高加索三叶草种子内生细菌B7的分离鉴定及其促生特性.pdf

第 46 卷 第 1 期Vol.46 No.1 2024 年 1 月Jan.2024中 国 草 地 学 报Chinese Journal of Grassland高加索三叶草种子内生细菌 B7的分离鉴定及其促生特性郝璐1，刘嘉伟1，马一鸣1，王明玖1，2，*，唐芳1，3，曹克璠1，李舒宁1，张慧敏1（1.内蒙古农业大学草原与资源环境学院，内蒙古 呼和浩特 010011；2.国家草业技术创新中心（筹），内蒙古 呼和浩特 010070；3.草地资源教育部重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010011）摘要：采用传统的分离培养手段从高加索三叶草种子内分离筛选出内生细菌 B7，通过生理生化以及 16S rDNA进行分子鉴定，结果表明菌株 B7属于泛菌属（Pantoea sp.）。菌株 B7在 15%PEG6000干旱胁迫下能够正常生长，表现出较强的耐旱能力；在 pH 值 511范围内均能生长，有良好的耐酸碱能力；兼具产 IAA、分泌铁载体、固氮和溶磷能力，其中产 IAA 能力高达 0.28 g/L，溶解有机磷、无机磷和产铁载体的指数分别是 3.15、2.91和 2.63，速率分别为2.15、1.91和 1.63。菌株 B7具有良好的促生效果，显著提高了高加索三叶草的株高、地上鲜重、地下鲜重与干重、叶长、叶宽、叶片数、叶面积、根长、根投影面积、根表面积、根尖数，促进了高加索三叶草的生长发育。关键词：高加索三叶草；种子内生细菌；16S rDNA；泛菌属；促生特性中图分类号：S541.2 文献标志码：A 文章编号：1673-5021（2024）01-0108-09内生菌是一类定殖于植物组织内的微生物，与宿主形成紧密的共生关系，从宿主植物中获取营养与庇护，进而通过各种机制促进宿主植物生长12。种子是植物的重要器官和多种有益菌的载体，对植物繁殖后代和农业生产具有重要意义3。种子内生菌是种子内共生微生物群落，通过种子垂直传播，并适应于植物内部的共生生命周期，为幼苗的发育提供多种关键功能4。种子内生细菌通过合成植物生长 激 素（IAA）5或 1-氨 基 环 丙 烷-1-羧 酸 脱 氨 酶（ACC）6、固氮7、溶磷8和提高铁载体的利用性9等方式促进植物生长。种子内生细菌可作为微生物菌肥被应用于农业生产中，对植物生命周期的萌发、生长和繁殖阶段都至关重要4。在牧草种植中，利用内生菌与宿主植物互作也是一种促进植物生长有效的方法。因此，筛选高效促生的种子内生细菌作为生物菌肥不仅能够更好地利用内生菌资源，对提高宿主植物的生长性能和生产力也具有重要意义。高加索三叶草（Trifolium ambiguum M.Bieb.）是一种优质的多年生豆科车轴属牧草10，原产于高加索山地，分布在气候凉爽的地区，具有优良的抗旱、抗寒能力和极强的种子繁殖能力11。目前，国内外对高加索三叶草内生菌的研究主要集中在对其根瘤菌多样性的研究1213，对其种子内生细菌进行挖掘利用的研究较少。本研究首次从高加索三叶草种子内分离筛选出 1株内生细菌（编号为 B7），利用生理生化以及 16S rDNA 分子技术进行鉴定，并对其促生特性以及促生效果进行研究，以期为挖掘利用高效促生的高加索三叶草内生菌资源奠定基础。1材料与方法1.1材料1.1.1高加索三叶草种子及菌株高加索三叶草品种为蒙农三叶草 1 号，种子于2022 年 6 月 20 日在内蒙古农业大学牧草试验地采集。采用传统分离培养法从种子内部获得菌株，编号为 B7，并利用 YMA 和 LB 液体培养基将其制备成菌液 B7备用。1.2方法1.2.1菌株 B7的鉴定将菌株 B7 培养 2448 h，分别采用革兰氏染色法、KOH 拉丝、NaOH 拉丝试验进行初步鉴定，后进行硫化氢、接触酶、明胶液化、M.R.试验、V-P反应、过氧化氢酶反应测定（以空白为对照）14。菌株 B7的分子鉴定采用 16S rDNA 进行。利用细菌通用引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492R（5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3）对菌株 B7 进行 PCR 扩增15。将 PCR 产物进行测序，测序结果在 NCBI中进行 BLAST 比对，并利用DOI：10.16742/j.zgcdxb.20230140*通信作者，E-mail：wangmj_收稿日期：2023-05-13；修回日期：2023-06-28基金项目：国家自然科学基金项目“蒙农三叶草 1号 结瘤固氮机理及根瘤菌多样性研究”（31960353）；2023 国家草业技术创新中心（筹）重大创新平台建设专项基金“豆科牧草种子内生菌资源挖掘与利用”（CCPTZX2023K01）作者简介：郝璐（1996-），女，陕西榆林人，硕士研究生，主要从事草地资源生态与管理研究，E-mail：.108郝璐 刘嘉伟 马一鸣等 高加索三叶草种子内生细菌 B7的分离鉴定及其促生特性MEGA 7.0构建系统发育树。1.2.2抗逆性测定将菌株 B7 接种至梯度为 0（CK）、0.5%、1.0%、3.0%、5.0%、10.0%、15.0%、20.0%、30.0%的不同PEG6000 浓度液体培养基（25 mL）中（模拟干旱胁迫），28、180 r/min培养3 d，测其OD600值，4次重复。取菌株 B7 接种于 YMA 固体培养基，设置不同胁迫处理梯度，其中 NaCl 浓度分别为：0（CK）、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%；pH 值为 4、5、6、7（CK）、8、9、10、11；B3+浓 度 为 0（CK）、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%；Fe2+浓 度 为 0（CK）、0.1%、0.3%、0.6%、1.0%。每处理 4 次重复，倒置于 2528 培养室，5 d 后观察记录菌株 B7 的生长情况。1.2.3种子内生细菌促生性测定产 IAA 能力：标准曲线利用纯 3-IAA 制作。将菌株 B7 接种至含 100 mg/L 色氨酸的液体培养基上，28、180 r/min 培养 3 d 后，取 100 L 菌液 B7置于 96 孔板中，与 100 L 比色液（0.5 mol/L FeCl3 1 mL 与 35%HClO4 50 mL 混匀）混匀在黑暗中静置 30 min，用快速酶标仪测定 OD530值，根据吸光值计算分泌生长素的含量16。溶解磷能力：采用蒙金娜培养基和 PKO 培养基。分别用打孔器打孔，取 B7 菌液 50 L 加入孔中，先正置平板 3 d后倒置培养 5 d，观察培养基的透明圈，测量菌落和透明圈的直径，根据直径大小来判断菌株 B7的溶解磷能力1617。溶解指数=（孔直径+溶磷圈直径）/孔直径，溶解速率=溶磷圈直径/孔直径。产铁载体能力：采用 CAS固体培养基。分别用打孔器打孔，取 B7 菌液 50 L 加入孔中，先正置平板 3 d后倒置培养 5 d，观察培养基的黄色晕圈，测量菌落和黄色晕圈的直径，根据直径大小判断菌株 B7的产铁能力18。产铁指数=（孔直径+产铁圈直径）/孔直径，产铁速率=产铁圈直径/孔直径。固氮能力检测：将菌株 B7转代培养 1代后接种于阿须贝氏培养基19，28 恒温培养 7 d，观察菌株生长情况，有菌落生长表明具有固氮能力。1.2.4种子内生菌的促生潜力发芽试验：挑选有光泽、饱满的高加索三叶草种子，用 10%NaClO 浸泡 5 min，无菌水冲洗 8 次。将表面消毒后的种子以 B7菌液（OD600=1）和 CK（无菌水）分别浸种 1.0、2.5、4.0 h，每处理 30粒种子，3次重复。分别将种子晾干后整齐置于 2层滤纸的培养皿中萌发，25 明暗交替处理。4 d 后测定发芽势，10 d后测定发芽率，并用游标卡尺和天平随机测量 6株高加索三叶草幼苗的根长、茎叶长（从茎基部到顶叶的长度）、苗长（根长+茎叶长）、鲜重20。盆栽试验：将菌株 B7分别配置成 OD600值为 0.5和 1.0 的菌悬液备用。高加索三叶草长出真叶后，分别接种 OD600值为 0.5 和 1.0 的菌悬液，以不接种菌株的液体培养基为对照（CK），40 d后测其生长指标（株高、地上和地下部分鲜重与干重）、叶片指标（叶长、叶宽、叶片数以及叶面积）、根系指标（根长、根投影面积、根表面积、根尖数、根直径、根分支数），12次重复。期间每隔 3 d浇 1次霍格兰营养液。1.3数据分析采用SPSS 25.0对数据进行方差分析和Duncan s多重比较（P0.05），采用 MEGA 7.0、Excel 2016 和Origin 2019绘图。利用隶属函数法21对接种不同浓度B7菌株和未接种内生菌的高加索三叶草促生效果进行综合评价。2结果与分析2.1菌株 B7的鉴定经革兰氏染色、KOH 拉丝、NaOH 拉丝试验，确定菌株B7为革兰氏阴性菌。菌株B7的硫化氢试验、接触酶试验、过氧化氢酶试验、V-P 反应均呈阳性，明胶液化和 M.R.试验均呈阴性（表 1）。通过 16S rDNA分子鉴定表明，菌株B7与Pantoea agglomerans（NR041978.1）的相似性为 98.80%，根据 NCBI构建的系统发育树（图 1），菌株 B7为泛菌属（Pantoea sp.）细菌。表 1菌株 B7生理生化试验结果Table 1Physiological and biochemical test results of strain B7试验名称Test name革兰氏染色NaOH 拉丝试验KOH拉丝试验硫化氢试验V-P反应M.R.试验明胶液化试验过氧化氢酶试验接触酶试验试验现象Experimental phenomenon菌体呈粉红色有细丝有细丝纸条变黑菌株变红菌株变黄明胶未液化产生气泡有气泡产生结果Result-+-+注：“+表示阳性，“-”表示阴性。Note：“+”means positive，“-”means negative.109中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 1 期2.2菌株 B7的抗逆性从表 2 可以看出，菌株 B7 的耐旱能力较强，在15.0%PEG6000模拟的干旱胁迫下能够正常生长；具有良好的耐酸碱能力，在 pH 值 511的酸碱胁迫下均能够正常生长；在 5.0%NaCl 胁迫下，生长正常；在 0.02%0.10%的微量元素硼胁迫下长势良好；该菌株极不耐微量元素铁胁迫，在 0.1%浓度时长势差，在 0.3%1.0%浓度时不能生长。2.3菌株 B7的促生功能菌株 B7 在有机磷（蒙金娜）和无机磷（PKO）培养基上均能够产生透明的溶磷圈，表明其具有溶解磷的能力。菌株 B7 溶解有机磷指数、速率分别是3.15、2.15，溶 解 无 机 磷 指 数、速 率 分 别 是 2.91、1.91。菌株 B7在 CAS固体培养基上能够产生淡黄色透明晕圈，表明其具有产铁能力，产铁指数、速率分别是 2.63、1.63。菌株 B7 在固氮培养基上能够生长且生长良好，说明其具有固氮能力（图 2-A）。菌株 B7 在含色氨酸的液体培养基上能够变成粉红色，表明其具有产 IAA 能力，根据 3-IAA 标准曲线图（图 2-B），其分泌 IAA的浓度为 0.28 g/L。2.4菌株 B7对高加索三叶草发芽的影响从图3可看出，相同时间处理下不同浸种处理对高加索三叶草发芽指数、活力指数均无显著影响，对发芽势、发芽率、幼苗鲜重、根长、茎叶长、苗长有显著影响（P0.05）。与 CK相比，浸种 1 h和 4 h时，高加 索 三 叶 草 种 子 的 发 芽 势 显 著 降 低 了 36.92%、47.27%；浸种 2.5 h时，种子的发芽率、根长、苗长显著增加了 18.57%、54.85%、33.63%；浸种 4 h时，种子的发芽率、鲜重、根长、茎叶长、苗长显著增加了24.23%、24.00%、64.50%、41.62%、55.10%。相同浸种处理下不同时间处理对高加索三叶草发芽势、活力指数、茎叶长、根长、苗长均无显著影响，对发芽率、发芽指数、幼苗鲜重有显著影响（P0.05）。CKNR 041978.1:7-1418 Pantoea agglomerans strain DSM 3493 NR 114735.1:21-1432 Pantoea agglomerans strain NCTC9381 16S-B7.17848233 NR 114111.1:24-1434 Pantoea agglomerans strain NBRC 102470 NR 178694.1:2-1410 Pantoea pleuroti strain JZB 2120015 NR 115258.1:44-1454 Pantoea allii strain BD 390 NR 026045.1:2-1411 Pantoea ananatis strain 1846 NR 119362.1:24-1433 Pantoea ananatis strain LMG 2665 98%98%97%97%97%98%图 1菌株 B7的系统发育树Fig.1Phylogenetic tree of strain B7表 2菌株 B7的抗逆性测定Table 2Determination of resistance of strain B7菌株StrainB7菌株StrainB7生长状况The growth statusPEG6000浓度（%）PEG6000 concentration（%）0+生长状况The growth statuspH值pH value4-0.5+5+1.0+6+3.0+7+5.0+8+10.0+-9+-15.0+-10+-20.0-11+-30.0-微量元素浓度（%）Trace element concentration（%）硼 B3+0+NaCl浓度（%）NaCl concentration（%）0+0.02+0.5+0.04+1.0+0.06+1.5+0.08+2.0+0.10+2.5+铁 Fe2+0+3.0+0.1+-3.5+0.3-4.0+0.6-4.50+1.0-5.0+注：“+”代表正常生长，“+”表示生长良好，“+-”表示生长略差，“-”代表不能生长。Note：“+”means normal growth，“+”means good growth，“+-”means slightly poor growth，and“-”means no growth.110郝璐 刘嘉伟 马一鸣等 高加索三叶草种子内生细菌 B7的分离鉴定及其促生特性浸种 2.5 h、4 h处理较 1 h处理的发芽指数显著提高了 14.68%、14.16%。B7菌液浸种 4 h处理较 1 h处理 的 发 芽 率、幼 苗 鲜 重 显 著 提 高 了 19.59%、27.05%；随着浸种时间的增加，B7菌液处理下种子发芽率、幼苗鲜重呈递增的趋势。2.5菌株 B7对高加索三叶草生长的影响2.5.1菌株 B7对生长指标的影响接种高浓度的菌株 B7 对高加索三叶草生长指标的促生效果优于低浓度与不接种处理。与 CK 相比，接种高浓度的菌株 B7 对高加索三叶草的株高、地上鲜重、地下鲜重与干重影响显著（P0.05），使其显著提高了64.58%、126.19%、75.61%、106.43%（图4）。2.5.2菌株 B7对叶片指标的影响接种高浓度的菌株 B7 对高加索三叶草叶片指标的促生效果优于低浓度与不接种处理。从图 5可看出，与 CK相比，接种高浓度的菌株 B7对高加索三叶草的叶长、叶宽、叶片数以及叶面积影响显著，使其显著提高了 46.07%、59.62%、17.50%、114.16%（P0.05）。2.5.3菌株 B7对根系指标的影响接种高浓度的菌株 B7 对高加索三叶草根系指标的促生效果优于低浓度与不接种处理。从图 6可看出，与 CK 相比，接种高浓度的菌株 B7 对高加索三叶草的根长、根投影面积、根表面积以及根尖数影 响 显 著，使 其 显 著 提 高 了 71.03%、105.55%、105.55%、103.59%（P0.05）；与 CK 相比，接种高浓度的菌株 B7 对高加索三叶草的根直径和根分支数影响不显著。2.5.4综合评价为了探究接种不同浓度 B7菌液及不接种（CK）对高加索三叶草的促生效果（盆栽试验），通过隶属函数法分别计算了高加索三叶草 15 个指标相对值的隶属函数值，并进行促生性综合评价。结果表明，不接种、接种低浓度菌株 B7、接种高浓度菌株B7的隶属度平均值分别为 0.07、0.18、0.96，从大到小排序为接种高浓度菌株 B7、接种低浓度菌株 B7、不接种（表 3）。3讨论种子内生菌是建立植物内生菌群的基础，能为宿主植物的生长发育和植物保护提供诸多益处2。种子内生菌不仅可以通过分泌和诱导产生植物生长调节物质、溶解土壤中的磷及合成并分泌铁载体等直接对植物生长发育产生促进作用22，还可以通过提高植物对环境胁迫的抗性2326、产生生物固氮 B A X=0.0908Y+0.1642R=0.942500.10.20.30.40.50.60.70.80.050.10.150.20.25OD530值OD530 valueIAA浓度（g/L）IAA concentration（g/L）A：菌株 B7的溶磷性、产铁性、固氮性；B：菌株 B7的产 IAA能力及 3-IAA标准曲线图。A：Phosphorus solubility，iron production，and nitrogen fixation by strain B7；B：IAA-producing capacity of strain B7 and 3-IAA standard curve plot.图 2菌株 B7的促生特性Fig.2Probiotic properties of strain B7111中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 1 期作用27或提高对植物病原微生物的拮抗作用28等来间接促进植物生长29。目前，常见的植物种子内生菌大多属于芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、泛菌属（Pantoea）、伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）、肠杆菌属（Enterobacteria）、CKB7-0.5B7-10 1 2 3 4 5 6b b a 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 地上 Aboveground 地上 Aboveground 地下 Underground 地下 Underground a b b b a 0 0.004 0.008 0.012 0.016aa ab b b b b 株高（cm）Plant height（cm）鲜重（g/株）Fresh weight（g/plant）干重（g/株）Fresh weight（g/plant）接种处理Inoculation treatmentsCKB7-0.5B7-1接种处理Inoculation treatments CKB7-0.5B7-1接种处理Inoculation treatments图中不同处理内小写字母不同表示不同接种处理间差异显著（P0.05），下同。Non-repetition of lowercase letters within different treatments in the graph indicates significant differences between inoculation treatments（P0.05）.The same as below.图 4不同浓度菌液 B7处理对生长指标的影响Fig.4Effect of different concentrations of bacterial solution B7 treatment on growth indexAaBaAaAaAaBa00.20.40.60.81CKB7发芽势（%）Germination potential（%）发芽率（%）Germination rate（%）幼苗鲜重（g）Seedling fresh weight（g）茎叶长（mm）Stem and leaf length（mm）苗长（mm）Seedling length（mm）幼苗根长（mm）Seedling root length（mm）发芽指数Germination index活力指数Vitality index浸种处理Soaking treatments浸种处理Soaking treatments浸种处理Soaking treatments浸种处理Soaking treatments浸种处理Soaking treatments浸种处理Soaking treatments浸种处理Soaking treatments浸种处理Soaking treatments1 h2.5 h4 hAaAbBaAabBaAa00.20.40.60.81CKB7AbAaAaAaAaAa01530456075CKB7AaAaAaAaAaAa00.40.81.21.62CKB7AaAbAaAabBaAa00.010.020.030.04CKB7AaAaBaAaBaAa010203040CKB7AaAaAaAaBaAa05101520CKB7AaAaBaAaBaAa0102030405060CKB7图中柱形标注不同大写字母表示相同时间处理下不同浸种处理间的差异显著（P0.05），不同小写字母表示相同浸种处理下不同时间处理间的差异显著（P0.05）。The bars in the graph are labeled with different capital letters indicating significant differences between different seed dipping treatments under the same time treatment（P0.05）and different lower case letters indicating significant differences between different time treatments under the same seed dipping treatment（P0.05）.图 3菌液 B7对种子萌发指标的影响Fig.3Effect of bacterial solution B7 on seed germination index112郝璐 刘嘉伟 马一鸣等 高加索三叶草种子内生细菌 B7的分离鉴定及其促生特性短 小 杆 菌 属（Curtobacterium）、克 雷 伯 氏 菌 属（Klebsiella）等3031。本研究从高加索三叶草种子内分离鉴定出 1 株兼具产 IAA 能力、溶解磷能力、产铁能力、固氮能力等促生特性的种子内生菌，经鉴定为泛菌属。向益青等32发现黄连（Coptis chinensis）种子也内存在泛菌属细菌。焦诗雨等33 从羽毛针禾（Stipagrostis pennata）种子中分离出的泛菌属 Z1具有溶磷、产铁载体、分泌 IAA 和固氮等功能，且对小麦幼苗有显著促生效果，尤其是对株高促生作用最明显；刘佳等34从水稻（Oryza sativa）种子中发现成团泛菌 HAUM1 具有溶磷、分泌 IAA 能力，且对水稻的株高、根长、鲜重、干重等指标方面具有显著的促生优势；本研究结果与上述研究结果相似。本研究采用泛菌属菌株 B7浸种高加索三叶草，发现其对高加索三叶草种子的发芽率有显著促进作用，与石志棉35研究结果类似。面对各种环境胁迫，筛选具有抗逆性的菌株有助于协助植物抵抗外界胁迫，从而健康生长。本研究对菌株 B7的抗逆性只进行了初步的鉴别，发现其具有良好的耐旱、耐酸碱以及耐微量元素硼能力，0 2 4 6 8 10 12 b b a 0 3 6 9 b b a 0 2 4 6 8 b ab a 00.20.40.6 0.8b b a CKB7-0.5B7-1接种处理Inoculation treatmentsCKB7-0.5B7-1接种处理Inoculation treatmentsCKB7-0.5B7-1接种处理Inoculation treatmentsCKB7-0.5B7-1接种处理Inoculation treatments叶长（mm）Leaf length（mm）叶片数Leaf number叶宽（mm）Leaf width（mm）叶面积（cm2）Leaf area（cm2）图 5不同浓度菌液 B7处理对叶片指标的影响Fig.5Effect of different concentrations of bacterial solution B7 treatment on leaf indexes 040 80 120 160 200 b ba 0 20 40 60 80 100b b a 040 120 160 80 200 240 280b b a 0 2 4 6 8 10 a a a 0 40 80 120 160 200 b b a 051015 20 25 ab b a 根长（mm）Root length（mm）根直径（mm）Root diameter（mm）根尖数Number of root tips根分支数Number of root branches根投影面积（mm2）Root projection area（mm2）根表面积（mm2）Root surface area（mm2）CKB7-0.5B7-1接种处理Inoculation treatmentsCKB7-0.5B7-1接种处理Inoculation treatmentsCKB7-0.5B7-1接种处理Inoculation treatmentsCKB7-0.5B7-1接种处理Inoculation treatmentsCKB7-0.5B7-1接种处理Inoculation treatmentsCKB7-0.5B7-1接种处理Inoculation treatments图 6不同浓度菌液 B7处理对根系指标的影响Fig.6Effect of different concentrations of bacterial solution B7 treatment on root system index113中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 1 期后续仍然需要通过盆栽试验验证以及综合分析其实际的抗逆能力。4结论本研究从高加索三叶草种子内分离得到内生细菌 B7，经鉴定，该菌株属于泛菌属。其抗逆性强，且能够促进高加索三叶草种子萌发和生长发育。因此，菌株 B7可作为高加索三叶草专用微生物改良制剂的菌种资源。参考文献（References）：1 柴加丽，姚拓.高寒草甸多枝黄耆根际促生菌特性研究与鉴定 J.中国草地学报，2022，44（10）：68-74.CHAI Jiali，YAO Tuo.Characteristics and identification of plant growth promoting rhizobacteria of Astragalus polycladus in alpine meadowJ.Chinese Journal of Grassland，2022，44（10）：68-74.2 陈柯璇，李海燕.植物种子内生菌及其应用前景的研究进展 J.中国野生植物资源，2021，40（11）：40-44.CHEN Kexuan，LI Haiyan.Research progress of seed endophytes and their application prospectJ.Chinese Wild Plant Resources，2021，40（11）：40-44.3 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