不饱和脂质氮杂环丙烷化反应中间体的原位质谱分析.pdf

第45卷第1期2024年1月质谱学报Journal of Chinese Mass Spectrometry SocietyVol.45No.1Jan.2024不饱和脂质氮杂环丙烷化反应中间体的原位质谱分析陈凯祥，魏是奇，陈素明（武汉大学高等研究院，湖北武汉430 0 7 2）摘要：脂质结构决定生物功能，对不饱和脂质C=C双键异构体的鉴定面临着挑战。直接的氮-甲基(N-Me)氮杂环丙烷化反应可以对不饱和脂质双键进行衍生，通过与串联质谱结合可实现不饱和脂质双键位置的解析。然而，目前N-Me氮杂环丙烷化反应机理研究尚缺乏中间过程的直接证据。本工作采用一种基于毛细管的纳升静电喷雾离子化质谱（nESTASI-MS)分析装置，研究不饱和磷脂酰胆碱的氮杂环丙烷化反应过程，捕获并鉴定了反应过程中的关键中间体，为阐明氮杂环丙烷化反应机理提供了直接证据。关键词：质谱（MS)；化学反应中间体；氮杂环丙烷化反应；双键位置鉴定中图分类号：0 6 57.6 3doi:10.7538/zpxb.2023.0102In Situ Mass Spectrometric Analysis of Intermediatesin Aziridination Reaction of Unsaturated LipidsCHEN Kai-xiang,WEI Shi-qi,CHEN Su-ming(The Institute for Advanced Studies,Wuhan University,Wuhan 430072,China)Abstract:The structures of lipids determine their biological functions,and the identifi-cation of C=C double bond isomers in unsaturated lipids faces challenges.The directnitrogen-methyl(N-Me)aziridination reaction allows for the derivatization of unsaturat-ed lipid double bonds,which can combine with tandem mass spectrometry(MS/MS)toenable the resolving for positions of unsaturated lipid double bonds.However,currentstudies about the mechanism of the N-Me aziridination reaction lack direct evidence ofintermediate processes.Here,a nano-electrostatic-spray ionization-mass spectrometry(nESTASI-MS)device based on a capillary was used to separate the reactants throughthe channels on both sides of the o capillary,allowing the solutions to be mixed andreact on-line during the electrospray process.This on-line mixing greatly shortened theresidence time of the two reactants,providing for the successful capture and identifica-tion of short-lived intermediates during the reaction process.The device was used tostudy the reaction process of aziridination of unsaturated phosphatidylcholine(PC).文献标志码：A文章编号：10 0 4-2 9 9 7(2 0 2 4)0 1-0 149-0 8国家自然科学基金（2 2 0 7 4111）本文通信作者陈素明150N-Methyl-O-(2,4-dinitrophenyl)hydroxylamine(N-Me-DPH)was used as the amina-tion reagent,PC 36:2 as a representative substrate,and Rh2(esp)2 as a catalyst tostudy the reactions of these three substances in different mixing modes.The resultsshowed that N-Me-DPH pre-mixed with Rh2(esp)2 may deactivate the catalyst and therelevant intermediates and products could not be observed.In the other two mixingmodes,the key rhodium-nitrene intermediate and the ternary biradical intermediate con-taining the first C-N bond during the reaction were successfully captured and charac-terized,as well as the product containing 1-methyl aziridine structure,which providedkey evidence for the mechanistic study of the direct aziridination reaction of N-Me.Deri-vatization of N-Me aziridination could generate the 1-methyl aziridine structure at thedouble bond position,which was susceptible to break during mass spectrometric colli-sion-induced dissociation(CID)to generate fragment ions providing indicative informa-tion about the position of the double bond.The dissociation behavior of the protonatedpeak of its aziridination product in CID mode was examined using PC 36:2 as an exam-ple.The results showed that the abundance of fragment ions breaking at the 1-methyl-aziridine structure was very low.Compared to the derived aziridine structure,the cho-line phosphate head group of PC was more likely to be lost during CID.Further colli-sion-induced dissociation of the ion fragmentation peaks after the loss of the head groupproduced significant fragmentation of the aziridine structural unit,yielding fragmentions with CN bond breaking near the acyl end and near the methyl end,respectively.The position of the double bond on the aliphatic chain could be easily determined fromthe mass of the fragment ions.This study provides a new in situ MS tool for the studyof short-lived chemical reaction intermediates,which is expected to play an importantrole in the study of transient intermediate processes of chemical reactions.Key words:mass spectrometry(MS);chemical reaction intermediates;aziridinationreaction;double bond position identification脂类物质是一类重要的生物分子，在生物系统中发挥着关键作用1-2 ，它们不仅是生物膜的重要组成成分，还在能量储存、信号转导等生物过程中扮演着重要角色3-4。不饱和脂质是包含1个或多个碳-碳双键的脂质亚类，脂质双键的位置对其结构和功能有着重要影响，精确解析脂质双键异构体是深人理解不饱和脂质生物学功能的前提5。质谱（mass spectrometry,MS)是分析脂质结构的有力工具6-7 。有研究表明，烯烃的臭氧分解反应8 、Paterno-Biuchi反应9 、环氧化反应10 、交叉复分解反应11 等均可用于脂质双键的活化和衍生，结合串联质谱可进行双键位置异构体的分析。其中，烯烃的氮杂环丙烷化反应是最新发现的一种脂质双键衍生方法12-1。烯烃的氮杂环丙烷化反应是合成氮丙啶化质谱学报第45卷合物的经典反应，通常使用催化剂将氮烯转移到C=C键上15-16 。最近，研究人员开发了一系列高效的Rh（）-催化氮杂环丙烷化反应，利用不同的胺化试剂从未活化的烯烃中直接制备氮丙啶17-18。本课题组前期研究12 表明，N-甲基-O-（2，4-二硝基苯基）羟胺（N-Me-DPH)可在双(,-四甲基-1,3-苯二丙酸)(Rh（e s p)z)催化剂的催化下与脂质双键高效反应生成N-甲基氮丙啶结构，该反应条件温和，对脂质双键进行衍生后可生成具有高质子亲和势的氮丙啶结构，实现了脂质双键位置异构体的高灵敏分析鉴定。对于直接的N-Me氮杂环丙烷化反应，先前仅通过计算化学法推测Rhz（e s p)催化下N-Me-DPH与烯烃的氮杂环丙烷化反应机理，但-氮烯中间体的存在尚未得到直接验证17第1期本工作拟利用型毛细管代替常规纳升静电喷雾离子化质谱（nESTASI-MS)装置中的普通玻璃毛细管19-2 0 1，使毛细管两侧的溶液在电喷雾时进行在线混合和反应，然后进人质谱分析，以便捕获反应过程中的短寿命中间体。同时,以 N-Me-DPH为胺化试剂,磷脂酰胆碱(PC18：1/18：1)为代表性底物，研究N-Me氮杂环丙烷化反应的中间过程，希望为阐明氮杂环丙烷化反应机理提供数据支持。1实验部分1.1主要仪器与装置Orbitrap EliteLTQXL高分辨质谱仪:德国Thermo Fisher Scientific公司产品，配有Xcalibur4.1数据处理系统；DDS数字合成函数信号发生器：中国国睿安泰信公司产品；10HVA24高压放大器：美国AdvancedEnergy公司产品；2 4V直流电源：广东粤海电子公司产品；P-97拉针仪：美国Sutter公司产品。1.2主要材料与试剂磷脂酰胆碱PC36：2(18：1（9)/18：1(9)）、PC 34：1（16：0/18：1（9)）:美国Avanti PolarLipids公司产品；三氟乙醇（TFE)：纯度为9 9.9%，北京伊诺凯科技有限公司产品；N-Me-DPH、R h z（e s p)2：上海毕得医药科技有限公司产品；毛细管：美国HarvardApparatus公司产品。1.3实验方法使用拉针仪拉制毛细管，制备适用于nESTASI-MS 的 毛细管(1.5 mmX0.13 mmX0.17 mm),使其一端呈尖锐形状，作为反应底物的容器和nESTASI-MS的发射器。拉针仪参数条件为:HEAT=523,PULL=15，V EL=14,TIME=150。实验时，将毛细管固定在适配台上，使其尖端正对质谱仪的离子进样口，距离约8 mm；毛细管尖端的下方放置1个垂直向上的圆形盘铂电极（外层为聚四氟乙烯材料，内部铂电极直径为2 mm），毛细管与电极的距离约5mm；电极与脉冲高压装置（方波，频率385Hz，电压8 kV)相连，从而在毛细管下方产生脉冲高压电场。检测样品时，在毛细管两侧通道各装人10 L对应底物溶液，打开脉冲高压电源，毛细管尖端会形成静电喷雾使分析陈凯祥等：不饱和脂质氮杂环丙烷化反应中间体的原位质谱分析2 min以上。1.4质谱条件正离子模式，质量扫描范围m/z1002 0 0 0，最大离子注入时间10 0 ms，分辨率6 0 0 0 0。2结果与讨论2.1基于0 毛细管的纳升静电喷雾离子化质谱分析装置的构建基于毛细管的nESTASI-MS分析装置示意图示于图1。当打开高压电源时，在毛细管和质谱仪进样口之间形成强大的脉冲电场，导致静电电荷在毛细管尖端裸露的溶液表面累积。有研究2 1 表明，当溶液表面的电荷累积过多时，表面张力将不足以阻止带电液滴形成喷雾，此时会突然形成静电喷雾使溶液中的待测分子离子化而被质谱检测。毛细管两侧的溶液会同时受到静电场的作用而喷射出来，并在管口处混合。因此，如果两侧装有不同的反应试剂，可以监测溶液在线混合后的反应过程。溶液A溶液B铂电极脉冲高压图1基于0 毛细管的纳升静电喷雾离子化质谱装置示意图Fig.1 Schematic of nano-electrostatic sprayionization-mass spectrometry device based on capillary在毛细管两侧分别装人 TFE和1 mmol/LPC36：2 溶液，打开电源后，可以稳定地观测到PC36：2 的质谱图，其中m/z786.6030、808.5823分别是PC36：2 的质子化离子和钠离子加合离子，初步验证了该装置的可行性，示于图2 a。然后,测试该装置对2 种溶液的检测能力，当在毛细管两侧分别装入1 mmol/LPC34：1、PC 36：2 溶液时，可同时观测到2种物质的质谱峰，m/z782.5679、8 0 8.58 15分151物离子化后进入质谱分析，喷雾持续时间在质谱进样口152别是PC34：1、PC 36：2 的钠离子加合峰，示于图2 b。该毛细管2 个通道中的分析物可在喷雾离子化过程中混合，然后进入质谱检测，大大缩短了2 种反应物混合后的停留时间，为成功捕获反应过程中短寿命中间体提供了条件。2.2不饱和脂质的直接N-Me氮杂环丙烷化反应过程中间体研究以PC36：2 和N-Me-DPH为反应物，Rhz（e s p)2 为催化剂，研究不同混合模式下的N-Me氮杂环丙烷化反应过程。根据文献17 推测的氮杂环丙烷化反应机理，PC36：2 的N-Me氮杂环丙烷化反应可能的中间过程示于图3。首先，N-Me-DPH与催化剂Rh（e s p)2质谱学报第45卷反应生成-氮烯中间体1，同时失去1分子二硝基苯酚；然后，中间体1与PC36：2 的双键作用,形成含有第1个C一N键的三元双自由基中间体2;最后,形成第2 个C一N键,Rh一N键断裂，生成含1-甲基氮丙啶结构的产物。其中,中间体1和中间体2 是该反应可能的中间体，但尚缺乏直接证据。用毛细管nESTASI-MS装置研究反应过程。在第1种混合模式下，以TFE为溶剂，将催化剂 Rhz（e s p)与 N-Me-DPH溶液预混合，使二者浓度分别为0.1、1 mmol/L，装入毛细管的一侧，将1mmol/LPC 36；2 溶液装人另一侧，然后进行nESTASI-MS分析，结果示a100808.5823PC 36:2+Na+b100808.5815PC 36:2+Na+782.5679PC 34;1+Na*786.603050FPC 36:2+H*0780注：a.0毛细管两侧分别装人三氟乙醇和PC36：2 溶液；b.0毛细管两侧分别装入PC34：1和PC36：2 溶液50F业0790800mlz图2 基于毛细管的nESTASI-MS装置验证Fig.2 Validation of the capillary-based nESTASI MS setup810820760780mlz800820O2NRRh-RhRh2(esp)2R2产物Rh-Rh-N中间体2NO2HN-Me-DPH）Rh-Rh-R1Rh中间体1RhR2RPC36:2图3Rhz（e s p)2 催化下PC36：2 与N-Me-DPH的氮杂环丙烷化反应可能的中间过程Fig.3Possible intermediate process in the Rh,(esp)2-catalyzedaziridination reaction of PC 36:2 with N-Me-DPHRh2(esp)2第1期于图4。在质谱图中仅观察到PC36：2 的质子化峰（m/z786.6007)和钠离子加合峰（m/z808.5826），未检测到相关中间体和产物质谱峰。PC 36:2+H*100500760图4第1种混合模式下的毛细管nESTASI质谱图Fig.4 Capillary-based nESTASI mass spectrumin the first mixing mode在第2 种混合模式下，将PC36：2 与催化剂Rhz（e s p)2 溶液预混合，使二者浓度分别为1、0.1mmol/L，装入毛细管的一侧，将1 mmol/L N-Me-DPH溶液装人另一侧,然后进行nESTASI-MS分析，结果示于图5。可见，检a815.6277786.6014产物+H100FPC 36:2+H+788.1179中间体1+H*PC362+Na50810.5896中间体1+Na780790ml/zC100陈凯祥等：不饱和脂质氮杂环丙烷化反应中间体的原位质谱分析786.6007PC 36:2+Na*809.5857788.6076业775790ml/z800759.0926153测到佬-氮烯中间体1的加氢峰（m788.1179)和加钠峰（m/810.5896），氮杂环丙烷化产物的加氢峰（m/815.6277)，以及三元双自由基中间体2 的质子化离子峰（m/1573.7190）。通过对中间体1进行串联质谱分析，进一步确证其结构，示于图5c。虽然PC36：2 含有2个双键，但仅单个双键发生反应的产物是主要产物，且任一双键发生反应的产物质量数均相808.5826同。此外，还检测到2 个双键同时发生反应的产物，其质子化离子峰为m/844.6522，示于图5d。虽然其强度仅为单个双键反应产物的10%，但可为多个双键位置的同时鉴定提805820808.5830810788供可能。在第3种混合模式下，将PC36：2 与N-Me-DPH预混合，使其浓度均为1 mmol/L，装入毛细管的一侧，将0.1 mmol/L催化剂Rhz（e s p)2 装人另一侧，然后进行nESTASI-MS分析，结果示于图6。可见，检测到中间体1的加氢峰（m/z788.1186）和加钠峰（m/810.5905)，以及产物的加氢峰（m/815.6288），表明在这种混合模式下可以发生反应，但产物的量较少。仅在第1种混合模式下未观察到中间体和b1566.6681PC 36:2+Cata+H*10050F08201555d100815.62661573.7190中间体2+H15651575m/z1585844.6534500450注：a低质量区；b.高质量区；c.中间体1的二级质谱图；d.PC36：2 单个双键反应产物和2 个双键反应产物质谱图Fig,5 Capillary-based nESTASI mass spectra in the second mixing mode50788.11920600750m/z图5第2 种混合模式下的毛细管nESTASI质谱图900815825ml/z835845154产物，推测N-Me-DPH与Rh（e s p）混合可能会使催化剂失活，继而影响N-Me-DPH与PC36：2 的进一步反应。同时，也体现了本工作开发的具有在线混合反应功能的毛细管nESTASI-MS装置的优势。a788.1186中间体1+H+100786.6027PC 36:2+H50H775bPC 36:2+Cata+H+1005001555注：a.低质量区；b.高质量区图第3种混合模式下的毛细管nESTASI质谱图Fig.6e Capillary-based nESTASI massspectra in the third mixing mode2.3N-Me氮杂环丙烷化反应用于脂质双键位置的鉴定N-Me氮杂环丙烷化衍生可以在双键处生成1-甲基氮丙啶结构，该结构在质谱碰撞诱导解离(CID)过程中容易发生断裂，生成指示双键位置信息的碎片离子。本研究以PC36：2为例，考察其氮杂环丙烷化产物的质子化离子在CID模式下的解离行为。衍生产物离子的CID-MS/MS谱图示于图7 a，出现了2 个较高的质谱峰m/756.5551和6 32.56 2 5，分别是产物离子失去磷酸胆碱头基末端的N(CH)3和整个磷酸胆碱头基得到的。同时,在1-甲基氮丙啶结构处断裂得到的碎片离子/z506.4216丰度较低。以上结果表明，相较于衍生的氮丙啶结构,PC的磷酸胆碱头基在 CID质谱学报第45卷过程中更易丢失。为得到相对丰度更高的双键诊断离子，进一步对丢失头基的碎片离子m/z632.5625进行CID，得到PC36：2 衍生产物的三级质谱图，示于图7 b。在此条件下，氮丙啶结构发生了明显碎裂，分别得到靠近酰基端和甲基端的C一N键断裂生成的碎片离子m/z477.3943和50 6.42 0 8。通过碎片离子质量可以判断双键的位置在9 位。由于PC 36：2另1条脂肪链上的双键位置也在9 位，因此808.5842PC 36:2+Na*815.6288810.5905产物+H*中间体1+Na790805m/z1566.67491575.244515651575mlz无论是哪1个双键被衍生，得到的产物碎片离子均相同。从衍生产物离子的二级和三级质谱图上没有观察到指示其他双键位置信息的离子，表明PC36：2 中没有双键在其他位置820的脂肪链。因此，推测PC36：2 的精确结构是PC18:1（9)/18：1（9)。a10050F01585300100b477.394350F506.42080420CH注：a.CID-MS/MS谱图;b.CID-MS?谱图；C.可能的碎裂途径图7 PC36：2 氮杂环丙烷化衍生产物用于C一C键位置的鉴定Fig.7Location identification of C=C bond byaziridination product of PC 36:2甲基取代的氮丙啶结构具有较高的质子亲和势（9 34.8 kJ/mol)22，因此，不饱和脂质进行氮杂环丙烷化标记后，在电喷雾质谱分析中具有较高的灵敏度，可以提高复杂体系中脂质632.5625756.55511815506.4216450600m/z632.5613?8159632500580m/z6320815.628675066047777506第1期双键异构体的鉴定效率。本课题组12 1研究表明，N-Me氮杂环丙烷反应结合液相色谱-质谱联用法可实现人血清中大量脂质异构体的鉴定。将本研究的基于纳升静电喷雾离子化的直接进样方法，与N-Me氮杂环丙烷化衍生反应相结合，可用于复杂生物样本中脂质双键异构体的鉴定。3结论本工作使用基于毛细管的纳升静电喷雾离子化质谱分析装置，实现了不同反应物的在线混合和质谱监测，通过研究不同混合模式下的氮杂环丙烷化反应过程，直接观测到了N-Me氮杂环丙烷化反应过程中的-氮烯中间体和三元双自由基中间体，为该反应机理的确证提供了关键信息，该装置也为反应过程中短寿命中间体的捕获和鉴定提供了有效方法。参考文献：1van MEER G,VOELKER D R,FEIGENSON GW.Membrane lipids:where they are and howthey behaveJJ.Nature Reviews Molecular CellBiology，2 0 0 8,9(2):112-12 4.2HAO Y,ZHANG Z,FENG G,CHEN M,WAN Q,LIN J,WU L,NIE W,CHEN S.Distinct lipid metabolic dysregulation in asympto-matic COVID-19JJ.iScience，2 0 2 1，2 4（9):102974.3LEMMON M 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