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第 43 卷第 1 期2024 年 1 月中 国 野 生 植 物 资 源Chinese Wild Plant ResourcesVol.43 No.1Jan.2024基于代谢组学的两种罗布麻叶片类黄酮和酚酸成分分析张庆1，2，3，李国旗1，2，3*，车金凤1，2，3，赵长海1，2，3（1.宁夏大学 西北土地退化与生态恢复国家重点实验室培育基地，宁夏 银川 750021；2.宁夏大学 西北退化生态系统恢复与重建教育部重点实验室，宁夏 银川 750021；3.宁夏大学 生态环境学院，宁夏 银川 750021）摘要 目的：类黄酮和酚酸物质是罗布麻中主要的活性物质，鉴定不同罗布麻品种中类黄酮和酚酸代谢物成分并比较代谢物含量差异，为有效利用罗布麻属药用资源提供理论依据。方法：以罗布麻和大麻状罗布麻叶片为材料，利用液相色谱质谱联用技术（LC-MS）检测次级代谢物成分并进行分析。结果：2种罗布麻中共检测出275种类黄酮和194种酚酸物质；PCA分析表明2种罗布麻的代谢物种类相似，但含量存在较大差异，结合OPLS-DA筛选出124种显著差异代谢物，其中有80种类黄酮和44种酚酸；富集分析发现，共有10条代谢通路被显著富集，主要体现在苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成以及黄酮和黄酮醇生物合成等途径。结论：2种罗布麻药用成分种类相似，可为大麻状罗布麻作为药用植物开发提供理论依据。关键词 罗布麻；大麻状罗布麻；代谢组学；类黄酮；酚酸中图分类号：Q946 文献标识码：A 文章编号：1006-9690（2024）01-0001-10Analysis of Favonoids and Phenolic Acids in Two Apocynum venetum Leaves by Widely-Targeted MetabolomicsZhang Qing1，2，3，Li Guoqi1，2，3*，Che Jinfeng1，2，3，Zhao Changhai1，2，3（1.Breeding Base for State Key Lab.of Land Degradation and Ecological Restoration in Northwest China，Ningxia University，Yinchuan 750021，China；2.Key Lab.of Restoration and Reconstruction of Degraded Ecosystems in Northwest China of Ministry of Education，Ningxia University，Yinchuan 750021，China；3.College of Ecology and Environment，Ningxia University，Yinchuan 750021，China）Abstract Objective：Flavonoid and phenolic acid substances are the main active substances in Apocynum venetum.To identify components of flavonoid and phenolic acid metabolites in different A.venetum species and compare the differences in metabolite contents，so as to provide theoretical basis for effective utilization of A.venetum genus medicinal resources.Methods：The secondary metabolites were detected by liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS）in leaves of A.venetum and A.cannabinum.Results：275 flavonoids and 194 phenolic acids were detected in the two A.venetum.PCA analysis showed that there were differences in the metabolites of the two species of A.venetum，and 124 significantly different metabolites were screened in combination with OPLS-DA，including 80 flavonoids and 44 phenolic acids.The enrichment analysis revealed that a total of 10 metabolic pathways were significantly enriched，mainly reflected in the phenylpropane biosynthesis pathway，flavonoid biosynthesis pathway and flavonoid and flavonol biosynthesis pathway.Conclusion：The two species of A.venetum had similar types of medicinal components，providing a theoretical basis that A.cannabinum could be developed as a medicinal plant.Key words Apocynum venetum；Apocynum cannabinum；Metabolomics；Flavonoids；Phenolic acidsdoi：10.3969/j.issn.1006-9690.2024.01.001收稿日期：2023-02-01，录用日期：2023-12-04基金项目：宁夏重点研发项目（2022BEG03066）。作者简介：张庆（1997-），女，硕士，研究方向为植物生态学。E-mail：*通讯作者：李国旗（1965-），男，研究员，研究方向为植物生态学、土地退化与荒漠化防治。E-mail： 1中 国 野 生 植 物 资 源第 43 卷类黄酮和酚酸物质是广泛存在于植物中的次生代谢产物，在多种植物中发挥重要的作用。例如，类黄酮物质能够控制植物花色的形成1，提高植物抵御生物和非生物胁迫的能力等2。类黄酮和酚酸作为药用植物的主要活性成分，具有多种生物功能，对人体健康有益，如类黄酮等多酚具有抗氧化作用，可改善血管内皮功能、胰岛素分泌，有降血压作用3。大量实验数据证明了酚酸物质在心血管、癌症、糖尿病、炎症等疾病中的保护作用4-5。罗布麻（Apocynum venetum L.）为多年生宿根草本植物6，于 1997 年被 中华人民共和国药典 收录，有清热利湿、平肝安神等功效7。罗布麻叶提取物中的主要活性成分为类黄酮物质，如芦丁、金丝桃苷、异槲皮素、槲皮素、山柰酚等8-9。类黄酮和酚酸物质含量在不同的罗布麻品种之间差异较大10，此外，类黄酮含量还受到生长环境和采收季节等外在因素的影响1112。LC-MS广泛靶向技术结合了非靶向和靶向代谢组学的优点，可定性、定量和高覆盖地检测植物中代谢物的含量13，已广泛应用于各种植物的次生代谢物研究，如铁皮石斛中黄酮代谢机理14，紫外线对大豆异黄酮含量的影响15，不同葡萄品种在成熟过程中黄酮类化合物的差异研究16。然而目前对罗布麻中类黄酮和酚酸2种物质的代谢组学研究较少，鉴于此，本文拟研究罗布麻和大麻状罗布麻（Apocynum cannabinum A.DC.）17中的类黄酮和酚酸代谢物的种类和相对含量，分析2种罗布麻之间的代谢物质差异，以揭示类黄酮和酚酸的合成途径，为罗布麻的药用资源开发和利用提供理论依据。1材料与方法1.1样品种植及采集2021年4月于罗布麻试验田挖取繁殖根段，将根段每6个种植于长40 cm 宽30 cm 高40 cm花盆中，盆底部垫 2层纱布，覆盖的土壤质地为林下土 营养土（1 1），定期浇水施肥除草松土。待植株长至30 40 cm，选取长势良好且高度一致的植株中下部成熟叶片混合，每种植物 3个重复；置于10 mL冻存管中，并迅速放入液氮中冷冻，之后转至-80冰箱保存。1.2样品提取将样品置于冻干机（Scientz-100F）中真空冷冻干燥，随后用研磨仪（MM 400，Retsch）研磨至粉末状；每种样品称取100 mg粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中；每30 min将样品涡旋1次，每次持续30 s，共涡旋6次，之后将样品混合液置于4冰箱过夜；将样品离心后，吸取上清液，用微孔滤膜（孔径 0.22 m）过滤并保存于进样瓶中，用于 UPLC-MS/MS 分 析18。质 控 样 本（Quality control samples，QC）制备参照吴宇等19的方法，将所有样品提取液混合成QC样本，用于分析样本在相同处理方法下的重复性。在仪器的分析过程中，QC样本间隔固定的试验样本共同进行质谱测序，以检测分析过程的重复性。1.3数据分析基于迈维生物技术有限公司MWDB自建库和代谢物信息公共数据库，根据二级谱信息进行物质定性20-21。代谢物定量是利用三重四级杆质谱的多反应监测模式分析完成。将过滤处理后获得的代谢物质数据提交到 R上进行主成分分析（Principal components analysis，PCA）；根据正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLA-DA）模型分析代谢组数据。基于OPLA-DA结果，从获得的多变量分析OPLS-DA模型的变量重要性投影筛选2个品种之间的差异代谢物，筛选标准：选取 Fold Change 2 和 Fold Change 0.5且VIP 1的代谢物。将得到的相应差异代谢物提交到KEGG网站进行相关通路分析。2结果与分析2.1样品质控对不同 QC 质谱检测分析的总离子流图（TIC图）进行重叠展示分析，可以判断代谢物提取和检测的重复性，即技术重复。如图1所示，TIC图曲线重叠性高，质谱峰保留时间和强度一致，说明仪器稳定性较好，检测结果可靠。将所获得的代谢物高分辨二级质谱数据与公共数据库进行比对，在罗布麻和大麻状罗布麻中共检测到194种酚酸物质和275种类黄酮物质。进一步将检出的类黄酮进行分类，包括黄酮醇、黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮、花青素、黄酮碳糖苷、查耳酮、黄烷醇类、二氢异黄酮10类。2.2代谢物多元统计分析对所有样本进行 PCA 分析，结果如图 2所示。第一主成分值为56.43%，第二主成分值为14.80%；仅观察横坐标时，罗布麻样品均位于PC1负半轴，大麻状罗布麻样品均位于 PC1正半轴。大麻状罗 2第 1 期张庆，等：基于代谢组学的两种罗布麻叶片类黄酮和酚酸成分分析布麻样品3与大麻状罗布麻样品1、2间存在轻微的分散，而罗布麻的3个样品生物学重复间的差异较小。总体可见，2种罗布麻的代谢物能够得到区分，组间差异大于组内差异。PCA分析是一种无监督的分析方法，缺点是不能忽略组内误差。为排除与实验无关的某些因素引起的代谢变化，应用有监督的OPLS-DA模型进行进一步分析21。对2种罗布麻的代谢物进行OPLS-DA分析，结果如图3所示。罗布麻和大麻状罗布麻样品主要分布置性区间的右侧和左侧，说明该模型能够对2种罗布麻样品进行有效区分。Q2代表模型的预测能力，Q2 0.9表明模型具有很好的预测能力和可靠性。通过对2种罗布麻叶片代谢物进行OPLS-DA分析可得R2X=0.582，R2Y=0.991，Q2=0.954，说明OPLS-DA模型效果相较于PCA更稳定可靠。2.3代谢物分析2.3.1类黄酮物质分析在 2种罗布麻中共检测到 275种类黄酮物质，包括121种黄酮醇类、49种黄酮类、30种二氢黄酮类、16种二氢黄酮醇类、13种异黄酮类、13种花青素、12种黄酮碳糖苷、11种查耳酮、9种黄烷醇类和1种二氢异黄酮类物质。罗布麻和大麻状罗布麻的主要类黄酮代谢产物（每种罗布麻类黄酮物质含量前30）如表1 2所示。对2种罗布麻中类黄酮物质进行归一化处理，如图4A所示。罗布麻和大麻状罗布麻的类黄酮物质含量明显被区分为两类，说明类黄酮物质含量在2种罗布麻中有明显差异。表 1罗布麻中的主要类黄酮物质Tab.1The main flavonoids in A.venetum306.07550.10M-H-M+H+表没食子儿茶素 Epigallocatechin槲皮素-7-O-（6-丙二酰）葡萄糖苷Quercetin-7-O-（6-malonyl）glucoside黄烷醇类黄酮醇C15H14O7C24H22O15质核比（m/z）离子模式物质名称二级分类分子式图1TIC重叠图Fig.1TIC overlay diagram注：A：正离子模式下；B：负离子模式下。图22种样品的PCA得分图Fig.2PCA scores plot of two samples图32种样品的OPLS-DA得分图Fig.3OPLS-DA scores plot of two samples 3中 国 野 生 植 物 资 源第 43 卷550.10290.08436.14436.14464.13464.10478.08566.09490.11479.08506.11534.10564.09564.11564.11626.15506.11434.12434.12300.10626.15434.12464.10464.10478.11478.11490.11480.09M-H-M+H+M-H-M-H-M-H-M-H-M+H+M+H+M-H-M+M+H+M+H+M+H+M+H+M+H+M+H+M-H-M-H-M-H-M-H-M+H+M-H-M-H-M-H-M+H+M+H+M+H+M-H-槲皮素-3-O-（6-丙二酰）半乳糖苷Quercetin-3-O-（6-malonyl）galactoside表儿茶素 Epicatechin根皮苷 Phlorizin二氢查尔酮-4-O-葡萄糖苷Dihydrocharcone-4-O-glucoside橙皮素-5-O-葡萄糖苷Hesperetin-5-O-glucoside槲皮素-7-O-葡萄糖苷Quercetin-7-O-glucoside槲皮素-5-O-葡萄糖醛酸苷 Quercetin-5-O-glucuronide杨梅素-3-O-（6-丙二酰）葡萄糖苷Myricetin-3-O-（6-malony）glucoside山奈酚-3-O-（6-O-乙酰）葡萄糖苷Kaempferol-3-O-（6-acetyl）glucoside飞燕草素-3-O-葡萄糖醛酸苷Delphinidin-3-O-glucuronide槲皮素-3-O-（6-乙酰）葡萄糖苷Quercetin-3-O-（6-acetyl）glucoside山奈酚-3-O-（6-丙二酰）半乳糖苷Kaempferol-3-O-（6-malonyl）galactoside异鼠李素-3-O-（6-丙二酰）葡萄糖苷Isorhamnetin-3-O-（6-malonyl）glucoside）柽柳黄素-3-O-（6-丙二酰）葡萄糖苷Tamarixetin-3-O-（6-malonyl）glucoside3-O-甲基五羟黄酮-7-O-（6-丙二酰）葡萄糖苷3-O-Methyltricetin-7-O-（6-malonyl）glucoside槲皮素-3，7-双葡萄糖苷 Quercetin-3，7-diglucoside槲皮素-3-O-（6-乙酰）半乳糖苷Quercetin-3-O-（6-acetyl）galactoside柚皮素-4-O-葡萄糖苷Naringenin-4-O-glucoside紫铆素-7-O-葡萄糖苷Butin-7-O-glucoside4-羟基-5，7-二甲氧基黄酮4-Hydroxy-5，7-dimethoxyflavanone6-羟基山奈酚-7，6-O-二葡萄糖苷6-Hydroxykaempferol-7，6-O-diglucoside樱桃苷Prunin6-羟基木犀草素-5-葡萄糖苷6-Hydroxyluteolin 5-glucoside绣线菊苷Spiraeoside6-甲氧基山奈酚-3-O-葡萄糖苷6-Methoxykaempferol-3-O-glucoside蔓菁苷Brassicin山奈酚-3-O-（2-O-乙酰）葡萄糖苷Kaempferol-3-O-（2-acetyl）glucoside杨梅素-3-O-葡萄糖苷Myricetin-3-O-glucoside黄酮醇黄烷醇类查耳酮查耳酮二氢黄酮黄酮醇黄酮醇黄酮醇黄酮醇花青素黄酮醇黄酮醇黄酮醇黄酮醇黄酮黄酮醇黄酮醇二氢黄酮二氢黄酮二氢黄酮黄酮醇二氢黄酮黄酮黄酮醇黄酮醇黄酮醇黄酮醇黄酮醇C24H22O15C15H14O6C21H24O10C21H24O10C22H24O11C21H20O12C21H18O13C24H22O16C23H22O12C21H19O13+C23H22O13C24H22O14C25H24O15C25H24O15C25H24O15C27H30O17C23H22O13C21H22O10C21H22O10C17H16O5C27H30O17C21H22O10C21H20O12C21H20O12C22H22O12C22H22O12C23H22O12C21H20O13续表质核比（m/z）离子模式物质名称二级分类分子式表 2大麻状罗布麻中的主要类黄酮物质Tab.2The main flavonoids in A.cannabinum306.07594.16478.08M-H-M-H-M+H+表没食子儿茶素 Epigallocatechin烟花苷 Nicotiflorin槲皮素-5-O-葡萄糖醛酸苷 Quercetin-5-O-glucuronide黄烷醇类黄酮醇黄酮醇C15H14O7C27H30O15C21H18O13质核比（m/z）离子模式物质名称二级分类分子式 4第 1 期张庆，等：基于代谢组学的两种罗布麻叶片类黄酮和酚酸成分分析479.08462.36626.15594.52611.14626.15610.15462.08448.10464.13448.10626.15448.10610.15448.10594.16610.15594.16595.15464.10610.15611.14610.15610.15490.11300.10448.10M+M+H+M+H+M+H+M+M+H+M+H+M+H+M+H+M-H-M+H+M+H+M+H+M+H+M+H+M+H+M+H+M+H+M+M-H-M+H+M+M+H+M+H+M-H-M-H-M-H-飞燕草素-3-O-葡萄糖醛酸苷Delphinidin-3-O-glucuronide野黄芩苷Scutellarin6-羟基山奈酚-7，6-O-二葡萄糖苷6-Hydroxykaempferol-7，6-O-diglucoside山柰酚-3-葡萄糖鼠李糖苷Kaempferol-3-O-glucorhamnoside矢车菊素-3-O-（6-O-咖啡酰）葡萄糖苷Cyanidin-3-O-（6-O-caffeoyl）glucoside白麻苷Baimaside山奈酚-3，7-二-O-葡萄糖苷Kaempferol-3，7-di-O-glucoside木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷 Luteolin-7-O-glucuronide木犀草素-3-O-葡萄糖苷 Luteolin-3-O-glucoside橙皮素-5-O-葡萄糖苷 Hesperetin-5-O-glucoside黄芪苷 Astragalin槲皮素-3，7-双葡萄糖苷 Quercetin-3，7-diglucoside木犀草素-4-O-葡萄糖苷 Luteolin-4-O-glucoside木犀草素-7-O-龙胆双糖苷 Luteolin-7-O-gentiobioside山奈酚-4-O-葡萄糖苷 Kaempferol-4-O-glucoside山奈酚-3-O-新橙皮糖苷Kaempferol-3-O-neohesperidoside槲皮素 7-O-芸香糖苷Quercetin-7-O-rutinoside山奈酚-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷Kaempferol-3-O-glucoside-7-O-rhamnoside矢车菊素-3-O-（6-O-对香豆酰）葡萄糖苷Cyanidin-3-O-（6-O-p-coumaroyl）glucoside槲皮素-7-O-葡萄糖苷Quercetin-7-O-glucoside槲皮素 3-O-新橘皮糖苷Quercetin-3-O-neohesperidoside飞燕草素-3-O-（6-O-对香豆酰）葡萄糖苷Delphinidin-3-O-（6-O-p-coumaroyl）glucoside槲皮素-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷Quercetin-3-O-glucoside-7-O-rhamnoside槲皮素-3-O-（4-O-葡萄糖基）鼠李糖苷Quercetin-3-O-（4-O-glucosyl）rhamnoside山奈酚-3-O-（6-O-乙酰）葡萄糖苷Kaempferol-3-O-（6-acetyl）glucoside4-羟基-5，7-二甲氧基黄酮4-Hydroxy-5，7-dimethoxyflavanone山奈酚-7-O-葡萄糖苷Kaempferol-7-O-glucoside花青素黄酮黄酮醇黄酮醇花青素黄酮醇黄酮醇黄酮黄酮二氢黄酮黄酮醇黄酮醇黄酮黄酮黄酮醇黄酮醇黄酮醇黄酮醇花青素黄酮醇黄酮醇花青素黄酮醇黄酮醇黄酮醇二氢黄酮黄酮醇C21H19O13+C21H18O12C27H30O17C27H30O15C30H27O14+C27H30O17C27H30O16C21H18O12C21H20O11C22H24O11C21H20O11C27H30O17C21H20O11C27H30O16C21H20O11C27H30O15C27H30O16C27H30O15C30H27O13+C21H20O12C27H30O16C30H27O14+C27H30O16C27H30O16C23H22O12C17H16O5C21H20O11续表质核比（m/z）离子模式物质名称二级分类分子式2.3.2酚酸物质分析在罗布麻和大麻状罗布麻叶片中共检测到194 种酚酸物质，主要的酚酸代谢产物（每种罗布麻酚酸物质含量前 30）如表 3 4 所示。聚类热图可以直观的反应 2 种罗布麻间物质含量的差异，对检测到的所有酚酸物质进行聚类分析，如图 4B 所示，酚酸物质含量在 2 种罗布麻中有明显差异。5中 国 野 生 植 物 资 源第 43 卷表 3罗布麻中的主要酚酸物质Tab.3The main phenolic acids in A.venetum478.15139.03300.08300.09368.11354.10354.10122.07330.13330.10316.08390.28316.08121.05300.09368.11316.12368.11372.11450.21354.10330.10338.10338.10386.12516.13M-H-M+H+M-H-M-H-M+H+M-H-M-H-M+H-H2O+M-H-M-H-M-H-M+H+M-H-M+H+M-H-M-H-M-H-M+H+M-H-M-H-M-H-M-H-M-H-M-H-M-H-M-H-1-O-（3，4-二羟基苯乙基）-O-咖啡酰基-葡萄糖苷1-O-（3，4-dihydroxyphenethyl）-O-caffeoyl-glucoside4-硝基苯酚 4-Nitrophenol1-O-水杨酰-D-葡萄糖 1-O-salicyl-D-glucose葡萄糖氧基苯甲酸 Glucosyloxybenzoic acid1-O-阿魏酰奎宁酸 1-O-feruloylquinic acid隐绿原酸 Cryptochlorogenic acid绿原酸 Chlorogenic acid2-苯乙醇2-Phenylethanol3，4，5-三甲氧基苯基-1-O-葡萄糖苷3，4，5-Trimethoxyphenyl-1-O-glucoside5-葡萄糖氧基-2-羟基苯甲酸甲酯5-Glucosyloxy-2-hydroxybenzoic acid methyl ester1-O-龙胆酰-D-葡萄糖1-O-gentisoyl-D-glucoside二（2-乙基己基）邻苯二甲酸酯Bis（2-ethylhexyl）phthalate原儿茶酸-4-O-葡萄糖苷Protocatechuic acid-4-O-glucoside苯甲酰胺Benzamide水杨酸-2-O-葡萄糖苷Salicylic acid-2-O-glucoside绿原酸甲酯Chlorogenic acid methyl ester香草醇苷Vanilloloside3-O-阿魏酰奎宁酸 3-O-feruloylquinic acid三羟基肉桂酰奎宁酸Trihydroxycinnamoylquinic acid银杏糖苷 A Ginkgoside A新绿原酸Neochlorogenic acid1-O-香草酰-D-葡萄糖1-O-vanilloyl-D-glucose3-O-对香豆酰奎宁酸 3-O-p-coumaroylquinic acid*5-O-对香豆酰奎宁酸 5-O-p-coumaroylquinic acid*1-O-芥子酰-D-葡萄糖1-O-sinapoyl-D-glucose洋蓟酸 Cynarin酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类C23H26O11C6H5NO3C13H16O8C13H16O8C17H20O9C16H18O9C16H18O9C8H10OC15H22O8C14H18O9C13H16O9C24H38O4C13H16O9C7H7NOC13H16O8C17H20O9C14H20O8C17H20O9C16H20O10C20H34O11C16H18O9C14H18O9C16H18O8C16H18O8C17H22O10C25H24O12质核比（m/z）离子模式物质名称二级分类分子式图4代谢物聚类热图Fig.4Cluster heat map of metabolites注：A：类黄酮聚类热图；B：酚酸聚类热图；从蓝色到红色的颜色序列表明代谢物含量从低到高。6第 1 期张庆，等：基于代谢组学的两种罗布麻叶片类黄酮和酚酸成分分析498.12678.18280.06316.12M+H+M-H-M-H-M-H-二咖啡酰基莽草酸 Dicaffeoylshikimic acid二咖啡酰基奎宁酸-O-葡萄糖苷Dicaffeoylquinic acid-O-glucoside对香豆酰苹果酸p-Coumaroylmalic acid5-（2-羟乙基）-2-O-葡萄糖基苯酚5-（2-Hydroxyethyl）-2-O-glucosylphenol酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类C25H22O11C31H34O17C13H12O7C14H20O8续表质核比（m/z）离子模式物质名称二级分类分子式表 4大麻状罗布麻中的主要酚酸物质Tab.4The main phenolic acids in A.cannabinum质核比（m/z）122.07478.15139.03121.05390.28368.11354.10354.10368.11386.12338.10338.10300.09300.08330.10498.12338.10164.05368.11164.05368.11516.13316.08300.09194.06316.08354.10342.13194.06330.10离子模式M+H-H2O+M-H-M+H+M+H+M+H+M+H+M-H-M-H-M-H-M-H-M-H-M-H-M-H-M-H-M-H-M+H+M-H-M-H-M+H+M-H-2M-H-M-H-M-H-M-H-M-H-M-H-M-H-M-H-M-H-M+H+物质名称2-苯乙醇 2-Phenylethanol1-O-（3，4-二羟基苯乙基）-O-咖啡酰基-葡萄糖苷1-O-（3，4-dihydroxyphenethyl）-O-caffeoyl-glucoside4-硝基苯酚 4-Nitrophenol苯甲酰胺 Benzamide二（2-乙基己基）邻苯二甲酸酯Bis（2-ethylhexyl）phthalate1-O-阿魏酰奎宁酸 1-O-feruloylquinic acid隐绿原酸 Cryptochlorogenic acid绿原酸 Chlorogenic acid绿原酸甲酯 Chlorogenic acid methyl ester1-O-芥子酰-D-葡萄糖 1-O-sinapoyl-D-glucose3-O-对香豆酰奎宁酸 3-O-p-coumaroylquinic acid4-O-对香豆酰奎宁酸 4-O-p-coumaroylquinic acid葡萄糖氧基苯甲酸 Glucosyloxybenzoic acid1-O-水杨酰-D-葡萄糖 1-O-salicyl-D-glucose5-葡萄糖氧基-2-羟基苯甲酸甲酯5-Glucosyloxy-2-hydroxybenzoic acid methyl ester二咖啡酰基莽草酸Dicaffeoylshikimic acid5-O-对香豆酰奎宁酸 5-O-p-coumaroylquinic acid-羟基肉桂酸-Hydroxycinnamic acid3-O-阿魏酰奎宁酸 3-O-feruloylquinic acid2-羟基肉桂酸 2-Hydroxycinnamic acid5-O-阿魏酰奎尼酸 5-O-feruloylquinic acid洋蓟酸 Cynarin原儿茶酸-4-O-葡萄糖苷Protocatechuic acid-4-O-glucoside水杨酸-2-O-葡萄糖苷 Salicylic acid-2-O-glucoside异阿魏酸 Isoferulic acid1-O-龙胆酰-D-葡萄糖 1-O-gentisoyl-D-glucoside新绿原酸 Neochlorogenic acid松柏苷 Coniferin阿魏酸 Ferulic acid牡丹苷 A Mudanoside A二级分类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类酚酸类分子式C8H10OC23H26O11C6H5NO3C7H7NOC24H38O4C17H20O9C16H18O9C16H18O9C17H20O9C17H22O10C16H18O8C16H18O8C13H16O8C13H16O8C14H18O9C25H22O11C16H18O8C9H8O3C17H20O9C9H8O3C17H20O9C25H24O12C13H16O9C13H16O8C10H10O4C13H16O9C16H18O9C16H22O8C10H10O4C14H18O92.4差异代谢物筛选分析基于 OPLS-DA结果，根据差异代谢物筛选标准，筛选出差异代谢物，共得到124种差异显著代谢物质，其中包括类黄酮80种，酚酸44种。在大麻状罗布麻中，51种类黄酮物质含量高于罗布麻，差异最大的为染料木素-8-C-葡萄糖苷；在罗布麻中，29种类黄酮物质含量高于大麻状罗布麻，差异最大的为黄柏环合苷。在大麻状罗布麻中，22种酚酸物质 7中 国 野 生 植 物 资 源第 43 卷相对含量高于罗布麻，差异最大的为4-O-D-葡萄糖基-4-香豆酸；在罗布麻中，22种酚酸物质含量高于大麻状罗布麻，差异最大的为1-O-没食子酰-D-葡萄糖。根据以上分析结果，我们认为染料木素-8-C-葡萄糖苷、黄柏环合苷、4-O-D-葡萄糖基-4-香豆酸和 1-O-没食子酰-D-葡萄糖可作为鉴别这2种罗布麻品种的关键物质。2.5代谢通路分析利用KEGG数据库对2个品种罗布麻间的差异代谢物进行注释，并进行功能富集，结果如图 5所示，富集分析共标注到10个代谢通路中，分别是泛醌和其他萜类奎宁的生物合成、酪氨酸代谢、芪类，二芳基庚烷和姜酚的生物合成、苯丙烷生物合成、代谢途径、类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、次级代谢物生物合成、辅酶因子生物合成和花青素生物合成。这些差异代谢物参与一个或多个代谢途径，如：忍冬苷、白麻苷和槲皮苷等均参与了黄酮和黄酮醇生物合成；根皮苷查耳酮和黄颜木素等参与了类黄酮生物合成；芥子酰苹果酸和1-O-芥子酰-D-葡萄糖等参与了苯丙烷生物合成；龙胆酸和红景天苷等参与了酪氨酸代谢途径；反式-5-O-对香豆酰莽草酸和5-O-咖啡酰莽草酸参与了苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成、芪类，二芳基庚烷和姜酚生物合成、代谢途径和次级代谢物生物合成；表儿茶素和花旗松素参与了类黄酮合成、代谢途径和次级代谢物生物合成。对差异代谢物KEGG代谢途径进行注释，结果如图6所示，发现大部分代谢物富集到黄酮和黄酮醇生物合成、类黄酮生物合成和苯丙烷生物合成这3条途径中。大麻状罗布麻中的木犀草苷、白麻苷、芦丁、烟花苷、忍冬苷、槲皮素-3-O-桑布双糖苷、反式-5-O-对香豆酰莽草酸、5-O-咖啡酰莽草酸和对香豆醇含量均高于罗布麻，罗布麻中的根皮苷和黄颜木素含量高于大麻状罗布麻。类黄酮物质因具有抗氧化、清除自由基和抑菌等药用价值而受到广泛关注，一定程度上可认为这3条代谢途径对于罗布麻的药用价值具有重要意义，代谢通路中涉及到图5差异代谢物KEGG富集通路Fig.5Enriched KEGG pathways of differentially expressed metabolites注：点的颜色反映P值大小，越红表示富集越显著；点的大小代表富集到的差异代谢物的个数多少。图6差异代谢物的生物合成途径Fig.6Biosynthetic pathways of differential metabolites注：不同颜色实心圆点代表不同的代谢途径；红色字体代表大麻状罗布麻中含量较多；绿色字体代表罗布麻中含量较多；黑色字体代表含量变化不明显；黑色带箭头实线表示直接作用于物质，带箭头虚线表示间接作用于物质。8第 1 期张庆，等：基于代谢组学的两种罗布麻叶片类黄酮和酚酸成分分析的差异代谢物可作为区分2种罗布麻药用成分差异的重要依据。3讨论植物代谢组学具有覆盖范围广、灵敏度高和准确性高等特点，结合多元统计方法可揭示不同植物品种的代谢组分差异23-24。在本研究中，利用LC-MS广泛靶向代谢组检测技术分析了2个罗布麻品种中的类黄酮和酚酸代谢物的种类和差异，共检测出275种类黄酮和194种酚酸物质。检测到的代谢物数量远远超过其它检测方法25，表明 LC-MS代谢组测序技术更为灵敏，是鉴定药用植物活性成分的有力工具，为药用植物研究提供了新思路和新方法。中国药典 以槲皮素和山柰酚为对照品，金丝桃苷为测定指标，用薄层色谱法来鉴别供试品7。石秋梅等26通过比较罗布红麻和罗布白麻叶中的芦丁、金丝桃苷及异槲皮苷这3种类黄酮成分含量的差异，评价了这2种罗布麻的功效。而在本研究中，2种罗布麻的这3种物质含量无显著差异，用中国药典质量控制法来鉴别这2种罗布麻存在一定局限性。我们通过LC-MS检测发现染料木素-8-C-葡萄糖苷、黄柏环合苷、4-O-D-葡萄糖基-