶点名称规范化。胃癌疾病靶点的获取以“”“”“”等与胃癌相关的疾病为关键词，在 数 据 库（：?）、数据库（：?）、数据库（：?）以及 数据库（：?）中寻找胃癌疾病靶点。合并 个疾病数据库靶点后，删除重复得到胃癌疾病靶点。黄芩和胃癌交集蛋白靶点的 网络构建利用 语言将黄芩作用靶点和胃癌疾病靶点取交 集 并 绘 制 韦 恩 图。将 交 集 靶 点 提 交 至 数据库（：?）中，生物种类设定为“”，最小互相作用阈值设定为“”（），其余设置均为默认值，构建蛋白相互作用（）网络模型，并通过 ，软件，选择 功能，并根据度值（）大小排列靶点，并得到核心靶点。“黄芩活性成分 黄芩胃癌交集靶点”的网络构建制作黄芩活性成分与黄芩胃癌交集靶点相互作用关系（）及节点属性（）文件，提交到 软件中构建“黄芩活性成分 黄芩胃癌交集靶点”网络图，并根据度值判断黄芩抗胃癌的主要活性成分。基因本体（，）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（，）通路富集分析将黄芩与胃癌的交集靶点录入 平台（：?），设置 ，对生物学过程与通路进行动态富集分析，用 语言对结果进行可视化，绘制 功能富集分析图和 通路富集图。分子对接在 数据库（：?）中下载 网络中度值前五的靶点蛋白的三维结构，在 数据库（：?）中下载“黄芩活性成分 黄芩胃癌交集靶点”网络中度值前五的黄芩活性成分的三维结构。应用 软件进行分子对接，计算黄芩活性成分与靶点蛋白的结合强度。再利用 软件将对接结果进行可视化处理。体外实验验证 细胞、试剂及仪器人胃癌细胞株 、（上海中科院细胞库），培养液、胎牛血清（美国 公司），、（美国 公司），细胞裂解液、蛋白定量试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所），膜（德国 公司），、抗体（美国 公司），辣根过氧化酶标记二抗（美国 公司），黄芩提取物（西安飞达生物技术有限公司）。恒温培养箱、超净工作台（美国 公司），倒置显微镜（日本 公司），高速离心机、酶标仪（德国 公司），电泳仪、电转仪（美国 公司）。细胞培养 野生型胃癌细胞 和 突变型胃癌细胞 在含 胎牛血清、青霉素、链霉素的 培养液中，的培养箱中常规培养，隔天换液。检测细胞活力分别将处于对数生长期的 和 细胞用胰酶消化并计数，以 孔的浓度接种在 孔板中，培养 后，弃去培养基，更换含黄芩提取物培养基，浓度依次为 ，每个浓度设置个复孔。继续培养 或 后，弃含药培养基，每孔加入 检测液 ，在培养箱中继续孵育 后，用酶标仪检测 处的 值。细胞划痕实验检测胃癌细胞迁移能力将 细胞以 孔的浓度接种到 孔板中，过夜培养，待细胞铺满后，用灭菌枪头垂直于培养板划直线，用 清洗细胞 次后，加入对照（）和含黄芩提取物（）的无血清培养基培养。利用倒置显微镜拍照，测量 ，时，同一视野下细胞划痕的距离。相对划痕愈合率（划痕后 距离 划痕后相应时间点的距离）划痕后 距离 。蛋白免疫印迹实验检测 、蛋白表达将 细胞以 孔的浓度接种到 孔板中，过夜培养后，更换含黄芩提取物培养基，浓度为 ，培养 后，弃培养基，加入细胞裂解液提取细胞总蛋白，并用 试剂盒进行蛋白定量。蛋白样本与上样缓冲液混合后，煮沸 。以 孔蛋白样品的浓度上样，进行 电泳、转膜、封闭后，分别用 ，一抗（稀释）室温孵育 ，洗涤后加入二抗（稀释），室温孵育 ，洗涤后加超敏化学发光液，显影，并用 分析条带灰度值。统计学方法采用 软件进行数据分析，实验结果用均数 标准差（珋 ）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 法，表示差异具有统计学意义。结果 黄芩活性成分及作用靶点的获取利用 数据库，以 ，两个指标进行筛选，共收集到黄芩活性成分 个（见表 ）。黄芩活性成分对应的潜在作用靶点共 个（见图 ）。山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期表 数据库中筛选出的 种黄芩活性成分 编号化合物名称 山姜素 二氢黄芩素 去甲汉黄芩素 黄芩素 ，二十碳二烯酸甲酯 汉黄芩素 二氢木蝴蝶素 千层纸素 金合欢素 （）表儿茶素 红花素 黄烷酮 ，四羟基黄酮 苏荠苎黄酮 ，三羟基 甲氧基黄烷酮 羟基汉黄芩素 甲氧基柚皮素 黄芩黄酮 粘毛黄芩素 三裂鼠尾草素 邻苯二甲酸二（乙基己基）酯 ，二羟基 ，三甲氧基黄酮 黄芩黄酮 邻苯二甲酸二异辛酯 黄芩黄酮 黄芩新素 ，四羟基 ，二甲氧基黄酮 谷甾醇 谷甾醇 豆甾醇 表小檗碱 黄连碱 绿色圆形节点为黄芩活性成分，蓝色方形节点为黄芩潜在作用靶点图 黄芩活性成分 潜在作用靶点网络分析图 ，胃癌疾病相关靶点的获取从 、数据库分别获取胃癌疾病相关靶点 ，个，其中 数 据 库 选 取 的 靶 点 为 相 关 性 评 分（）的靶点。合并 个数据库靶点去除重复后，共得到胃癌相关靶点 个。黄芩活性成分 胃癌交集靶点 网络的构建将筛选的黄芩活性成分靶点与胃癌异常疾病靶点取交集，通过 语言绘制韦恩图，得到黄芩 胃癌交集靶点共 个（见图 ）。将 个共同靶点提交到 数据库，得到黄芩 胃癌靶点蛋白质相互作用网络（），节点数（靶点蛋白）个，边数（蛋白间相互作用）条，随后将 平台得到的蛋白相互作用数据导入 软件，选择 功能，得到 网络模型（见图 ），根据度值将蛋白靶点从大到小排列，度值前 的核心靶点依次为 （度值 ）、（度值 ）、（度值 ）、（度值 ）、（度值 ）。图 黄芩靶点 胃癌靶点韦恩图 “黄芩活性成分 黄芩胃癌交集靶点”的网络构建利用 软件构建黄芩活性成分 黄芩胃癌交集靶点网络（见图 ），根据度值排名筛选黄芩抗胃癌核心成分，发现排名前五的核心成分为汉黄芩素（，度值 ）、黄芩素（，度值 ）、金合欢素（，度值 ）、苏荠苎黄酮（，度值 ）、千层纸素 （，度值 ）。功能富集分析和 通路富集分析在 数据库中对蛋白靶点进行 功能富集分析和 通路富集分析，利用 软件，根据 值和基因数对结果进行可视化（见图 ，）。将交集靶点按度值从大到小排列，圆形面积越大，颜色越深，代表度值越大；连线颜色越深，代表两个基因之间关联性越大图 黄芩 胃癌交集靶点 网络图 圆形节点代表黄芩活性成分，方形节点代表黄芩胃癌交集靶点，节点与节点之间的边代表黄芩活性成分与交集靶点的相互作用，度值即边数图 黄芩活性成分 黄芩胃癌交集靶点网络图 山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期纵轴每一类 功能富集分析的条目从上到下按照 值从小到大的顺序排列图 黄芩抗胃癌作用靶点的 功能富集分析 从 功能富集分析结果可知，黄芩抗胃癌参与的生物过程（，）主要集中在细胞死亡的正调控、凋亡信号通路、细胞化学应激反应、紫外线应激反应、血管生成、代谢过程等。细胞组分（，）主要涉及周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合体、转录调控复合体、膜筏、胞质囊腔、细胞器外膜等。分子功能（，）主要包括转录因子结合、核受体活度、蛋白激酶结合、血红素结合、蛋白激酶活性、蛋白酶结合等。信号通路富集结果显示，黄芩通过 条汇总通路（）发挥作用。通过构建靶点 通路网络图，发现每条通路涉及多个靶点，每个靶点参与多条通路（见图 ）。排除广泛通路后，显示黄芩主要通过癌症相关通路、信号通路、癌症相关蛋白聚糖、信号通路、内分泌抵抗、癌症中的转录失调、信号通路、信号通路、信号通路等发挥抗胃癌作用。，图 黄芩抗胃癌作用靶点的 通路富集分析 蓝色方形节点代表黄芩抗胃癌作用靶点，紫色三角形节点代表 富集通路图 黄芩抗胃癌作用靶点 通路网络图 山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 分子对接取 网络中度值前五的蛋白靶点和“黄芩活性成分 黄芩胃癌交集靶点”网络中度值前五的黄芩活性成分在 软件中进行分子对接，对接结果见表 。结果显示前五的活性成分与核心蛋白靶点的结合能均低于 ，说明具有较好的亲和力。通过比较发现，黄芩活性成分与 、以及 的结合能力较强，结合能主要在 左右，如汉黄芩素与 ，黄芩素与 ，黄芩素与 ，苏荠苎黄酮与 ，黄芩素与 ，千层纸素 与 。而 和 与黄芩活性成分的结合能力相对较弱，主要在 到 左右。主要黄芩活性成分与靶点分子的可视化对接结果见图 。表 黄芩活性成分与靶点分子对接结果 活性成分与靶点的最低结合能（）汉黄芩素 黄芩素 金合欢素 苏荠苎黄酮 千层纸素 图 黄芩活性成分与靶点分子对接可视化结果 ，黄芩对胃癌细胞生长增殖及迁移的影响用黄芩提取物处理胃癌细胞 和 后，检测细胞活力，发现黄芩提取物能够抑制胃癌细胞的生长增殖，且呈浓度依赖性（，见图 ）。在 时，黄芩提取物对胃癌细胞 和 的 分别为 和 ；时分别为 和 。划痕实验结果显示黄芩提取物能够抑制胃癌细胞 的迁移（，见图 ）。同时点与 相比，图 黄芩提取物对胃癌细胞的生长抑制作用 图 黄芩提取物抑制 细胞的迁移 黄芩对 及 蛋白表达的影响蛋白免疫印迹实验结果显示，在 细胞中，与 相比，黄芩提取物能够降低 的磷酸化水平（，），和 黄芩提取物能够提高 的表达水平，且呈浓度依赖性（，见图 ）。与 黄芩组相比，图 黄芩提取物对 细胞中 及 蛋白表达的影响 山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 讨论本研究基于网络药理学方法筛选出黄芩抗胃癌的主要活性成分为汉黄芩素、黄芩素、金合欢素、苏荠苎黄酮、千层纸素 。研究显示，汉黄芩素可调节多个靶点，包括转录因子、生长因子、蛋白激酶和其他酶类，影响细胞凋亡、细胞周期、细胞自噬、免疫细胞浸润、氧化应激、内质网应激、糖酵解等进程，发挥抗癌作用，是一种潜在的抗癌药物 。已有报道说明在胃癌中汉黄芩素可通过下调 和 的表达 、阻碍 信号通路 、调节 和 的磷酸化 ，抑制胃癌细胞的生长增殖和代谢，逆转肿瘤耐药，介导细胞的亚硝化应激和自噬。与汉黄芩素作用类似，黄芩素也可通过多通路、多靶点调控肿瘤细胞的凋亡、细胞周期、转移、自噬和免疫逃逸，发挥抗癌作用 。在胃癌中，黄芩素主要通过抑制 相关通路，阻碍胃癌细胞生长和迁移 ，促进胃癌细胞的自噬和凋亡 ，增强胃癌细胞对化疗药物的敏感性 ，抑制胃癌细胞转移和血管生成 ，发挥其抗胃癌作用。金合欢素和千层纸素 也在多种恶性肿瘤中发挥治疗作用，但在胃癌中的报道较少，金合欢素可引起 升高及 级联反应诱导胃癌细胞凋亡 ，通过 通路抑制胃癌细胞侵袭转移及上皮间充质转化 。千层纸素 可通过抑制 调控的 介导的 期细胞周期阻滞抑制胃癌细胞生长 。而目前还未有关于苏荠苎黄酮抗癌的报道。以上研究说明黄芩活性成分在促进胃癌细胞自噬和凋亡，抑制肿瘤转移，诱导细胞周期阻滞，增强胃癌细胞对化疗药物的敏感性等方面发挥着重要的作用。经 网络筛选和分子对接验证我们得到 、是黄芩抗胃癌的主要作用靶点。靶点通路富集分析结果显示黄芩抗胃癌主要与 、等信号通路相关。（亦称 ）是一种丝氨酸 苏氨酸激酶，是 信号通路的核心分子，通过其下游多种靶分子如 、等发挥凋亡抑制作用。的失调与肿瘤细胞的增殖、凋亡抑制、糖代谢、脂代谢、血管生成等密切相关 。有文献报道汉黄芩素 、黄芩素 、金合欢素 均能通过抑制 通路阻碍肿瘤细胞的生长。是经典的抑癌基因，编码 蛋白，汉黄芩素 能够使 发生磷酸化和乙酰化，阻止 介导的 泛素化降解，进而提高 的稳定性和蛋白水平，阻碍肿瘤有氧糖酵解。有研究发现黄芩素 可作为 和 的天然抑制剂，提高 乙酰化水平，促进 的抗肿瘤作用。同时千层纸素 能够通过抑制 来降低 和 的磷酸化水平，调控 的乙酰化水平及稳定性，促进癌细胞 的 凋 亡。是 血 管 内 皮 生 长 因 子（）家族成员，是血管生成的重要因子，在许多肿瘤中高表达，与肿瘤分期和进展相关。有报道发现，黄芩素 和金合欢素 能够降低 的表达，但具体作用机制还不清楚。，即 ，是一种促癌基因，有研究发现黄芩素能够结合到 上，抑制 和 的表达，促进它们的酶解，从而抑制脐静脉内皮细胞的血管生成 。我们通过体外细胞实验进一步验证了网络药理学和分子对接的筛选结果。实验结果显示黄芩提取物具有抑制胃癌细胞增殖、迁移的作用，且 野生型细胞 的 较 突变型细胞 的 更低，即 野生型细胞 对黄芩的敏感性更高，说明 有可能是黄芩抗胃癌的作用靶点。同时，黄芩提取物干预 细胞后，的水平升高，的表达下降，进一步说明 和 是黄芩抗胃癌的潜在作用靶点。从网络药理学和细胞实验结果可知，黄芩抗胃癌的作用机制具有多成分、多靶点、多通路的特点，可能通过 、等核心靶点抑制胃癌细胞的生长增殖。这为后续黄芩抗胃癌的机制研究和临床应用提供了新思路和理论参考。但本研究也存在一定的局限性，如黄芩有效成分能否和靶点稳定结合，有效成分通过何种途径调控核心靶点的表达或活性，关键化合物之间是否存在协同作用等，这些问题还需要进一步的深入研究。参考文献：，：，（）：曹毛毛，李贺，孙殿钦，等 年中国胃癌流行病学趋势分析 中华消化外科杂志，（）：冯颖，吴成亚，李杰 中医药治疗胃癌的优势及可能机制研究进展 辽宁中医杂志，（）：，（）：，（）：，：，（）：孔邦彦，魏立彬，郭青龙 黄芩苷的抗肿瘤作用研究进展 药学学报，（）：，（）：，：，（）：，（）（），（）：，：，：，（）：世界中医药学会联合会 网络药理学评价方法指南 世界中医药，（）：，：，（）：，（），：，：，（）：，（）：乔丹，李英顺，邢健，等 黄芩素抑制磷脂酰肌醇 激酶 蛋白激酶 （）信号通路并诱导 细胞自噬 细胞与分子免疫学杂志，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，：，：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期