gidA基因缺失对貉源大肠杆菌生物学特性的影响.pdf

第45卷第12 期2023年12 月doi:10.3969/j.issn.1008-0589.202302022中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary MedicinegidA基因缺失对貉源大肠杆菌生物学特性的影响Vol.45,No.12Dec.2023孙欣艺，马亚娟，王苗”，侯冠欣，王利丽，张春晓，张闫，张志强（1.河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛0 6 6 0 0 4；2.河北农业大学，河北保定0 7 10 0 1；3.武汉市动物疫病预防控中心，湖北武汉430 39 9)摘要：为研究葡萄糖抑制的分裂蛋白A(GidA)在貉源大肠杆菌致病机制中的作用，本研究利用入-Red同源重组技术构建貉源致病性大肠杆菌LCE-1（WT)g i d A 基因缺失株LCE-1g i d A(K O)和回补株LCE-1AgidA/gidA(RS),均采用PCR和测序鉴定正确后，进一步分析各菌株的生长特性、生化特性，结果显示，在LB培养基中3株菌的生长速度均无明显差异；KO菌株的部分生化特性如肌醇、-葡萄糖苷酶、-葡萄糖苷酶指标均发生变化，RS菌株指标基本恢复。通过试管法及微量结晶紫法分析评估3株菌生物被膜(BF)的形成能力，结果显示，与WT菌株和RS菌株相比，KO菌株BF形成能力极显著下降(P0.0001)。体外模拟并检测在酸应激、碱应激、热应激以及氧化应激条件下这3株菌的生长情况，结果显示，gidA基因缺失能够显著提高大肠杆菌对酸应激、碱应激、热应激和氧化应激的敏感性。通过K-B纸片法对这3株菌的耐药性进行测定，结果显示，与WT菌株相比，KO菌株对头孢类、喹诺酮类、氨基糖苷类和青霉素类药物的敏感性增强。利用WT和KO菌株分别感染小鼠进行致病性试验，结果显示，WT和KO菌株对小鼠的LDso分别为1.58 10 5cfu/mL和3.16 10 cfu/mL，与WT菌株相比，KO菌株的毒力下降大于1个数量级。本研究为进一步研究gidA基因对貉源大肠杆菌致病机制的影响奠定了基础。关键词：貉源大肠杆菌；gidA基因；基因缺失；生化特性；抗应激能力中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：10 0 8-0 58 9(2 0 2 3)12-12 16-0 7Effect of gidA gene detection on the biological characteristics ofEscherichia coli strain from raccoon dogSUN Xin-yi,MA Ya-juan,WANG Miao,HOU Guan-xin,WANG Li-li,ZHANG Chun-xiao,ZHANG Yan,ZHANG Zhi-qiang(1.Hebei Provincial Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine,Hebei Normal University of Science&Technology,Qinhuangdao 066004,China;2.Hebei Agricultural University,Baoding 071001,China;3.Center for Prevention and Control of Animal Epidemic Disease in Wuhan,Wuhan 430399,China)Abstract:To investigate the role of glucose-inhibited fission protein A(GidA)in the pathogenesis of Escherichia coli(E.coli)from raccoon dog,the X-Red homologous recombination technology was used to constructed the gidA gene deletionmutant LCE-1AgidA(KO)based on the pathogenic isolate LCE-1(WT)from raccoon dog,and the complementary strain*Corresponding author收稿日期：2 0 2 3-0 2-2 4基金项目：河北省科技厅重点研发计划项目(19 2 2 6 6 2 8 D)；河北省省级科技计划资助(19 2 2 6 6 2 9 D)；河北省高等学校科学技术研究项目(BJ2021055)；河北省高层次人才资助项目（C20231014)；中央引导地方科技发展资金项目(河北省奶肉牛呼吸道疾病综合征诊断与防控技术研究2 36 Z6604G)作者简介：孙欣艺(19 9 7-)，女，河南洛阳人，硕士研究生，主要从事兽医传染病学研究.*通信作者：E-mail：w s z h a n g z h i q i a n g y e a t.n e t第12 期孙欣艺，等.gidA基因缺失对貉源大肠杆菌生物学特性的影响1217LCE-1AgidA/gidA(RS)was constructed as well,and all were identified by PCR and sequencing.On this basis,the effect of gidAgene deletion on the growth and biochemical characteristics of E.coli was further analyzed,and it showed that there was nosignificant difference in the growth rate of the three strains of bacteria in LB medium,some biochemical characteristics of KOstrain such as inositol,-glucosidase and-glucosidase indicators altered,RS strain indicator base resporse.The biofilm(BF)formation ability of the three strains was assessed by tube staining test and microcrystalline violet analysis,and the results showedthat the BF formation ability of the KO strain highly significant decreased compared to the WT and RS strains(P0.0001).Thegrowth of these three strains under acid stress,alkaline stress,heat stress or oxidative stress was simulated and examined in vitro,and the results showed that the gidA gene deletion significantly increased the susceptibility of E.coli to acid stress,alkaline stress,heat stress,and oxidative stress.The rsults of the K-B drug resistance test of these three strains showed that the KO strain hadincreased susceptibility to cephalosporins,quinolones,aminoglycosides and penicllins compared to the WT strain.Mice wereinfected with the WT and KO strains for pathogenicity test,and it showed that the LDso of the WT strain was 1.58x10cfu/mL,andthe LDso of the KO strain was 3.16 x10cfu/mL,and the virulence of the KO strain decreased by greater than one order ofmagnitude compared to the WT strain.This study laid a foundation for further research on the effect of gidA gene on thepathogenesis of E.coli from raccoon dog.Key words:Escherichia coli from raccoon dog;gidA gene;gene deletion;biochemical characteristics;stress resistance大肠杆菌(Escherichia coli，E.c o li)是一类广泛分布于人和动物体内，血清型复杂，且具有多样致病性的重要人兽共患病原菌!。毛皮动物养殖过程中大肠杆菌病十分常见，且常与其它病原微生物造成混合感染或继发感染，同时还可能会随着感染宿主排泄物进入周围环境而感染其他动物2 。肠外致病性大肠杆菌可引起貉肺炎、神经系统损伤、流产和死胎等，严重制约着养貉业的健康发展3。但由于大肠杆菌血清型众多，菌株存在广谱耐药性，导致大肠杆菌病的预防和治疗越发困难4。葡萄糖抑制的分裂蛋白A(GidA)是一种tRNA修饰酶，在原核生物和真核生物中均非常保守，它的修饰作用对蛋白质的精确解码和高效翻译至关重要5。1982年的研究显示，GidA蛋白在大肠埃希菌中缺失后，在含有葡萄糖的培养基中，细胞分裂受到影响，细胞形态由短杆变成纤丝状。进一步的研究表明，GidA在鼠伤寒沙门菌和嗜水气单胞菌的细胞分裂和形态中起作用7 。GidA与包括大肠杆菌和沙门菌在内的肠杆菌科成员的发病机制有关，Shippy等对GidA在沙门菌发病机制中的作用进行了最全面的研究8 。在沙门菌中，GidA的缺失影响了沙门菌在上皮细胞中的生长、运动性以及在细胞内的复制和侵袭9 。GidA参与调控许多细菌的生长、形态和毒力10-，GidA的缺失已被证实可以减弱嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌和化脓性链球菌的毒力2 。但目前关于貉源大肠杆菌GidA的研究尚未见报道，因此本研究选取貉源大肠杆菌GidA，利用Red同源重组技术，构建大肠杆菌gidA基因缺失株及回补株，并分析了各菌株部分生物学特征的变化，为进一步研究GidA在貉源大肠杆菌致病机制中的作用提供参考依据。1木材料与方法1.1菌株、质粒及主要试剂貉源大肠杆菌LCE-1(以下简称WT菌株)由河北省预防兽医学重点实验室保存；pKD46、p K D 3、p CP2 0 质粒由吉林农业大学康元环教授惠赠；2 ExTaqMaster Mix、D L2 0 0 0pulsMarker，均购自北京康为世纪生物科技有限公司；LATaq DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶和T4 DNA连接酶均购自NEB公司；ATB生化自动鉴定系统及ID32E生化鉴定试纸条购自法国梅里埃公司；头孢类、喹诺酮类、青霉素类等7 类14种药敏纸片购自杭州天和微生物科技股份有限公司。1.2引物的设计与合成根据NCBI登录的大肠杆菌基因组序列(CP000468.1)采用PrimerPremier5.0设计引物(表1)。P1/P2引物用于从pKD3质粒中扩增打靶片段，引物由两部分组成：5 端加下划线的部分与待敲除基因序列同源，3 端未加下划线部分与质粒pKD3氯霉素抗性基因Cat两侧序列互补；P3/P4引物为质粒pKD46的鉴定引物；P5/P6引物位于gidA基因完整开放阅读框外侧，用于缺失株的鉴定；P7/P81218中国预防兽医学报2023年引物用于扩增gidA基因开放阅读框与回补株的构建。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。表1本研究所用的引物序列Table 1Primers used in this study引物名称引物序列(5-3)NameSequence(5-3)P1TCGGCGGTATTGGGAAGGGACATCTGGTAAAAGAAGTGGATGCACTCGGCGGTCTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGP2TTTCAGGTCGCGTGGATCGAAGAAGTCATACTCAATGGCATAACCCGGACGCACGAATGGGAATTAGCCATGGTCCP3ATGAGTACTGCACTCGCAACGP4TCATGCTGCCACCTTCTGCTP5CAGGATCACCGATCATTCACAP6GCAGATACGGAGCTACCACAAP7TGGGAAGGGACATCTGGTAAP8TTTCAGACGCTGACGCTCA注：*：LCE-1/pKD46:Cat扩增片段大小；*：LCE-1g i d A 扩增片段大小Note:*:Amplicon of LCE-1/pKD46:Cat;*:Amplicon of LCE-1AgidA1.3gidA基因缺失株及回补株的构建与鉴定参照BF经结晶紫染色后的ODs75mm值，采用Prism5.0软件文献13 中入-Red同源重组技术，对gidA基因进行敲分析数据。除。首先以pKD3质粒为模板，利用P1/P2引物扩增1.7各菌株对环境应激抵抗力的测定将WT、带有目的基因同源臂和氯霉素抗性基因的片段，将KO、RS菌株分别培养至OD6o0mm值为1.0 时，离心弃扩增产物电转入经P3/P4鉴定过含pKD46质粒的上清，重悬后10 倍倍比稀释、滴板计数。另取LCE-1感受态细胞中，获得含Cat基因的1次同源重OD60m=1的3种菌液按1:10 0 的比例分别转接到具有组菌株(LCE-1/pKD46:Cat)，然后将pCP20质粒电转酸性应激(pH4)、碱性应激(pH10)、热应激(42 )、入含Cat基因的菌株中，以消除Cat基因，获得含有氧化应激(10 mmol/LH,O2)的条件下培养1 h，之后pCP20质粒的缺失株。然后将含pCP20质粒的缺失株对其10 倍倍比稀释、滴板计数，计算各菌株在各应在42 水浴5h6 h，消除温敏质粒pCP20以获得2激条件下的生存率，分析各菌株抗环境应激能力。次同源重组菌株LCE-1AgidA（以下简称KO菌株），试验重复3次，根据各菌株生存率采用Prism5.0软件对该菌株利用PCR(P5/P6引物)和测序方法鉴定。进行数据的统计与分析。利用煮沸裂解法提取LCE-1株基因组作为模板，1.8各菌株的药敏试验参照CLSI试验标准，利利用P5/P6引物经PCR扩增gidA基因完整开放阅读用K-B纸片法检测WT、K O、RS菌株对头孢类、喹框，将其克隆到pBR322质粒中，构建回补质粒诺酮类、青霉素类等7 类14种药物的敏感性。pBR322-gidA，并转化至DH5感受态细胞中，即获1.9各菌株对小鼠的致病性试验利用BALB/c小得含pBR322-gidA质粒的感受态细胞，经PCR鉴定的鼠模型测定WT和KO菌株对小鼠的半数致死量阳性重组子由上海生工生物工程技术服务有限公司(LDso)，以评估菌株的致病性。将130 只BALB/c小鼠测序检验无移码错位突变后，提取pBR322-gidA质随机均分为13组，16 组为WT菌株感染组，7 12粒，电转化至LCE-1g i d A 菌株中，利用P5/P6引物经组为KO菌株感染组，13组为空白对照组(PBS组)。PCR鉴定无误后即获得gidA基因回补株LCE-1g i d A/将菌株37 培养过夜后，用等量的无菌PBS洗涤，gidA(以下简称RS菌株)。3500r/min离心5min，弃上清，重复3次，平板计1.4各菌株生长曲线的测定将WT、K O、RS3株菌分别接种于LB液体培养基，37、2 2 0 r/min振荡培养过夜。次日将各菌株稀释至同一OD600mm值后，分别按1:10 0 接种于LB液体培养基中，37 振荡培养，每隔1h取样测定OD6o0m值，直至细菌进入平台期。重复上述试验3次，根据OD600mm绘制3株菌的生长曲线，比较WT、K O、RS3株菌的生长特性。1.5各菌株生化特性的测定利用梅里埃自动生化增片段长度(bp)鉴定系统对WT、K O、RS3株菌进行生化特性鉴定。Products length(bp)11047861701/2005*/691*1425分别将WT、K O、RS菌株接种至LB培养基，37 振荡培养过夜后PBS洗涤两次，以每孔50 L加入ID32E试纸条孔中，并在另外7 个孔内加入一滴矿物油，于湿盒内37 培养2 4h，将试纸条上机鉴定。1.6各菌株生物被膜(BF)形成能力的测定通过试管法和微量结晶紫法(ODs75mm)分别检测WT、K O、RS菌株BF的形成能力。将过夜培养的3株菌菌液按1:100接入含LB液体培养基的试管中，垂直静置于37恒温培养箱中，48 h后对菌环固定并用结晶紫染色，观察菌环的粗细。分别将WT、K O、RS菌株接种于9 6 孔板中，于37 中静置培养，48 h后检测数。将菌液调整为同一浓度后10 倍倍比稀释为5个梯度(菌液浓度为1.0 10 3cfu/mL1.0 10 c f u/m L),各稀释度均以2 0 0 L/只注射，空白对照组注射相同第12 期孙欣艺，等.gidA基因缺失对貉源大肠杆菌生物学特性的影响1219的剂量无菌PBS，连续14d观察并记录小鼠存活数。利用寇氏法计算WT和KO菌株的LDs0，分析两株菌对小鼠的致病性。2 结 果2.1gidA基因缺失株及回补株的构建与鉴定结果利用同源重组方法缺失LCE-1菌株中的gidA基因，获得gidA基因缺失株LCE-1g i d A 和回补株LCE-1g i d a lgidA。分别提取LCE-1株、1次重组菌株(LCE-1/pKD46:Cat)和2 次重组菌株(LCE-1g i d A)基因组作为模板，以鉴定引物(P5/P6)经PCR扩增gidA基因片段。结果显示，LCE-1株扩增片段为1450 bp，1次、2次重组菌株扩增片段分别为19 0 0 bp、6 50 b p，均与预期一致(图1A)。进一步对2 次重组菌株的gidA基因进行测序分析结果显示，经过2 次重组，gidA基因中待缺失序列已被敲除。利用PCR方法鉴定RS菌株，RS菌株中能检测到gidA基因(图1B)，上述结果表明KO及RS菌株均构建正确。AM15000bp3000bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp1:LCE-1;2:LCE-1/pKD46:Cat;3:LCE-1AgidA;B:M:DL2000 plus DNA Marker;1:LCE-1;2:LCE-1AgidA;3:LCE-1AgidA/gidA图1大肠杆菌gidA基因缺失株(A)及回补株(B)的PCR鉴定Fig.1 Identification of E.coli gidA gene deleted strain(A)andcomplementary strain(B)by PCR2.2各菌株生长曲线的测定结果将WT、K O、RS菌株分别在LB液体培养基培养后，检测ODom值，绘制生长曲线，结果显示，3株菌在各个时间点的生长速度基本一致(图2)。表明gidA基因的缺失不影响LCE-1菌株的生长速率。2.3各菌株生化特性的鉴定结果利用ATB全自动生化鉴定系统对3株菌的生化反应谱进行测定，结果所示，与WT菌株相比，KO菌株中精氨酸双水解酶(ADH)、-葡萄糖苷酶(GLU)和-葡萄糖苷酶(GLU)的特性由阳性转为阴性，肌醇(INO)的特性由阴性转为阳性，RS菌株除精氨酸双水解酶(ADH)由阳性转为阴性外，其余均与WT菌株一致(表2)。表明gidA基因缺失影响了貉源大肠杆菌的部分生化特性。3.0WT-KORS2.01.000图2 3株菌生长曲线的测定结果Fig.2(Growth curves of three tested strains表2 各菌株生化特性的鉴定结果Table 2Biochemical reaction spectrum of each strain生化检测项目Biochemical items脂酶LIP23B5000bp3000bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpA:M:DL2000 plus DNA Marker;2M1234Incubation time(hours)LCE-1 LCE-1g i d A LCE-1g i d A/g i d AN乙酰葡萄糖胺NAGd-麦芽糖MALd-葡萄糖GLU燕糖SACd-半乳糖酸盐同化GAT尿素酶URE精氨酸双水解酶ADH肌醇INO-麦芽糖MALd-纤维二糖 CEL-半乳糖苷酶-GALL天冬氨酸芳胺酶AspAd-海藻糖 TRE-葡萄糖苷酶GLUL-阿拉伯糖LARA鸟氨酸脱羧酶 ODC肌醇INDd-甘露醇MAN酚红RP5酮基葡糖酸盐5KGL-阿拉伯醇LARL赖氨酸脱羧酶LDC-葡萄糖苷酶 GLU丙二酸盐MNTd-山梨醇 SOR葡萄糖醛酸酶GUR侧金盏花醇ADOL-鼠李糖RHA-半乳酸苷酶GALD-阿拉伯醇DARL古老糖PLE2.4各菌株BF形成能力的测定结果6+8一+一+一+一+10将3株菌经试121+一一+一141220中国预防兽医学报2023年管法和9 6 孔板微量结晶紫法(ODs75m)检测BF形成能力，试管法定性结果显示，与WT和RS菌株相比，KO菌株在气液交界处BF形成明显较少(图3A)；9 6 孔板定量检测(OD575m)结果显示，与WT和RS菌株相比，KO菌株BF形成能力极显著降低(P0.0001)（图3B)。表明gidA基因参与貉源大肠杆菌BF的形成机制。AWTB0.40.30.20.10*:P0.0001A：试管法比较各菌株BF形成能力；B：微量结晶紫法比较各菌株BF形成能力A:Biofilm formation ability tested by tube staining;B:Biofilm formation ability tested by microcrystalline videtanalysis图3各菌株BF形成能力的测定结果Fig.3Detection of biofilm formation ability of each strain2.5各菌株对环境应激抵抗力的测定结果将WT、K O、RS菌株在各种应激条件下培养，检测各菌株生存率，结果显示，与WT菌株相比，KO菌株在酸性环境、碱性环境、热环境和氧化环境下的耐受能力均极显著下降(P0.01、P 0.0 0 0 1或P0.001),RS菌株抗应激能力有所恢复(图4)。表明，gidA基因参与调控貉源大肠杆菌对抗酸性应激、碱性应激、热应激和氧化应激。2.6药敏试验结果利用K-B纸片法检测3株菌的耐药性，药敏试验结果见表3。表明，gidA基因缺失后大肠杆菌不仅对头孢类抗生素和喹诺酮类抗生素的敏感性提高，对青霉素类抗生素和氨基糖苷类抗生素的敏感性也有不同程度的提高。2.7各菌株对小鼠的致病性试验结果型观察记录WT和KO菌株感染小鼠的死亡情况及测定LDso，结果显示，WT和KO菌株感染组小鼠陆续出现死亡，而空白对照组(PBS组)小鼠均无死亡。根据寇氏法计算各菌株对小鼠的LDso，WT 菌株的LDso为1.58 10 5cfu/mL，K O 菌株的LDso为3.16 10 cfu/mL，与WT菌株相比，KO菌株的毒力下降大于1个数量级(表4)。表明gidA基因缺失后貉源大肠杆菌LCE-1的致病性明显下降。pH4.0150(%)ae eAIAns100F500WTKORS15042KORSWTKORS果利用小鼠模-内酰胺类-lactams青霉素类Penicilins硝基呋喃类Nitrofuran150*10050F0LWTKORS10mmol/LH,028060100F4050F20F00WTKORS*:P0.01;*:P0.001;*:P0.0001A：酸性应激；B：碱性应激；C：热应激；D：氧化应激A:Acid stress;B:Alkaline stress;C:Heat stress;C:Oxidative stress图4环境应激对各菌株生存率影响的测定结果Fig.4 Influence of environmental stress on the survival rateof tested strains表3各菌株药敏试验结果Table 3Susceptibility test results of each strain抑菌圈直径/mm抗生素种类抗生素Antibotics typesAntibotics头孢菌素类头孢哌酮CephalosporinsCefoperazone头孢吡Cefepime头孢唑啉Cefazolin喹诺酮类环丙沙星QuinolonesCiprofloxacin氧氟沙星Ofloxacin多肽类多粘菌素Peptides.Polymyxin 氨基糖苷类丁胺卡那AminoglycosidesAmikacin氯霉素Chloramphenicol阿奇霉素Azithromycin大观霉素Spectinomycin氨芋西林Ampicillin羧芋西林Carbenicillin哌拉西林Piperacillin喃唑酮FurazolidonepH10*WTKORSDiameters of inhibition zone/mmWT strain KO strain RS strain252620252114212015231622203230253227161825162426282330173217222016172581724第12 期孙欣艺，等.gidA基因缺失对貉源大肠杆菌生物学特性的影响1221表4LCE-1株和LCE-1g i d A 株的LDso测定结果Table 4LDso of LCE-1 strain and LCE-1g i d A s t r a i n菌株StrainLCE-1LCE-1AgidAPBS3 讨 论GidA的修饰作用对细菌的生存至关重要。Yu等研究表明，GidA参与了大肠埃希菌引起的人类脑膜炎的重要细胞毒素细胞毒性坏死因子1(CNF1)的产生，该基因的缺失显著影响重要细胞毒素CNF1蛋白的表达14。本研究以GidA为研究对象，对缺失该基因大肠杆菌的生物学特性做了分析，为研究GidA在貉源大肠杆菌中的致病机制提供了重要数据。本研究前期分别尝试用pMD19-T和pBR322两种质粒构建回补菌株，均正确构建，且回补菌株的各生物特性均有不用程度的回复。pBR322质粒是一种成熟的多用途克隆载体，已经为特定应用和不同的研究目的创建了其大量衍生物，用于其天然宿主大肠杆菌和少数其他细菌中的基因表达15，因此本研究选取pBR322构建本实验回补质粒及回补菌株。GidA是全局性的调控因子，对细菌的生长具有重要的调控作用，本实验检测该基因的缺失对大肠杆菌生长特性的影响，结果显示，在LB液体培养基中，缺失株的生长速率与野生菌株差异不明显。表明gidA基因的缺失对大肠杆菌的生长能力并无影响。分析其生化指标结果显示，缺失株的精氨酸双水解酶(ADH)、-葡萄糖苷酶(GLU)、-葡萄糖苷酶(BGLU)这3种指标均与野生株不同，这些酶均与生物体的代谢有关，表明gidA基因缺失后可能导致大肠杆菌氨基酸和糖代谢能力的改变。BF是细菌抵抗外界环境、感染宿主细胞的重要结构。它是组成细菌细胞膜的附属结构，并参与细菌的物质代谢，很多细菌在一定条件下均能形成BF，其BF形成能力与细菌毒力及耐药性均有一定相感染剂量(cfu/mL)死亡率LDs/cfu/mLInfection dose(cfu/mL)Ratio of death1x1030/101x1042/101x10s3/101x1068/10110710/101x108101011030/101x1040101x1050/101x1063/1011077/101x10810/101xPBS0/10关性16 。有研究称，GidA可能参与变异链球菌BF形1.58105成的起始粘附过程17 。本研究发现gidA基因缺失后能够使大肠杆菌的BF形成能力下降，但其具体机制还有待进一步研究。在大肠杆菌中，GidA催化tRNA的摆动尿苷3.16106(U34)的第5位添加羧甲基氨甲基(cmnm)基团。这种原核基因调控是一种重要的机制，它使细菌能够在多种环境中存活。tRNA中反密码子结构域的转录后修饰是控制基因表达的主要因素，表明GidA在细菌适应不同环境方面发挥作用18 。有研究显示，在沙门菌中，GidA在不同的环境中的表达量增加，这与沙门菌体外毒力的增加相关19 ；在变异链球菌中的gidA基因参与了各种环境应激，包括在酸性条件17 。因此，本实验模拟了酸性应激、碱性应激、热应激和氧化应激多种应激条件，结果表明gidA基因的缺失使细菌的抗应激能力均有不同程度的下降，证明gidA基因在大肠杆菌适应不同环境方面发挥作用。通过检测大肠杆菌WT、K O、RS菌株的耐药性，发现gidA基因缺失后能够不同程度增加大肠杆菌对多种常用抗生素的敏感性。有研究发现喹诺酮类药物似乎是通过羟基的自由基作用致死细菌2 0 ,羟自由基属于ROS，因此推测GidA可能参与修饰与ROS相关基因的表达。进一步利用小鼠模型评估gidA缺失对大肠杆菌毒力的影响，结果显示，gidA缺失后，貉源大肠杆菌对小鼠的LDso上升了2 0 倍，其毒力下降大于1个数量级，表明GidA也可能参与调控貉源大肠杆菌的毒力。总之，GidA对大肠杆菌的毒力具有调控作用。本实验的研究结果。进一步证明了葡萄糖抑制的分裂蛋白(GidA)与大肠杆菌的生物学过程以及与细菌毒力密切相关，为进一步探究GidA在貉源大肠杆菌中的致病机制提供了重要材料。参考文献：1 SMITH J L,FRATAMICO P M,GUNTHER N W.Extraintesti-nal pathogenic Escherichia coli J.Foodborne Pathog Dis,2007,4(2):134-163.2闫爽，冯涛，王东阳，等.东北地区狐源大肠杆菌耐药性、整合酶及整合子基因的检测与相关分析J中国预防兽医1222中国预防兽医学报2023年学报，2 0 2 2，44(4)：439-444.3】刘勃兴，赵安奇，柳翠翠，等.秦皇岛地区貉肠外大肠杆菌的致病性与耐药性分析J.中国兽医学报，2 0 2 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