高效液相色谱-紫外检测法同时测定类鼻疽患者血浆中亚胺培南、美罗培南和头孢他啶的浓度.pdf

中国药物应用与监测 2024 年2月 第21卷第1期 Chin J Drug Appl&Monit，Feb 2024,Vol.21,No.1 34 高效液相色谱-紫外检测法同时测定类鼻疽患者 血浆中亚胺培南、美罗培南和头孢他啶的浓度符香香1，钟莉莉2，陈 君2，柴 芳3，云 雄2，吴 华4，王 敏21海南医学院药学院，海口 571199；2海南省人民医院（海南医学院附属海南医院）药学部，海口 570311；3三亚市人民医院药学部，三亚 572000；4海南省人民医院（海南医学院附属海南医院）检验科，海口 570311通信作者：王敏，Email:摘要目的 建立一种快速、经济的高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV），用于同时测定人血浆中亚胺培南、美罗培南和头孢他啶的药物浓度。方法 采用Millipore 10KD超滤离心去蛋白，使用互为内标法，色谱柱为SunFire-C18柱（4.6 mm250 mm，5 m）；预柱为 C18柱（4.0 mm2.1 mm，5 m），流动相为0.1 molL-1的3-（N-吗啡啉）丙磺酸（pH=7.0）和乙腈，梯度洗脱，检测波长299 nm，流速1.0 mLmin-1，运行时间30 min，进样体积30 L。结果 亚胺培南、美罗培南和头孢他啶的保留时间分别为6.699 min、10.795 min和8.722 min。血浆内源性物质对样品的测定无干扰，峰形良好。该方法具有良好的线性、准确度和精密度。不同浓度的样品在 20 反复冻融、20 长期冷冻和4 （48 h）下均表现出了较高的稳定性。结论 该方法操作成本低、专属性强、分离效果好，可用于类鼻疽患者血浆中亚胺培南、美罗培南和头孢他啶治疗药物浓度的测定。关键词类鼻疽；亚胺培南；美罗培南；头孢他啶；高效液相色谱-紫外检测法基金项目 三亚市高校及医疗机构专项科技计划项目（2021 GXYL14）；海 南 省 重 点 研 发 计 划 项 目（ZDYF2022SHFZ050、ZDYF 2019141）；海南省自然科学基金面上项目（821MS130）；海南省卫生健康行业科研项目（22A200229）DOI 10.3969/j.issn.1672-8157.2024.01.009Simultaneous determination of the plasma concentrations of imipenem,meropenem,and ceftazidime by HPLC-UV method in patients with melioidosis Fu Xiang-xiang1,Zhong Li-li2,Chen Jun2,Chai Fang3,Yun Xiong2,Wu Hua4,Wang Min21School of Pharmacy,Hainan Medical University,Haikou 571199,China;2Department of Pharmacy,Hainan General Hospital(Hainan Affiliated Hospital of Hainan Medical University),Haikou 570311,China;3Department of Pharmacy,Sanya Peoples Hospital,Sanya 572000,China;4Department of Laboratory Medicine,Hainan General Hospital(Hainan Affiliated Hospital of Hainan Medical University),Haikou 570311,ChinaCorrespongding author:Wang Min,Email:AbstractObjective To develop a rapid and cost-effective method of high performance liquid chromatography-ultraviolet detection(HPLC-UV)for the simultaneous determination of the plasma concentrations of imipenem,meropenem and ceftazidime in human plasma.Methods The protein was removed by Millipore 10KD ultrafiltration centrifugation,and the chromatographic column was SunFire C18 column(4.6 mm 250 mm,5m).The pre-column was C18 column(4.0 mm 2.1 mm,5m),and the mobile phase was 0.1 molL-1 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid and acetonitrile with pH 7.0.Samples were gradiently eluted with the flow rate of 1.0 mLmin-1 for 30 minutes and detected at the wavelength of 299 nm.The injection volume was 30L.Results The retention time of imipenem,meropenem and ceftazidime were 6.699 min,10.795 min and 8.722 min,respectively.The peak form was pleasing without disturbance of the endogenous components in plasma.The method showed good accuracy,precision,and linear relationship.The samples with different concentrations showed high stability at 20 and 4.Conclusion The method has low operation cost,strong specificity and good separation effect,which can be used for routine determination of the plasma concentrations of imipenem,meropenem and ceftazidime in patients with melioidosis.Key WordsMelioidosis;Imipenem;Meropenem;Ceftazidime;High performance liquid chromatography-ultraviolet detection 中国药物应用与监测 2024 年2月 第21卷第1期 Chin J Drug Appl&Monit，Feb 2024,Vol.21,No.1 35 亚胺培南、美罗培南和头孢他啶均属于-内酰胺类抗生素药物，是目前临床治疗类鼻疽强化期首选的抗菌药1。近年来，由于-内酰胺类抗生素耐药性的出现以及相关不良事件的发生率较高2-6，需要对类鼻疽患者血浆中抗生素进行治疗药物监测（TDM），确保足够的抗生素暴露，以实现安全、有效的个体化治疗方案。高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）是一种常用于生物基质样品中大多数抗生素的测定方法7-9。本文尝试建立一种同时测定类鼻疽患者血浆中亚胺培南、美罗培南和头孢他啶血浆浓度的HPLC-UV方法，为此类患者强化期的个体化给药方案提供参考。1仪器与试剂1.1仪器 WATERS Acquity UPLC H-Class超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；XS205du型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多）；R20医用高速冷冻离心机（安新县白洋离心机厂）；MDF-382E超低温保存箱（三洋科研医疗设备公司）；UPC-5T超纯水机（成都超纯科技有限公司）；XW-80A微型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂）。1.2试剂 亚胺培南（Toronto Research Chemicals，批号：1-MLM-65-1，含量：96.0%）；美罗培南（中国食品药品检验研究院，批号：130506-201403，含量：87.7%）；头孢他啶（中国食品药品检验研究院，批号：130484-201806，含量：85.8%）；3-（N-吗啡啉）丙磺酸（上海源叶生物科技有限公司，批号：Y28D9K78788，色谱纯）；乙腈（色谱纯）；氢氧化钠（分析纯）。空白血浆（添加肝素抗凝剂及稳定剂）取自海南省人民医院健康志愿者。2方法与结果2.1色谱条件 色谱柱：SunFire C18柱（4.6 mm 250 mm，5 m，WATERS）；预柱：C18柱（4.0 mm 2.1 mm，5 m，依利特）；流动相A：0.1 molL-1 的3-（N-吗啡啉）丙磺酸（pH=7.0）；流动相B：乙腈；梯度洗脱；流速：1.0 mLmin-1；波长：299 nm；运行时间 30 min；柱温：室温；进样体积：30 L；清洗模式：进样前及进样后；洗针液：90%乙腈。2.2溶液的配制2.2.1稳定剂与稀释液的配制配制0.5 molL-1及0.1 molL-1的3-（N-吗啡啉）丙磺酸溶液，取适量的 0.1 mol/L氢氧化钠分别调节pH值至7.0，即得稳定剂溶液和稀释液。两种溶液均保存在4 的冰箱中备用。2.2.2储备液的配制精密称取亚胺培南41.67 mg、美罗培南45.61 mg及头孢他啶46.62 mg，分别至独立的10 mL容量瓶中，加入适量稳定剂溶液，配置成最终浓度分别为4 000 gmL-1的储备液，储存至 20 冰箱中备用。2.2.3内标溶液的配制精密称取45.61 mg的美罗培南及23.31 mg的头孢他啶标准品，分别置于独立的10 mL与20 mL的容量瓶中，加适量稳定剂溶液，配置成浓度为4 000 gmL-1和1 000 gmL-1内标工作液，储存于 20 冰箱中备用（注：美罗培南作为待测物头孢他啶的内标物，头孢他啶作为待测物亚胺培南与美罗培南的内标物）。2.2.4标准曲线与质控工作溶液的配制亚胺培南、美罗培南及头孢他啶标准曲线工作溶液（10.0、20.0、100.0、200.0、500.0、1 000.0、2 000.0 和 4 000.0 gmL-1），亚胺培南/美罗培南质控工作溶液（10.0、60.0、600.0和3 840.0 gmL-1）及头孢他啶质控工作溶液（10.0、200.0、2 400.0和3 840.0 gmL-1）由一定量的稀释液和储备液配制而成。2.3血浆样品处理 用EDTA-K2抗凝管采集约2 mL静脉血，置于冰盒中并立即转移到实验室，室温下以3 500 rmin-1的速度离心5 min分离出血浆。取400 L待测血浆置于预先加入的10 L内标溶液，再加入100 L稳定剂溶液，涡旋混匀，通过Millipore 10KD超滤管，15 000 rmin-1超速离心10 min后，取续滤液，即得。2.4专属性考察 取空白血浆、空白血浆+头孢他啶、空白血浆+亚胺培南+美罗培南，按照2.1色谱条件测定美罗培南、亚胺培南和头孢他啶的浓度，色谱图见图1。头孢他啶、亚胺培南和美罗培南的的保留时间分别为8.722 min、6.699 min和10.795 min。总分析时间为30 min。在本色谱图中，没有干扰峰出现，血浆内源性物质不干扰待测物的测定，且分离效果较好，专属性强。2.5标准曲线的建立 取380 L空白血浆加入20 L不同浓度的标准曲线工作溶液，涡旋混匀，制备得到亚胺培南、美罗培南及头孢他啶浓度分别为0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0和200.0 gmL-1的血浆样品，按2.3项血浆样品处理方法处理样品，以待测物与内标的峰面积比（Y）和待测药物浓度（X）作线性回归，计算回归方程，并考察检测限及定量限。亚胺培南线性回归方程：Y=0.076 4 X-0.002 1，R2=0.999 7，线性范围0.490 196.000 gmL-1，LLOQ为0.490 gmL-1；美罗培南线性回归方程：Y=0.074 4 X+0.008 9，R=1，线性范围0.492 196.680 gmL-1，LLOQ为 0.492 gmL-1；头孢他啶线性回归方程：Y=0.005 7 X+0.001 6，R=1，线性范围 0.491 196.340 gmL-1，LLOQ为 0.491 gmL-1。中国药物应用与监测 2024 年2月 第21卷第1期 Chin J Drug Appl&Monit，Feb 2024,Vol.21,No.1 36 2.7提取回收率试验 提取回收率（低、中、高3个浓度水平）样本，以同批次考察准确度和精密度的质控样本为提取回收率参照样本，两者比值即为回收率，其RE均值不超过15%，并计算各项RSD不得超过5%。亚胺培南、美罗培南和头孢他啶3种药物的平均提取回收率、相对偏差和RSD结果符合相关规定，具体数据见表1。表1提取回收率试验结果（n6）药品理论质量浓度（gmL-1）提取回收率计算值（%）RE（%）RSD（%）亚胺培南3.0093.10.246.3230.0094.50.314.90192.0094.70.324.763.0099.00.160.52美罗培南30.0099.10.980.41192.0099.10.940.4110.0092.90.136.76头孢他啶120.0094.50.475.10190.0093.50.546.132.8稳定性试验 取低、高2个浓度的质控样品，在4 放置48 h后进样，考察处理后样品4 下放置48 h的稳定性；取置于-20 冰箱中储存的低、高两个浓度质控样品，保存时间不少于14 d，考察-20 长期冷冻样品的稳定性；取低、高2个浓度的质控样品，放入-20 冰箱内使其完全冷冻后拿出，在室温下完全融化后再放入冰箱中，这样冰冻-解冻循环3次，经样品处理后进样分析，考察样品反复冻融3个循环的稳定性。结果显示，三组试验结果的准确度平均偏差 15%，RSD 5%，表明在考察条件下，血浆样本均能 达到稳定要求，血药浓度测定结果可靠，具体数据见表2。3讨论3.1流动相的选择 考虑到乙腈能够梯度洗脱极性较小的化合物10，亚胺培南、美罗培南和头孢他啶的保留时间随着流动相pH的增加而缩短，亚胺培南和美罗培南在酸性和碱性环境中很容易降解11，本研究以pH 7.0的0.1 molL-1 3-（N-吗啡啉）丙磺酸和乙腈为流动相，实现了分析物的良好分离和适宜的保留时间。3.2稳定剂溶液的选择 Thomas等12发现，在不添加稳定剂溶液的情况下，-内酰胺类抗菌药物短期稳定性不佳，其中碳青霉烯类亚胺培南和美罗培南的稳定性比头孢他啶稳定性更差。考虑到加入3-（N-吗啡啉）丙磺酸可提高碳青霉烯类抗生素的稳定性8，使亚胺培南和美罗培南在低温下表现出较高的稳定性。0.200.180.160.140.120.100.080.060.040.020.000.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.0012.00 14.00 16.0018.00 20.0022.00 24.00 26.0028.00 30.00AUt（min）A1.201.000.800.600.400.200.000.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.0012.00 14.00 16.0018.00 20.0022.00 24.00 26.0028.00 30.00AUt（min）B11.201.401.601.000.800.600.400.200.000.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.0012.00 14.00 16.0018.00 20.0022.00 24.00 26.0028.00 30.00AUt（min）C23图1亚胺培南、美罗培南及头孢他啶的色谱图A 空白血浆，B 空白血浆+头孢他啶，C 空白血浆+亚胺培南+美罗培南；1 头孢他啶，2 亚胺培南，3 美罗培南2.6精密度和准确度试验 取380 L空白血浆加入20 L不同浓度的质控工作溶液，涡旋混匀，配制成低（3.0 gmL-1）、中（30.0 gmL-1）、高（192.0 gmL-1）3个浓度的亚胺培南和美罗培南质控样品，和低（10.0 gmL-1）、中（120.0 gmL-1）、高（192.0 gmL-1）3个浓度的头孢他啶质控样品。分别按2.3项平行处理6份样品考察准确度和精密度。结果显示，亚胺培南、美罗培南和头孢他啶3个浓度的准确度和精密度平均偏差 15%，RSD 5%，提示该方法具有较高的准确度和精密度，能够准确地测定亚胺培南、美罗培南和头孢他啶的浓度，并且在重复测量中具有较好的稳定性和一致性，也进一步验证了该方法的可靠性和适用性。中国药物应用与监测 2024 年2月 第21卷第1期 Chin J Drug Appl&Monit，Feb 2024,Vol.21,No.1 37 表2血浆样品稳定性试验结果（n6）药品理论质量浓度（gmL-1）4 （48 h）-20 反复冻融-20 长期冷冻准确度平均偏差（%）RSD（%）准确度平均偏差（%）RSD（%）准确度平均偏差（%）RSD（%）亚胺培南3.002.71.0111.10.757.30.56192.0011.41.633.30.269.31.973.002.51.598.81.988.91.63美罗培南192.0013.81.117.30.2612.81.1210.004.50.162.20.5312.90.48头孢他啶190.008.30.0811.60.1413.10.06本研究将0.5 molL-1 3-（N-吗啡啉）丙磺酸溶液作为稳定剂，结果3种药物加入稳定剂后在-20 反复冻融、-20 长期冷冻和4 （48 h）下均表现出了较高的稳定性。本研究建立了一种简单、经济的HPLC-UV方法，可用于同时测定人血浆中亚胺培南、美罗培南和头孢他啶的血药浓度，也可用于类鼻疽特别是危重患者强化期的常规TDM。参考文献1 Karunanayake P.Melioidosis:clinical aspectsJ.Clin Med（Lond），2022，22（1）:6-8.2 苏玲，何文琼.我院195例抗菌药物致不良反应报告分析J.海峡药学，2021，33（12）:223-226.3 杨琼，李丽.210例抗菌药物不良反应报告分析J.中国药物应用与监测，2018，15（5）:291-294.4 蔡杰，韩陈媛，江君微.头孢他啶致药物性肝损伤1例及文献分析J.中国药物应用与监测，2021，18（2）:140-142.5 叶婷，杜俊龙，陈丹，等.70例美罗培南不良反应文献分析J.中国药物应用与监测，2022，19（5）:313-317.6 Mangalore RP，Ashok A，Lee SJ，et al.Beta-lactam antibiotic therapeutic drug monitoring in critically ill patients:a systematic review and meta-analysisJ.Clin Infect Dis，2022，75（10）:1848-1860.7 Tuzimski T，Petruczynik A.Review of chromatographic methods coupled with modern detection techniques applied in the thera-peutic drugs monitoring（TDM）J.Molecules，2020，25（17）:4026.8 Zou L，Meng F，Hu L，et al.A novel reversed-phase high-per-formance liquid chromatographic assay for the simultaneous determination of imipenem and meropenem in human plasma and its application in TDMJ.J Pharm Biomed Anal，2019，169:142-150.9 Bergman J，Harvill L，Hawkins S，et al.Determination of cef-tazidime in plasma by RP-HPLC and ultraviolet detectionJ.Biomed Chromatogr，2021，35（7）:e5104.10 Verdier MC，Tribut O，Tattevin P，et al.Simultaneous deter-mination of 12 beta-lactam antibiotics in human plasma by 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应写为mg/（kgd）或mgkg-1d-1。时间的表示方法：作为单位修饰词仪为数字时，天（日）用“d”，小时用“h”，分钟用“min”，秒用“s”。非单位时可用天、小时、分钟、秒。如:在描述第天、第小时、第分钟，或每天、每小时、每分钟等时，均用汉字。读者作者编者