SN∕T 5385-2021 蓝莓焦枯病毒检疫鉴定方法.pdf

I C S6 5.0 2 0C C SB1 6中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 3 8 52 0 2 1 蓝莓焦枯病毒检疫鉴定方法D e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f B l u e b e r r y s c o r c h v i r u s2 0 2 1-0 6-1 8发布2 0 2 2-0 1-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准蓝莓焦枯病毒检疫鉴定方法S N/T 5 3 8 52 0 2 1*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(1 0 0 0 2 3)编辑部:(0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2-7 5 3 1网址 www.c u s t o m s k b.c o m/b o o k中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本8 8 01 2 3 0 1/1 6 印张1 字数3 0千字2 0 2 1年 月第一版 2 0 2 1年 月第一次印刷印数 15 0 0*书号:1 5 5 1 7 56 7 3 定价1 6.0 0元前 言本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国福州海关、福建省农业科学院果树研究所、中国农业科学院生物技术研究所、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门海关、福建农林大学。本文件主要起草人:沈建国、谢丽雪、陈细红、李韬、李为民、张永江、廖富荣、高芳銮、陈寿铃。S N/T5 3 8 52 0 2 1蓝莓焦枯病毒检疫鉴定方法1 范围本文件规定了蓝莓焦枯病毒的检疫鉴定方法。本文件适用于可能携带蓝莓焦枯病毒的蓝莓繁殖材料的检疫鉴定。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法S N/T 2 1 2 2 进出境植物及植物产品检疫抽样3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 蓝莓焦枯病毒基本信息中文名:蓝莓焦枯病毒。学名:B l u e b e r r y s c o r c h v i r u s,缩写:B l S c V。分类地位:乙型线状病毒科(B e t a f l e x i v i r i d a e)、香石竹潜隐病毒属(C a r l a v i r u s)成员。蓝莓焦枯病毒的寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等其他信息参见附录A。5 原理蓝莓焦枯病毒的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。6 仪器设备、用具及试剂6.1 仪器设备高速冷冻离心机、电子天平、酶标仪、P C R仪、荧光P C R仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、水平电泳槽、常规冰箱、超低温冰箱、恒温水浴锅、高压灭菌锅、研磨仪等。6.2 用具各种量程的可调移液器(1 0 0 0 L、2 0 0 L、1 0 0 L、2 0 L、1 0 L、2 L)、P C R反应管、无R N a s e离心管(1.5 m L)、研钵、酶联板等。1S N/T5 3 8 52 0 2 16.3 试剂除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合G B/T 6 6 8 2中相关规定。双抗体夹心酶联免疫吸附测定(D A S-E L I S A)试剂应符合附录B的规定、免疫层析试纸条试剂应符合附录C的规定、巢式R T-P C R试剂应符合附录D的规定、实时荧光R T-P C R试剂应符合附录E的规定。7 检测与鉴定7.1 抽样检查按照S N/T 2 1 2 2给出的方法进行抽样、取样,尽量抽取有病毒危害症状的植物样品,B l S c V的危害症状描述参见附录A。7.2 样品制备称取0.5 g 1.0 g待测样品按11 0(质量体积,W/V)加入抽提缓冲液研磨,4 下1 0 0 0 0 g离心1 0 m i n,上清即为样品提取液,用于D A S-E L I S A、免疫层析试纸条、巢式R T-P C R和实时荧光R T-P C R检测。7.3 D A S-E L I S A具体方法按附录B检测。7.4 免疫层析试纸条具体方法按附录C检测。7.5 巢式R T-P C R具体方法按附录D检测。7.6 实时荧光R T-P C R具体方法按附录E检测。7.7 序列测定与比对P C R产物纯化后,直接测序或者克隆测序,利用N C B I网站上的B L A S T软件把测序所得到的核苷酸序列与已知B l S c V序列进行比对。8 结果判定样品检测时,检测结果判定按下述原则进行。血清学检测(D A S-E L I S A或免疫层析试纸条)初筛结果为阴性,且巢式R T-P C R或实时荧光R T-P C R方法检测结果为阴性,则判定样品不携带B l S c V。血清学检测(D A S-E L I S A或免疫层析试纸条)初筛结果为阳性,则采用巢式R T-P C R或实时荧光R T-P C R方法进行验证。若验证结果为阳性,则判定样品携带B l S c V;若验证结果为阴性,则判定样品不携带B l S c V。巢式R T-P C R检测结果为阳性,且测定的序列为B l S c V序列,则判定样品携带B l S c V。巢式R T-P C R检测结果为阳性,且实时荧光R T-P C R检测结果为阳性,则判定样品携带2S N/T5 3 8 52 0 2 1B l S c V。9 结果记录与样品保存9.1 结果记录记录好各项实验数据,包括样品来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并要有经手人和实验人员的签字。D A S-E L I S A检测结果保留吸光值数据报告;免疫层析试纸条保留试纸条检测图片;巢式R T-P C R保留电泳照片;实时荧光R T-P C R保留实时荧光结果图片;序列测定保留电子文件。9.2 样品保存经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在-2 0 或-8 0 冰箱中,并做好登记和标记工作,以备复核用。3S N/T5 3 8 52 0 2 1附 录 A(资料性)蓝莓焦枯病毒的背景资料A.1 寄主范围目前已报道的自然寄主仅为蓝莓(V a c c i n i u m s p p.)。A.2 病害症状受B l S c V侵染的大多数蓝莓品种在开花时期突然出现花和叶片枯萎症状(图A.1),症状严重时导致果实小或不结果,但在少数蓝莓品种上呈隐症现象。蓝莓感染B l S c V后1年2年出现症状,开始12个枝条,最后蔓延至全株发病。注:引自h t t p:/www.w h a t c o m.w s u.e d u/i p m/b l u e/s c o r c h.h t m l。图A.1 B l S c V侵染蓝莓引起的症状A.3 分布地区主要分布于美国、加拿大、荷兰、意大利、波兰等国家。A.4 传播途径主要通过蚜虫介体以非持久性方式传播。A.5 粒体形态病毒粒体呈线状,长约6 9 0 n m,直径约1 4 n m。A.6 病毒基因组正义单链R NA病毒,基因组全长约8.5 k b。4S N/T5 3 8 52 0 2 1附 录 B(规范性)双抗体夹心酶联免疫吸附测定(D A S-E L I S A)B.1 试剂B.1.1 包被抗体特异性的蓝莓焦枯病毒抗体。B.1.2 酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的蓝莓焦枯病毒抗体。B.1.3 底物对硝基苯磷酸二钠(pN P P)。B.1.4 1P B S T缓冲液(p H 7.4)氯化钠(N a C l)8.0 g磷酸二氢钾(KH2P O4)0.2 g磷酸氢二钠(N a2HP O4)1.1 5 g氯化钾(K C l)0.2 g吐温-2 0(T w e e n-2 0)0.5 mL溶于9 0 0 mL灭菌双蒸水中,并定容至1 0 0 0 mL,4 储存。B.1.5 抽提缓冲液(p H 7.4)亚硫酸钠(N a2S O3)1.3 g聚乙烯基吡咯烷酮(P V P,MW 2 4 0 0 04 0 0 0 0)2 0.0 g溶于9 0 0 mL的1P B S T中,并用1P B S T定容至1 0 0 0 mL,4 储存。B.1.6 包被缓冲液(p H 9.6)碳酸钠(N a2C O3)1.5 9 g碳酸氢钠(N a HC O3)2.9 3 g溶于9 0 0 mL灭菌双蒸水中,并定容至1 0 0 0 mL,4 储存。B.1.7 酶标抗体稀释缓冲液(p H 7.4)牛血清白蛋白(B S A)2.0 g聚乙烯基吡咯烷酮(P V P,MW 2 4 0 0 04 0 0 0 0)2 0.0 g溶于9 0 0 mL 1P B S T中,并用1P B S T定容至1 0 0 0 mL,4 储存。B.1.8 底物缓冲液(p H 9.8)二乙醇胺9 7 mL氯化镁(M g C l2)0.1 g5S N/T5 3 8 52 0 2 1溶于8 0 0 mL灭菌双蒸水中,用浓盐酸(HC l)调p H至9.8,定容至1 0 0 0 mL,4 储存。B.2 程序B.2.1 包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释,加入酶联板的孔中,1 0 0 L/孔,加盖,3 7 孵育2 h或4 冰箱孵育过夜,倒去酶联板孔中溶液,按每孔1 0 0 L的量用P B S T洗涤4次6次,每次1 m i n。B.2.2 加样加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照和空白对照,并且至少一个重复,1 0 0 L/孔,加盖,3 7 孵育2 h或4 冰箱孵育过夜,倒去酶联板孔中溶液,按每孔1 0 0 L的量用 P B S T洗涤4次6次,每次1 m i n。阴性对照为健康的植物组织(其种类和材料应尽量与检测样品一致),阳性对照为感染B l S c V的植物组织,空白对照为样品抽提缓冲液。B.2.3 加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度,并加入到酶联板中,1 0 0 L/孔,加盖,3 7 孵育2 h,倒去酶联板孔中溶液,按每孔1 0 0 L的量用P B S T洗涤4次6次,每次1 m i n。B.2.4 加底物将底物N P P加入到底物缓冲液中使终浓度为1 m g/mL(现配现用),按1 0 0 L/孔,加入到酶联板中,室温避光孵育。B.2.5 读数阳性对照孔明显显色后,酶标仪在4 0 5 n m处读O D值。B.3 结果判定B.3.1 质量控制要求满足阴性对照孔的O D4 0 5值5;同一样品的重复性基本一致,数值差别2,判定为阳性;样品O D4 0 5值/阴性对照O D4 0 5值在阈值附近,判定为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加以验证;样品O D4 0 5值/阴性对照O D4 0 5值2,判定为阴性。注:若不满足B.3.1的质量控制要求,则不能进行结果判定。6S N/T5 3 8 52 0 2 1附 录 C(规范性)免疫层析试纸条检测C.1 试剂样品抽提缓冲液配制方法按照B.1.5执行。C.2 程序C.2.1 样品准备待测样品按7.2步骤制备,取3 0 0 L样品液至1.5 mL的离心管中。C.2.2 样品检测检测前将试纸条恢复至室温。将试纸条T线一端垂直插入到样品液中,样品液高度不要超过试纸条上的MA X线。测试观察的时间以3 m i n6 m i n为宜。注:若病毒浓度较低,样品测试观察的时间可适当延长至1 0 m i n。C.3 结果判定结果判定如下:质控C线显红色,测试T线显红色,检测结果为阳性;质控C线显红色,测试T线未显色,检测结果为阴性;质控C线和测试T线均未显色,说明试纸条失效,检测结果无效。C.4 试纸条是否有效的判断方法判断方法如下:用阳性对照进行测试,测试T线显红色,质控C线显红色,说明整个系统工作正常;用阳性对照进行测试,测试T线显红色,质控C线未显色,说明羊抗兔失效;用阳性对照进行测试,测试T线未显色,质控C线显红色,说明测试T线的特异性抗体失效;用阳性对照进行测试,若测试T线未显色,质控C线也未显色,说明整个测试纸条失效。7S N/T5 3 8 52 0 2 1附 录 D(规范性)巢式R T-P C R检测D.1 试剂D.1.1 T r i z o L试剂D.1.2 5T B E缓冲液T r i s碱 5 4.0 g 硼酸(H3B O3)2 7.5 g 0.5 m o l/L E D TA(p H 8.0)2 0.0 mL补充蒸馏水至1 0 0 0 mL。用时加蒸馏水稀释至0.5T B E。D.1.3 6加样缓冲液0.2 5%溴酚蓝4 0%(W/V)蔗糖水溶液。D.1.4 引物序列根据已报道的B l S c V外壳蛋白(C P)基因序列设计用于特异性扩增的半巢式引物。外侧正向引物B l S c V-F P 1:5-C T C AAG C C G C AG C G T C A C A-3内侧正向引物B l S c V-F P 2:5-G TA C C C A C C GAA C AAG T T G C-3反向引物B l S c V-R:5-C A C C AG T G TA C T C C G T T T C GAGA-3其中,B l S c V-F P 1/B l S c V-R引物对的目的片段大小为6 6 7 b p,B l S c V-F P 2/B l S c V-R引物对的目的片段大小为4 4 8 b p。D.2 巢式R T-P C R检测D.2.1 总R N A提取取样品提取液2 0 0 L放入1.5 mL离心管中,再加入1 mL T r i z o L试剂,剧烈振荡摇匀3 m i n;4 下1 2 0 0 0g离心1 0 m i n,取上清;加入三氯甲烷3 0 0 L,剧烈振荡1 5 s,室温静置5 m i n,4 下1 2 0 0 0g离心1 5 m i n,取上层水相;加入等体积的异丙醇,颠倒混匀后室温下静置1 5 m i n,4 下1 2 0 0 0g离心1 0 m i n,弃上清;加入1 mL 7 5%的乙醇洗涤沉淀2次,每次4 下7 5 0 0g离心3 m i n,弃上清;R NA沉淀干燥后,用2 0 L4 0 L经D E P C(焦碳酸二乙酯)处理过的d d H2O溶解,-8 0 保存备用。注:总R NA的提取也可以采用商品化试剂盒。D.2.2 c D N A合成在P C R管中加入3 L总R NA,1 L 随机引物(1 0 0 m o l/L)或1 L反向引物B l S c V-R,d d H2O 7 L,7 0 水浴1 0 m i n,迅速冰浴5 m i n,再加入下列试剂:5R T缓冲液5 L、d NT P s(1 0 mm o l/L)2 L、M-ML V R T(2 0 0 U/L)1 L、R N a s i n(4 0 U/L)1 L。4 2 水浴6 0 m i n,7 0 水浴1 0 m i n,自然冷却至室温,-2 0 保存备用。注:c D NA合成也可以采用商品化试剂盒。8S N/T5 3 8 52 0 2 1D.2.3 第1轮P C R扩增第1轮P C R反应体系见表D.1,每个反应设置2个重复。检测时以含有病毒目标片段的质粒或含病毒材料作为阳性对照,以不含病毒的健康植物组织作阴性对照,同时以水代替模板作为空白对照。P C R反应条件:9 4 预变性3 m i n,然后9 4 变性3 0 s、5 3 退火4 5 s、7 2 延伸1 m i n,3 5个循环,最后一个循环结束后7 2 继续延伸1 0 m i n。预期扩增片段大小6 6 7 b p。表D.1 P C R反应体系名称加样量/Lc D NA2.0 B l S c V-F P 1(1 0 m o l/L)1.0 B l S c V-R(1 0 m o l/L)1.0 2T a q P C R m i x1 2.5 d d H2O8.5总体积2 5.0 注:P C R扩增也可以采用商品化试剂盒。D.2.4 第2轮P C R扩增取第1轮P C R产物0.1 L作为模板,进行第2轮P C R扩增。P C R反应体系为:B l S c V-F P 2(1 0 m o l/L)1 L,B l S c V-R(1 0 m o l/L)1 L,2T a q P C R m i x 1 2.5 L,d d H2O 1 0.4 L。P C R反应条件:9 4 预变性3 m i n,然后9 4 变性3 0 s、5 8 退火4 5 s、7 2 延伸1 m i n,3 0个循环,最后一个循环结束后7 2 继续延伸1 0 m i n。预期扩增片段大小4 4 8 b p。D.2.5 琼脂糖凝胶电泳制备1.5%的琼脂糖凝胶,对P C R产物进行电泳,电压3-5 V/c m,缓冲液0.5T B E。电泳结束后,在溴化乙锭(E B,浓度为0.5 g/mL)溶液染色1 0 m i n后,再在凝胶成像分析系统中观察是否扩增出预期的特异性D NA电泳带,拍照并做记录。注:也可以采用其他核酸染料替代E B。D.2.6 结果判断如果阴性对照和空白对照无特异性扩增,待测样品第1轮P C R扩增出与阳性对照一致的扩增条带(6 6 7 b p)或第2轮P C R扩增出与阳性对照一致的扩增条带(4 4 8 b p),则判定为阳性。如果阳性对照、阴性对照和空白对照正常,待测样品第1轮P C R、第2轮P C R均未出现与阳性对照一致的扩增条带(6 6 7 b p、4 4 8 b p),则判定为阴性。9S N/T5 3 8 52 0 2 1附 录 E(规范性)实时荧光R T-P C R检测E.1 试剂核酸提取试剂见D.1.1。T a qM a n P C R m i x。E.2 引物及探针根据已报道的B l S c V外壳蛋白(C P)和依赖于R NA的R NA聚合酶(R d R p)基因序列设计用于实时荧光R T-P C R检测的特异性引物及探针,引物及探针序列见表E.1。表E.1 实时荧光R T-P C R检测引物及探针名称序列(5-3)B l S c V-f 1WG G KG G R C T T C A R G G T G CB l S c V-r 1GA T C C A T T R C C Y G C A T T T CB l S c V-f 2GAWAAY T T Y GAA T G G T T Y C G C TB l S c V-r 2G R T GAGA R T G C G GAAAA C CB l S c V-P r o b e 1F AM-C G T C C G C AA T C A T-MG BB l S c V-P r o b e 2F AM-Y C T C AG Y C C A TA C G C-MG B 注:K=G/T;R=A/G;W=A/T;Y=C/TE.3 总R N A提取方法见D.2.1。E.4 c D N A合成在P C R管中加入3 L总R NA,1 L 随机引物(1 0 0 m o l/L),d d H2O 7 L,7 0 水浴1 0 m i n,迅速冰浴5 m i n,再 加 入 下 列 试 剂:5 R T缓 冲 液5 L、d NT P s(1 0 mm o l/L)2 L、M-ML V R T(2 0 0 U/L)1 L、R N a s i n(4 0 U/L)1 L。4 2 水浴6 0 m i n,7 0 水浴1 0 m i n,自然冷却至室温,-2 0 保存备用。E.5 实时荧光P C R反应反应体系:在荧光定量P C R管中加入2T a qM a n P C R m i x 1 2.5 L、B l S c V-f 1(1 0 m o l/L)1 L、B l S c V-r 1(1 0 m o l/L)1 L、B l S c V-f 2(1 0 m o l/L)1 L、B l S c V-r 2(1 0 m o l/L)1 L、B l S c V-P r o b e 1(1 0 m o l/L)1 L、B l S c V-P r o b e 2(1 0 m o l/L)1 L、模板c D NA 2 L,补D E P C-H2O至2 5 L。设置阳性对照、阴性对照及空白对照,每个反应设置2个重复。反应程序:9 5 2 m i n;9 5 1 5 s,6 0 1 m i n,共4 0个循环。注:实时荧光P C R也可以采用商品化试剂盒。01S N/T5 3 8 52 0 2 1E.6 结果判定在空白对照及阴性对照无C t值且无扩增曲线、阳性对照C t值3 0并出现典型扩增曲线的条件下:待测样品的C t值4 0时,判定B l S c V阴性。待测样品的C t值3 5时,判定B l S c V阳性。待测样品的C t值小于4 0而大于3 5时,应重新进行测试;如果重新测试的C t值4 0,判定B l S c V阴性;如果重新测试的C t值小于4 0而大于3 5,则判定B l S c V阳性。S N/T5 3 8 52 0 2 1S N/T 5 3 8 52 0 2 1参 考 文 献1 J e v r e m o v i c D,P a u n o v i c S,L e p o s a v i c A.I n c i d e n c e o f v i r u s e s i n h i g h b u s h b l u e b e r r y(V a c c i n-i u m c o r y m b o s u m L.)i n S e r b i a.P e s t i c i d e s a n d P h y t o m e d i c i n e,2 0 1 6,3 1(1-2):4 5-5 0.2 L e e S,K i m C S,S h i n Y G,e t a l.D e v e l o p m e n t o f n e s t e d P C R-b a s e d s p e c i f i c m a r k e r s f o r d e-t e c t i o n o f P e a c h r o s e t t e m o s a i c v i r u s i n p l a n t q u a r a n t i n e.I n d i a n J o u r n a l o f M i c r o b i o l o g y,2 0 1 6,5 6(1):1 0 8-1 1 1.3 M a c D o n a l d S G,M a r t i n R R,B r i s t o w P R.C h a r a c t e r i z a t i o n o f a n i l a r v i r u s a s s o c i a t e d w i t h a n e c r o t i c s h o c k r e a c t i o n i n b l u e b e r r y.P h y t o p a t h o l o g y,1 9 9 1,8 1(2):2 1 0-2 1 4.4 S p a k J,P r i b y l o v a J,K u b e l k o v a D,e t a l.D e t e c t i o n o f v i r u s e s a n d p h y t o p l a s m a i n V a c c i n i u m s p.i n t h e C z e c h R e p u b l i c.A c t a H o r t i c u l t u r a e,2 0 1 2,(9 2 6):6 3 1-6 3 5.5 X i e L X,Z h e n g S,Z h a n g L J,e t a l.B l u e b e r r y s c o r c h v i r u s d e t e c t e d o n b l u e b e r r y p l a n t s i m-p o r t e d i n t o c h i n a.P l a n t D i s e a s e,2 0 1 8,1 0 2(8):1 6 7 3.6 谢丽雪,郑姗,张立杰,等.蓝莓休克病毒I C-R T-n e s t e d P C R检测技术.中国农业科学,2 0 1 6,4 9(2 2):4 3 6 6-4 3 7 4.12025835 T/NS 版权专有 侵权必究*书号:1 5 5 1 7 5-6 7 3定价:1 6.0 0元