黄葵胶囊通过Wnt_β-catenin通路保护IgA肾病大鼠的机制研究.pdf

中国药物应用与监测 2024 年2月 第21卷第1期 Chin J Drug Appl&Monit，Feb 2024,Vol.21,No.1 47 黄葵胶囊通过Wnt/-catenin通路保护IgA肾病大鼠的机制研究朱莹莹1，刘一鸣2，王冬雪2，侯继秋2，徐 锋31吉林大学第二医院乳甲外科，长春 130041；2吉林大学第二医院药学部，长春 130041；3吉林大学第二医院肾病内科，长春 130041通信作者：徐锋，Email：摘要 目的 探讨黄葵胶囊对IgA肾病大鼠保护作用的分子机制。方法 采用血清白蛋白灌胃+四氯化碳皮下注射+脂多糖尾静脉注射建立IgA肾病模型。将健康雌性大鼠随机分为对照组（A组）、IgA肾病模型组（B组）、黄葵胶囊治疗组（C组）以及IgA肾病黄葵胶囊治疗组（D组）。C组和D组予黄葵胶囊灌胃。4周后收集大鼠血清、尿液和肾脏组织样本。观察肾脏病理变化；检测Wnt/-catenin信号通路-连环蛋白（-catenin）、平滑肌肌动蛋白（-SMA）的相对mRNA表达；检测-catenin和-SMA的蛋白表达；检测24 h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮的含量。结果 24 h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮肾脏损害指标、肾脏组织损害、-catenin及-SMA mRNA表达水平、-catenin及-SMA蛋白表达水平，与A组相比，C组均无明显差异，B组和D组均明显升高，差异具有统计学意义（P 0.05）；与B组相比，D组明显降低，差异均有统计学意义（P 0.05）。结论 黄葵胶囊对健康大鼠无明显肾脏保护作用，可以减轻IgA肾病大鼠的肾损害，降低Wnt/-catenin通路表达，可能与其抑制Wnt/-catenin信号通路活化有关。关键词 IgA肾病；Wnt/-catenin；黄蜀葵花基金项目 吉林省教育厅项目（JJKH20211188KJ）；吉林省高教科研课题（JGJX2021D29）；吉林省高教科研课题（JGJX2020D19）；2023年吉林省自然科学基金面上项目（医学科学领域）（YDZJ202301ZYTS082）DOI 10.3969/j.issn.1672-8157.2024.01.012Protection mechanism of Huangkui capsules for IgA nephropathy rats through Wnt/-catenin pathwaysZhu Ying-ying1,Liu Yi-ming2,Wang Dong-xue2,Hou Ji-qiu2,Xu Feng3 1Department of Thoracic Surgery,the Second Hospital of Jilin University,Changchun 130041,China;2Department of Pharmacy,the Second Hospital of Jilin University,Changchun 130041,China;3Department of Nephrology,the Second Hospital of Jilin University,Changchun 130041,ChinaCorrespongding author:Xu Feng,Email:Abstract Objective To investigate the molecular mechanism of the protective effect of Huangkui capsules on IgA nephropathy rats.Methods The model of IgA nephropathy was established by intragastric administration of serum albumin,subcutaneous injection of carbon tetrachloride and tail vein injection of lipopolysaccharide.Healthy female rats were randomly divided into control group(group A),IgA nephropathy model group(group B),Huangkui capsules treatment group(group C)and IgA nephropathy group treated with Huangkui capsules(group D).Huangkui capsules were administered to group C and group D intragastrically.Serum,urine and kidney tissue samples were collected after 4 weeks.The pathological changes of kidneys were observed.The relative mRNA expression of-catenin and-SMA in Wnt/-catenin signaling pathways was detected.The protein expression of-catenin and-SMA was detected.The levels of urinary protein,serum creatinine and blood urea nitrogen in 24 hours were detected.Results Compared with group A,24 h kidney damage indicators such as urinary protein,serum creatinine and blood urea nitrogen,kidney tissue damage level,-catenin and-SMA mRNA expression,as well as-catenin and-SMA protein expression in group B and group D significantly increased,with statistical significance(P 0.05),that in group C showed no significant differences.Compared with group B,that in group D significantly decreased,and the differences were statistically significant(P 0.05).Conclusion Huangkui capsules had no obvious protective effect on the kidneys of healthy rats.Huangkui capsules could reduce the kidney damage and the expression of Wnt/-catenin pathways in IgA nephropathy rats,which might be related to their inhibition of the activation of Wnt/-catenin signaling pathways.Key Words IgA nephropathy;Wnt/-catenin;Flos Abelmoschus manihot中国药物应用与监测 2024 年2月 第21卷第1期 Chin J Drug Appl&Monit，Feb 2024,Vol.21,No.1 48 IgA肾病（IgA nephropathy，IgAN）是以肾小球系膜区IgA沉积为主要特点的原发性肾小球疾病，占原发性肾小球疾病的25%50%，是引发终末期肾病的重要原因1-2。IgAN发展成终末期肾病的共同通路为肾小管间质损伤，其损伤严重程度与IgAN的预后密切相关。有研究3表明，Wnt/-catenin在IgAN患者中表达水平明显高于对照组，提示其在IgAN患者肾小管间质损伤及肾脏纤维化过程中发挥重要作用。黄葵胶囊是黄蜀葵花的提取物，具有保护肾脏、延缓肾功能进展的作用，在治疗IgAN及降低蛋白尿方面有明显疗效4，但其是否通过作用于Wnt/-catenin信号通路而保护肾脏、延缓肾功能进展尚不明确。因此，本研究以IgAN大鼠为模型，探索黄葵胶囊对IgAN大鼠保护作用的分子机制。1 材料与方法1.1 实验材料 24只6周龄大鼠（清洁级SD雌性大鼠，体质量160 200 g，中国科学院实验动物中心）。-catenin CST 8480（美国Cell Signaling Technology公司）。-SMA ab7817（美国Abcam公司）。蓖麻油C6770和脂多糖L8880（北京Solarbio公司）。黄葵胶囊（苏中药业集团有限公司，批号：20112317）。将黄葵胶囊中的内容物充分溶解于蒸馏水作为黄葵胶囊溶解液备用。1.2 模型制备 给予大鼠隔日的血清白蛋白400 mgkg-1d-1灌胃6周；蓖麻油0.5 mL，每周一次和四氯化碳0.1 mL，每周一次，注射9周；第6、8周给予大鼠脂多糖0.05 mg尾静脉注射。10周后观察大鼠是否有肉眼或镜下血尿，血尿中30%以上尿红细胞发生变形，伴有不同程度的蛋白尿。若出现上述症状，提示造模成功。1.3 实验分组 24只大鼠分成4组，每组6只。其中12只为SD级健康大鼠，随机分成对照组（A组）和黄葵胶囊治疗组（C组）；12只为IgA肾病造模成功大鼠，随机分成IgA肾病模型组（B组）和IgA肾病黄葵胶囊治疗组（D组）。A组和B组予不含药物的安慰剂，C组和D组予黄葵胶囊溶解液。成人应用黄葵胶囊内容物的剂量为6.45 gd-1，以平均体质量60 kg计，约0.107 5 gkg-1d-1，因此予C组和D组大鼠0.107 5 gkg-1d-1黄葵胶囊溶解液，4周后，麻醉处死大鼠，收集血清、尿液和肾脏组织。1.4 样品的采集与处理 各组大鼠分别称重，将其分别放入代谢笼中，收集24 h尿液，并计量每只大鼠24 h尿量，1 000 rmin-1离心10 min，取上清液，4 保存，用于检测24 h尿蛋白水平。大鼠脊椎脱臼法处死，断头采血，3 000 rmin-1离心10 min，分离血清，4 保存，用于检测血肌酐、血尿素氮含量。取大鼠两侧肾脏，置于4 生理盐水中，纵向剖开，迅速剥去肾包膜，称重并记录数据，取2 cm1.5 cm0.3 cm肾组织浸泡于盛有10%中性甲醛溶液的小瓶中固定，用于PAS染色，光镜观察。1.5 统计学方法 采用SPSS 20.0软件，计量资料的相关指标符合正态分布使用（xs）表示，组间比较采用单因素方差分析；计数资料以例数（n）和百分比（%）表示，采用2检验，以P 0.05为差异具有统计学意义。2 结果2.1 各组大鼠肾功能损害指标 造模10周后，12只IgAN模型大鼠逐渐出现程度不等的食欲减退，活动减少，精神萎靡，反应迟钝等表现。可见肉眼或镜下血尿，血尿中30%以上尿红细胞发生变形，伴有不同程度的蛋白尿。免疫荧光示 12 只健康大鼠肾脏组织IgA（-），12只IgAN模型大鼠免疫荧光IgA（+）。IgAN模型大鼠造模成功。与A组相比，B组和D组24 h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮显著升高，差异均有统计学意义（P 0.05）；与A组相比，C组24 h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮无明显降低，差异无统计学意义；与B组相比，D组24 h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮均降低，差异有统计学意义（P 0.05），具体见表1。表1 各组大鼠24 h尿蛋白、血肌酐、尿素氮比较（n=6）组别24 h尿蛋白（mg）血肌酐（molL-1）血尿素氮（mmolL-1）A组5.580.7632.682.564.470.31B组35.371.3875.083.517.360.53C组4.080.5626.560.823.030.63D组29.502.6450.394.114.970.162.2 各组大鼠肾脏组织改变 PAS染色后，A组与C组肾脏组织无改变。与A组相比，B组可见系膜细胞中重度增生，肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性，灶状间质炎细胞浸润；D组给予黄葵溶解液后，表现为肾小球系膜细胞轻中度增生，肾小管上皮细胞空泡变，间质炎细胞浸润。2.3 黄葵胶囊对大鼠肾脏-catenin、-SMA mRNA水平的影响 RT-PCR结果显示，与A组相比，B组和D组-catenin、-SMA mRNA表达水平明显升高，差异均有统计学意义（P 0.05）；与A组相比，C组-catenin、-SMA mRNA表达水平无明显降低，差异无统计学意义；与B组相比，D组-catenin、-SMA mRNA 表达水平明显降低，差异有统计学意义（P 0.05），具体见表2。中国药物应用与监测 2024 年2月 第21卷第1期 Chin J Drug Appl&Monit，Feb 2024,Vol.21,No.1 49 表2 黄葵胶囊对各组大鼠肾脏-catenin、-SMA mRNA水平的影响（n=6）组别-catenin-SMAA组1.001.00B组8.6510.76C组0.901.25D组4.887.662.4 黄葵胶囊对大鼠肾脏-catenin、-SMA蛋白表达的影响 Western blot结果显示，与A组相比，B组和D组-catenin、-SMA蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义（P 0.05）；与A组相比，C组-catenin、-SMA 蛋白表达水平无明显降低，差异无统计学意义；与B组相比，D组-catenin、-SMA蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义（P 0.05），具体见表3。表3 黄葵对各组大鼠肾脏-catenin、-SMA蛋白水平的影响（n=6）组别-catenin/GAPDH-SMA/GAPDHA组1.001.00B组1.331.34C组0.730.82D组1.071.283 讨论IgAN是常见的原发性肾小球疾病，是引发终末期肾脏病的重要原因，其具体发病机制尚未明确，可能与环境、遗传、免疫等因素密切相关。近年研究5-6发现，IgAN不仅与肾小球损伤有关，而且涉及多种细胞因子和信号通路的调控。有学者应用高通量技术发现IgAN患者Wnt/-catenin通路调节异常7。Wnt/-catenin信号通路参与肾单位的形成，其中Wnt 4和Wnt 9b在肾小管形成中的作用已经得到证实8-9。黄葵胶囊是黄蜀葵花的提取物，具有利尿、消肿和解毒的功效10。黄葵胶囊的肾脏保护作用，很可能与其有效成分金丝桃苷、杨梅素、槲皮素和芦丁有关11。帕立骨化醇可特异性阻断Wnt/-catenin信号通路从而有效抑制鼠肾小管间质损伤的进展12-13。国内学者应用黄芪治疗糖尿病肾病大鼠，提示黄芪可能通过下调Wnt4、-catenin在肾间质中的表达，延缓糖尿病肾病大鼠肾间质纤维化的进程14。本文结果显示，与对照组相比，IgA肾病模型组和IgA肾病黄葵胶囊治疗组24 h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮肾脏损害指标、肾脏组织损害、-catenin及-SMA mRNA表达、-catenin及-SMA蛋白表达明显升高，差异均有统计学意义，提示IgA肾病大鼠肾脏损害严重，且出现Wnt/-catenin通路表达明显上调。与对照组相比，黄葵胶囊治疗组24 h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮肾脏损害指标、肾脏组织损害、-catenin及-SMA mRNA水平、-catenin及-SMA蛋白水平均无明显差异，提示黄葵胶囊对健康大鼠无明显肾脏保护作用。与IgA肾病模型组相比，IgA肾病黄葵胶囊治疗组24 h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮肾脏损害指标、肾脏组织损害、-catenin及-SMA mRNA表达、-catenin及-SMA蛋白表达明显降低，提示黄葵胶囊可减轻IgA肾病大鼠的肾损害，降低Wnt/-catenin通路表达，并且黄葵胶囊延缓肾损害可能与其能够抑制Wnt/-catenin信号通路活化有关。参考文献1 Magistroni R，D Agati VD，Appel GB，et al.New developments in the genetics，pathogenesis，and therapy of IgA nephropathyJ.Kidney Int，2015，88（5）:974-989.2 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