基于蛋白质芯片技术筛选与甲型流感病毒NS1蛋白互作的宿主因子及通路分析.pdf

中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.140基于蛋白质芯片技术筛选与甲型流感病毒 NS1 蛋白互作的宿主因子及通路分析张宇1，张薇2,3，高双荣1，陈梦苹1，王雅欣1，徐英莉1，曹姗1，赵荣华1，包蕾1，李舒冉1，孙静1，鲍岩岩1，耿子涵1，郭姗姗1*，冀祖恩2,3#，崔晓兰1（1中国中医科学院中药研究所生物安全实验室，北京 100700；2新疆全安药业股份有限公司，新疆 库尔勒 841000；3新疆甘草及制品研究重点实验室，新疆 库尔勒 841000）摘要：目的筛选出与流感病毒 Non-structural protein 1（NS1）蛋白结合的人类宿主蛋白并加以分析，确定这些结合蛋白富集的方向及关键蛋白，为抗流感病毒的新药研发提供思路。方法将 NS1样本、Biotin 样本分别与HuProt人类蛋白质组芯片进行杂交孵育，以两重复均满足 Z-Score3为筛选条件对与NS1蛋白有结合的宿主蛋白进行筛选得到特异性检出蛋白，实验组（NS1蛋白）与对照组（Biotin）比值 I Mean_Ratio1.4为条件筛选出显著特异性检出蛋白。用检出的195 个蛋白进行 GO（Biological Process，Molecular Function，Cellular Component）和 KEGG_PATHWAY 分析，通过蛋白-蛋白相互作用（PPI）及 MCODE 分析得到关键蛋白。结果获得显著特异性检出蛋白195 个，GO 分析结果显示这些蛋白主要参与了mRNA 加工、RNA 结合、蛋白结合，KEGG 分析主要富集到 RNA 降解、氨基酸的生物合成等通路。得到的 4 个关键蛋白DDX6、HSPD1、PKLR、MTHFD1中DDX6 与RNA 的合成、翻译等过程相关，而NS1蛋白可以通过调控流感病毒 RNA 和宿主 RNA促进病毒的感染，推测 DDX6 可能在该过程发挥作用；其他 3 个蛋白目前虽然没有明确的研究指明其与流感病毒有关系，但是能在其他 RNA 病毒的感染过程中发挥作用。结论 与NS1结合的人类蛋白主要富集到 RNA合成、加工、转录等过程中，MCODE 分析得到的关键蛋白有潜力成为抗流感病毒新的靶点，但作用机制需要后续实验进行进一步验证。关键词：甲型流感病毒；NS1蛋白；蛋白质芯片；生信分析；宿主因子；通路Screening and analysis of host factors interacting with NS1 proteins of influenza A virus based on the proteome chipZHANG Yu1,ZHANG Wei2,3,GAO Shuangrong1,CHEN Mengping1,WANG Yaxin1,XU Yingli1,CAO Shan1,ZHAO Ronghua1,BAO Lei1,LI Shuran1,SUN Jing1,BAO Yanyan1,GENG Zihan1,GUO Shanshan1*,JI Zuen2,3#,CUI Xiaolan1(1Biosecurity Laboratory,Institute of Chinese Materia Medica,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China;2 Xinjiang Quanan Pharmaceutical Company Limited,Korla Xinjiang 841000,China;3Xinjiang Key Laboratory for Research of Licorice and Products,Korla Xinjiang 841000,China)Abstract：Objective The human proteins interacting with influenza A virus(IAV)NS1 protein were obtained and analyzed to confirm the affected host biological processes and the core human proteins in the course of infection,providing thoughts for the development of drugs against influenza A virus.Methods NS1 sample and Biotin sample were hybridized with HuProt human proteome chip respectively,and the host protein bound to NS1 protein was screened on condition that both of repeated trials are matching Z-Score 3.The significantly specific proteins were further selected using a strict criteria(IMean_Ratio 1.4).Gene Ontology(GO)and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)signaling pathway analysis were performed to evaluate these targets and MCODE was performed to explore the core proteins.Results A total of 195 significant specific proteins were obtained.Analysis results showed that these proteins were mainly involved in mRNA processing,RNA binding and protein binding,RNA degradation and amino acid biosynthesis.Among the four core proteins DDX6,HSPD1,PKLR and MTHFD1,DDX6 is related to RNA synthesis and translation.NS1 protein can promote viral infection by regulating IAV and host DOI:10.19803/j.1672-8629.20230463 中图分类号：R978;R994.11文献标志码：A 文章编号：1672-8629（2024）01-0040-05基金项目：国家自然科学基金资助项目（82151210、81773977）。作者简介：张宇，女，硕士，中药防治病毒性疾病药效机制研究。*通信作者：郭姗姗，女，博士，中药防治病毒性疾病药效机制研究。E-mail：#为共同通信作者。编者按：中医认为呼吸道传染病属于外感病，多因正气不足，卫外不固所致外邪侵袭。中医药应对外感病具有独特的手段和方法，在退热、缓解全身酸痛、止咳化痰等方面具有显著作用优势。本期特邀郭姗姗研究员组织相关专家策划本专栏，围绕流感病毒、普通冠状病毒（229E 和 OC43）等呼吸道病毒性疾病及新冠后遗症致病机制进行探讨，并深入研究疏风解毒胶囊、宣肺败毒方、散寒化湿颗粒在呼吸道病毒性疾病防治中的中医理论、药理作用和分子机制，为中医药防治呼吸道病毒性疾病的临床应用提供理论支持和实验室数据支撑。呼吸道病毒性疾病与中医药防治机制研究专栏中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.141流感病毒（influenza virus）是一种传染性和流行性极强的呼吸道病毒，可以引起上呼吸道感染，后期甚至可能发展成严重肺炎及多器官衰竭，造成死亡，每年因流感死亡的人数可达到 25万至 50万1。由于流感病毒具有高度的变异性，且流感病毒的有效药物十分缺乏，这对全球公共卫生安全构成了重大威胁。流感病毒首先感染呼吸道上皮细胞，完成增殖过程后传播至呼吸道远端引起持续的免疫反应2。感染早期可以通过适当的免疫反应将流感病毒清除3，然而过度免疫会造成细胞因子风暴和肺部炎症浸润，表现为巨噬细胞和中性粒细胞被过度激活和招募到肺部，这也是从轻微症状发展为危及生命的严重肺炎的原因之一4-6。流感病毒属于正粘病毒科（orthomyxovirida），分为甲型、乙型和丙型，其中以甲型流感病毒变异程度最大，对人类的危害最严重7。流感病毒的基因组含有 8 条单股负链 RNA，每个 RNA 片段都被病毒核蛋白（NP）包裹，与由 PA、PB1 和 PB2 蛋白组装而成的 RNA 聚合酶（RdRp）结合形成病毒核糖核酸蛋白复合物7。流感病毒 NS1 蛋白由第 8 个基因片段编码，是感染后最先表达的病毒蛋白之一8。大量研究表明，NS1 蛋白可以通过与多种宿主蛋白相互作用影响宿主细胞正常的抗病毒免疫反应，从而达到促进病毒复制的目的9。维甲酸诱导基因（retinoicacid-inducible gene I,RIG-I）可以识别dsRNA，招募三重基序蛋白25(tripartite motif-containing protein 25,TRIM25)催化 RIG-I 发生泛素化，激活下游的线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVs)传递抗病毒信号，最终促使 IFN-I大量表达，发挥抗病毒作用10。而 NS1蛋白可以与RIG-I 和 TRIM25 结合，阻断信号传递，抑制 IFN-I的表达11，除此之外，NS1 还可以通过阻止 pre-mRNA 的加工成熟及出核来抑制 IFN 等多种抗病毒蛋白的表达10。基于 NS1蛋白在流感病毒复制感染中的作用，使其成为研究新型抗流感病毒药物最有前景的靶点之一，除 NS1蛋白本身，与其相互作用的宿主蛋白也有成为药物靶点的潜力。本研究使用蛋白质芯片技术，对与 NS1蛋白有互作的宿主蛋白进行筛选，并对这些蛋白进行生信分析，探讨了NS1 蛋白可能参与影响的宿主生物过程、通路等，为开发新的抗流感病毒药物提供思路。1 实验材料1.1 实验试剂H1N1 NS1蛋白（北京义翘神州科技股份有限公司，批号：LC09SE0104）；HuProt人类蛋白质组芯片（美国 CDI 公司，批号：CDI 9005747、CDI 9005774）；微量 BCA 试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司，批号：B06722）；生物素标记试剂盒（美国 Full Moon 公司，批号：70205）；Cy5 Streptavidn Solution（Invitrogen 公司，批号：2040723）。1.2 实验仪器Amicon Ultra-4 3kD 微型离心过滤器（Millipore，USA）；摇床 TS-2（Kylin-Bell Lab Instruments，China）；芯片小型离心机（Tomy，Japan）；GenePix 4000B 芯片扫描仪（Axon Instruments，USA）；GenePixTM Pro v6.0软件（Axon Instruments，USA）。2 实验方法2.1 NS1 蛋白处理根据说明书要求，向 NS1 干粉中加入 800 L ddH2O 配制成浓度为 0.125 g L-1的溶液，超滤离心后通过微量 BCA 试剂盒测定蛋白浓度。将 Biotin Reagent用DMF配置成终浓度为10 g L-1的Biotin/DMF 溶液，用于标记上述 NS1蛋白，标记步骤如下：取 25 g 的 NS1蛋白加至新离心管中，加标记缓冲液（Labeling Buffer）至终体积为 67 L；加入 3 L 的Biotin/DMF 到标记样本管中，每10 min震荡1次，室温震荡 2 h；最后加入 30 L 的终止液，在室温下震荡30 min12。用1PBS-T 稀释标记的NS1蛋白至终浓度5 g 5 mL-1作为实验组。同批以 1 例Biotin Reagent作为对照组进行检测，以排除部分假阳性结果12。2.2 芯片处理及检测按照本课题之前的实验方法进行芯片检测12。先用预冷的封闭液（5%BSA/1PBS-T）对芯片进行封闭，然后将芯片与标记的 NS1蛋白共同孵育1 h，用 1PBS-T 溶液洗涤芯片 3 次，每次 10 min；再用去离子水清洗芯片 2 次，每次 5 min。最后将芯片与0.1%Cy5-Streptavidn Solution 在室温下避光反应RNA,suggesting that DDX6 may be indispensable in this process.Although the other three proteins not clearly linked to influenza viruses,they can play a crucial role in the infection of other RNA viruses.Conclusion The human proteins bound to NS1 are mainly enriched in the process of RNA synthesis,processing,transcription,etc.The core proteins have potential to become new targets for anti-IAV,which need to be further verified by subsequent experiments.Keywords：influenza A virus;NS1 protein;proteome chip;bioinformatics;host factors;pathway中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.14220 min，清洗后离心干燥；用GenePix 4000B扫描仪，在 635 nm，Power（100%）条件下扫描芯片。2.3 检出蛋白筛选蛋白质组芯片上的每种蛋白设置了2 次技术重复，读取芯片时，去除 ND 点，Control 点以及质量不好的位点。将每个位点的荧光信号中位数除以背景后用于数据分析，即计算位点原始信号强度 I=F635 Median/B635 Median。计算所有位点 I 的中位数 Median 和标准方差 SD，以此计算获得每个位点的校正数据 Z-Score，Z-Score 计算公式如下：M=Median(Ix,y,z）公式（1）Z-Score x,y,z=(Ix,y,z-M)/SD 公式（2）M：所有蛋白位点 Ix,y,z 的中位数；Ix,y,z：芯片内每个蛋白位点的原始信号强度；x：每个蛋白位点的列序号，x=1,2,332；y：每个蛋白位点的行序号，y=1,2,372；z：芯片上 Block 的序号，z=1,2,324；Z-Scorex,y,z：芯片内每个蛋白位点的 Z-Score 值；SD：所有 Ix,y,z 的标准差。筛选出两重复均满足 Z-Score 3 的蛋白，即为本次芯片实验检出的与样本有结合的蛋白13-15。2.4 组间比较通过韦恩分析对比试验组和对照组的结合蛋白，得到 NS1 组特异结合蛋白，分别计算这些蛋白在试验组与对照组内每种蛋白两重复 I 的均值 I Mean；根据各蛋白的 I Mean，计算试验组vs 对照组的组间比值 I Mean_Ratio16-17，筛选 I Mean_Ratio 1.4 的蛋白，获得试验组显著特异检出蛋白18。2.5 GO 及 KEGG Pathway 富集分析将试验组特异显著检出蛋白输入 DAVID网站，进行 GO 分析；通过metascape网站进行KEGG_PATHWAY分析，并利用 metascape 中的 MCODE 插件进行关键蛋白的筛选。3 实验结果3.1 NS1 蛋白浓度使用微量 BCA 试剂盒测定浓缩后的 NS1 蛋白浓度，测定结果显示滤出液中的 NS1 蛋白浓度为0.02 g L-1，置换后NS1蛋白浓度为0.67 g L-1，置换后体积为 50 L。3.2 与 NS1 结合的宿主蛋白的确认蛋白质芯片进行荧光扫描（图1），以 Z-Score3 为标准，通过 HuProtTM 20K 芯片对与 NS1 结合的蛋白进行检验。检验结果显示与 NS1 样本互作的宿主蛋白有 217 个，与 Biotin 样本互作的蛋白有 154个。通过组间比较发现这 2 组样本有14 个共同的结合蛋白，NS1 特异结合的蛋白有 203 个（图 2）。以I Mean_Ratio 1.4 为标准进一步获得与 NS1 样本显著特异结合的蛋白，共有 195 个。图1 蛋白芯片荧光扫描Figure 1 Fluorescence scanning images of protein microarray图 2 NS1组和 Biotin 组检出蛋白对比Figure 2 Comparison of proteins detected in NS1 group and Biotin group3.3 GO 及 KEGG Pathway 富集分析对显著特异性检出的 195 个蛋白分别进行 GO（Biological Process，Molecular Function，Cellular Component）、KEGG_PATHWAY 分析并选取-log10（P value）值最大的 15 条绘制图像（若总条目数不足 15，则全部展示），-log10（P value）越大说明功能富集越显著。GO分析结果显示这些蛋白参与了端粒的正向调控，肌动蛋白聚合或解聚，mRNA 加工等生物学过程，分子功能学分类主要包括了RNA 结合，蛋白结合，核酸结合等。这些蛋白主要存在于细胞核，线粒体以及细胞质等部位（图 3）。KEGG_PATHWAY分析结果如图 4 所示，左侧是参与各条通路的蛋白情况，右侧是显示各通路的P 值及参与蛋白数量多少的气泡图，提示这些蛋白主要参与了RNA 降解，氨基酸的生物合成，谷胱甘肽代谢以及沙门氏菌感染等通路，其中以 RNA 降解通路的功能富集最显著。在参与通路的这些蛋白中，NFKBIB、MAPK1、PFKP 这 3 个蛋白参与的通路数最多，均为 3 条。中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.1433.4 关键靶点的确认为了进一步研究 195 个结合蛋白之间的相互作用关系以及寻找出可能用于拮抗 NS1蛋白并成为潜在药物靶点的宿主蛋白，通过metascape 分析了195 个蛋白之间的相互作用，并利用 MCODE 插件分析了结合蛋白相互作用组的高度连接区域，进行核心蛋白筛选。结果显示 Cluster 1 的 MCODE 分数为 4，Cluster 2 的MCODE分数为 3.5，Cluster 3和 Cluster 4 的MCODE 分数均为 3，提示 DDX6，HSPD1，PKLR，MTHFD1等蛋白可能是关键靶点（图 5）。4 讨论流感病毒蛋白 NS1可以促进流感病毒的感染，研究显示其机制可能是在病毒感染时抑制宿主IFN-I 的产生，从而拮抗宿主的抗病毒反应，除此之外，NS1 还可以对病毒和宿主的 RNA 进行调控，NS1蛋白可以调控流感病毒 RNA 的合成以及转录、复制的平衡，抑制被感染细胞自身的 mRNA 的合成转录过程19。NS1 通过与 mRNA 的 Poly（A）尾和CPSF30 结合显著抑制宿主前体 mRNA 的切割和多聚腺苷酸化，并且 NS1 还可以与 mRNA 成熟过程中涉及的核因子发生相互作用从而阻断细胞 mRNA 的剪接和核质输出20-21。这种对病毒自身 mRNA 和宿主 mRNA 不同的调节机制可能是由于剪接机制不同，使病毒 mRNA 对 NS1 抑制免疫22。蛋白质芯片也称为蛋白质微阵列（protein micro-array），可用于分析蛋白质的相互作用以及蛋白质功能研究等方面，具有高通量、高效率等特点23。其原理是将各种蛋白质有序地固定在载体上，然后用荧光标记的蛋白与芯片上的蛋白质结合，洗去未能成功结合的蛋白后，通过激光共聚焦显微扫描仪或荧图 3 NS1蛋白显著特异性结合蛋白 GO 分析Figure 3 GO analyses of NS1-specific binding proteins图 4 与 NS1蛋白显著特异性结合蛋白 KEGG Pathway 分析Figure 4 KEGG Pathway analyses of NS1-specific binding proteins中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.144光扫描仪对芯片进行高通量检测和分析24。本实验使用 Biotin 对NS1蛋白进行标记，以检测后续芯片中与NS1结合的蛋白。本研究通过对与NS1结合的195 个蛋白进行 GO和 KEGG 分析，结果显示功能富集显著靠前的几条结果，如生物学功能分析（biological process）中的 mRNA加工，分子功能分析（molecular function）中的 RNA结合、蛋白结合、核酸结合，以及 KEGG_PATHWAY分析结果中的 RNA 降解、氨基酸的生物合成均与RNA 的合成、转录、翻译有关。提示 NS1 蛋白可能主要通过与 RNA 有关的宿主蛋白相互作用从而发挥促病毒感染的功能。通过 MCODE 分析得到的关键蛋白 DDX6 是DEAD-box 解旋酶家族的成员，在单细胞真核生物和脊椎动物中高度保守，与 mRNA 前体加工、RNA降解、翻译抑制和转录调控等过程有关。现有研究表明DDX6 参与了几种RNA病毒的生命周期调节25。DDX6 可以通过促进丙型肝炎病毒（HCV）RNA 基因组的翻译和复制来促进 HCV 感染26-27；DDX6 还可以与登革热病毒（DENV）的RNA 3 UTR 结合，从而影响RNA的翻译、蛋白复制和组装过程28。除了通过调控一些病毒 RNA 来促进病毒复制之外，DDX6 还可以通过调节 RIG-I29以及细胞的自噬性30来发挥作用。值得注意的是 DDX6 在不同的细胞及病毒感染作用下的功能反应可能是不同的，其在流感病毒感染过程中的作用还需要进一步的研究。3 个筛选出来的关键蛋白HSPD1、PKLR、MTHFD1虽然与 RNA合成等过程无关，但有研究显示他们均在病毒感染或宿主抗病毒过程中发挥作用。在蝙蝠细胞上进行全基因组正交筛选，分析发现 MTHFD1可能在流感病毒、SARS-CoV-2 等病毒感染过程中发挥重要作用，使用 MTHFD1 抑制剂 Carolacton可以有效地阻断几种 RNA 病毒的复制31。通过差异共表达网络分析，HSPD1 在新冠轻、重症患者以及健康人之间的差异蛋白互作网络中处于关键位置32。PKLR可能与防止 HCV、HBV 和潜在的其他病毒感染有关33。综上，本研究通过蛋白芯片筛选出了与流感病毒 NS1 结合的宿主蛋白，通过 GO、KEGG 通路分析确定了结合蛋白显著富集到了与 RNA 合成、加工、转录等相关的生物学功能及通路上，MCODE 分析确定了DDX6、HSPD1、PKLR、MTHFD1可能作为关键蛋白，但具体的作用机制还需后续的实验进行验证。参考文献1 REN RQ,ZHOU L,NI DX.An overview on the history of global influenza pandemicsJ.Chin J Epidemiol(中华流行病学杂志),2018,39(8):1021-1027.2 HAN J.Discovery of novel anti-influenza virus lead compounds via structure-based drug design and phenotypic ScreeningD.Jinan:Shandong University,2022.3 YAO D,BAO L,LI F,et al.H1N1 influenza virus dose dependent induction of dysregulated innate immune responses and STAT1/3 activation are associated with pulmonary immunopathological damageJ.Virulence,2022,13(1):1558-1572.4 WU X,BAO L,HU Z,et al.Ficolin a exacerbates severe H1N1 influenza virus infection-induced acute lung immunopathological injury via excessive complement activationJ.Cell Mol Immunol,2021,18(9):2278-2280.5 CILLONIZ C,PANTIN-JACKWOOD MJ,NI C,et al.Lethal dissemination of H5N1 influenza virus is associated with dysregulation of inflammation and lipoxin signaling in a mouse model of infectionJ.J Virol,2010,84(15):7613-7624.（下转第 50页）图 5 与 NS1蛋白显著特异性结合蛋白 PPI 及 MCODE 分析Figure 5 PPI and MCODE analyses of NS1-specific binding proteins中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.150成分，参与感知病毒感染16，并激活下游信号调节物MyD88 调节机体发挥抗病毒作用。基于此，对 TLR4和 MyD88 蛋白进行蛋白免疫印迹分析，实验结果显示，与正常对照组相比，模型组TLR4、MyD88蛋白表达显著增加；与模型组相比，预防给药组显著下调TLR4、MyD88蛋白表达，提示疏风解毒胶囊可能是通过下调 TLR4 和 MyD88 的蛋白表达发挥作用。综上所述，疏风解毒胶囊预防性给药对流感病毒感染小鼠的保护作用可能与降低肺组织核酸表达量，减轻肺组织病理损伤、炎症损伤，以及下调TLR4 和 MyD88 的蛋白表达等作用有关。参考文献1 DU DD,LIU B,SHI W,et al.Analysis of influenza pathogen surveillance in Ankang from 2016 to 2018 J.J Med Pest Control(医学动物防制),2020,36(11):1038-1041.2 FU YJ.Effects of different traditional Chinese medicines on TLR7/NF-B signaling pathway in mice infected with influenza virus FM1 in normal environment and damp-heat environmentD.Guangzhou:Jinan University,2021.3 JIN Y.Research on the evolution of major subtypes in influenza A virusD.Beijing:Academy of Military Sciences,2015.4 WEI X,NARASIMHAN H,ZHU B,et al.Host 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