多组分定量联合化学计量学及灰色关联度分析骨力胶囊质量评价.pdf

中国药物应用与监测 2024 年2月 第21卷第1期 Chin J Drug Appl&Monit，Feb 2024,Vol.21,No.1 29 多组分定量联合化学计量学及灰色关联度分析骨力胶囊质量评价王青霞1，汪滨2，汤样华3，俞明义1，王晓燕41杭州市萧山区中医院（浙江中医药大学附属江南医院）药学部，杭州 311201；2杭州市萧山区中医院（浙江中医药大学附属江南医院）神经外科，杭州 311201；3杭州市萧山区中医院（浙江中医药大学附属江南医院）骨科，杭州 311201；4浙江省食品药品检验研究院，杭州 310052通信作者：王青霞，Email：摘要目的 建立骨力胶囊多组分定量检测方法，探索化学计量学及灰色关联度分析模型在其质量评价中的应用。方法 采用HPLC法，乙腈-0.2%醋酸为流动相梯度洗脱；检测波长为270、430和250 nm；以葛根素为内参物，建立多组分定量分析模式。再通过化学计量学及GRA评价其综合质量。结果 外标法方法学验证结果均符合要求；相对校正因子法和外标法的定量结果显示二者差异无统计学意义。化学计量学分析结果显示淫羊藿苷、葛根素、朝藿定、补骨脂素和姜黄素为骨力胶囊的代表性差异成分；GRA模型稳定，相对关联度在0.309 5 0.614 5。结论 所建立的方法简便实用，化学计量学和GRA可用于评价骨力胶囊的整体质量。关键词骨力胶囊；一测多评法；灰色关联度分析法；化学计量学；综合评价基金项目 浙江省中医药科学研究基金项目（2022ZB298）DOI 10.3969/j.issn.1672-8157.2024.01.008Quality evaluation of Guli capsules based on multicomponent quantification,chemometrics and grey relational analysisWang Qing-xia1,Wang Bin2,Tang Yang-hua3,Yu Ming-yi1,Wang Xiao-yan41Department of Pharmacy,Traditional Chinese Medical Hospital of Xiaoshan District of Hangzhou&Jiangnan Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 311201,China;2Department of Neurosurgery,Traditional Chinese Medical Hospital of Xiaoshan District of Hangzhou&Jiangnan Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 311201,China;3Department of Orthopaedics,Traditional Chinese Medical Hospital of Xiaoshan District of Hangzhou&Jiangnan Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 311201,China;4Zhejiang Institute for Food and Drug Control,Hangzhou 310052,ChinaCorrespongding author:Wang Qing-xia,Email:Abstract Objective To establish a multicomponent quantification method for Guli capsules and explore the application of chemometrics and grey relational analysis(GRA)in the quality evaluation of them.Methods Samples were gradiently eluted with acetonitrile-0.2%acetic acid as the mobile phase based on high-performance liquid chromatography(HPLC)method.The detection wavelengths were 270,430 and 250 nm.A multicomponent quantitative analysis mode was established with puerarin as the internal standard.The comprehensive quality of Guli capsules was evaluated by chemometrics and GRA.Results The results of methodological verification of external standard method(ESM)met the requirements.There was no significant difference between the quantitative results obtained by relative correction factor method and ESM.Chemometrics analysis showed that icariin,puerarin,epimedin,psoralen and curcumin were the representative differential components of Guli capsules.The GRA model was stable,and the relative correlation was from 0.309 5 to 0.614 5.Conclusion The established method wis simple and practical,and chemometrics and GRA could be used to evaluate the overall quality of Guli capsules.Key Words Guli capsules;Quantitative analysis of multi-components by a single marker;Grey relational analysis;Chemometrics;Comprehensive evaluation骨力胶囊由淫羊藿等9味药材配伍，能强筋骨、祛风湿、活血化瘀、通络定痛，主要用于风寒湿痹、腰腿酸痛、肢体麻木，骨质疏松等症的治疗1。可有效缓解疼痛、改善骨代谢指标和骨强度，且安全实验研究性较高2-3。但其现行标准仅对淫羊藿苷进行定量控制，未见其定量研究的报道。近年来，一测多评法（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）技术在中药及其制剂的定量控制中应中国药物应用与监测 2024 年2月 第21卷第1期 Chin J Drug Appl&Monit，Feb 2024,Vol.21,No.1 30 用较为广泛4，其通过建立参照物与其他组分间的相对校正因子，实现多组分的同步检测。化学计量学5及灰色关联度分析（grey relational analysis，GRA）法6也越来越多地用于中药及其制剂的质量评价。本试验采用QAMS法同时检测骨力胶囊中朝藿定A等13个成分含量，运用化学计量学及GRA法对含量数据进行分析，建立其综合质量评价方法，旨为提升该制剂的质控水平和临床疗效的一致性提供数据支持。1材料与方法1.1 一般材料 对照品补骨脂素、异补骨脂素、宝藿苷I、去甲氧基姜黄素、姜黄素、淫羊藿苷、葛根素、双去甲氧基姜黄素和朝藿定 C（中国食品药品检定研究院，批号分别为110739-201918、110738-202016、111852-202104、112003-201501、110823-202107、110737-202017、110752-202217、112004-201501、111780-201905，含量均 94.0%）；朝藿定A、朝藿定B、3-羟基葛根素和3-甲氧基葛根素（成都普瑞法科技开发有限公司，批号分别为15042107、PRF8060841、PRFM71230-01和PRFM71229-02，含量均 97.1%）；乙腈（天津市康科德科技有限公司，色谱级），醋酸（美国 Tedia 公司，色谱级），其余试剂为分析纯；骨力胶囊（每粒装 0.3 g；批号 20200602、20200701、20200902、20200904、20201001、20201101、20210102、20210106、20210201、20210202、20220304、20220305、20220502、20220601和20220604，编号S1 S15，贵州百灵企业集团制药股份有限公司）。HPLC仪（Waters 2695型，美国沃特世科技公司；LC-10AT型，日本岛津公司）；电子天平（QUINTIX型，北京赛多利斯科学仪器公司）；超声波清洗器（FQ-1024型，杭州法兰特超声波科技有限公司）。1.2方法1.2.1对照品溶液制备精确称取朝藿定 A 等13个对照品，用70%甲醇制成质量浓度分别为0.336、0.482、0.858、1.290、0.374、0.246、0.292、1.130、0.218、1.510、0.072、0.756和0.630 mgmL-1混合对照品贮备液。精确吸取贮备液，用溶剂稀释 20 倍配制成 13个成分质量浓度分别为16.8、24.1、42.9、64.5、18.7、12.3、14.6、56.5、10.9、75.5、3.6、37.8和31.5 gmL-1的混合对照品溶液。1.2.2供试品溶液制备精确称取骨力胶囊内容物细粉约0.6 g，置25 mL量瓶，用溶剂超声提取30 min，冷却后定容，摇匀，过滤，续滤液即得。按其质量标准分别制备缺淫羊藿、缺姜黄、缺粉葛、缺补骨脂的4个阴性供试品，依法制成阴性供试品溶液。2结果2.1 方法学验证结果2.1.1色谱条件及系统适用性试验采用 Waters Symmetry C18色谱柱（250 mm4.6 mm，5 m），柱温30；检测波长分别为270 nm7-12检测朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和宝藿苷I；430 nm13-15检测双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素；250 nm16-20检测3-羟基葛根素、葛根素、3-甲氧基葛根素、补骨脂素和异补骨脂素；乙腈（A）-0.2%冰醋酸为流动相，在流速1.0 mLmin-1时梯度洗脱（0 10 min，16.0%A；10 26 min，16.0%25.0%A；26 38 min，25.0%48.0%A；38 50 min，48.0%55.0%A；50 58 min，55.0%68.0%A；58 65 min，68.0%16.0%A）；进样量10 L。精密吸取混合对照品溶液及供试品溶液各10 L，进样并测定曲线图（图1）。结果骨力胶囊供试品溶液中13种成分与相邻色谱峰分离完全；理论板数按葛根素计应不低于6 000；阴性供试品无干扰。2.1.2线性关系考察精确量取混合对照品贮备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分别置于20 mL量瓶中，经溶剂加至标线，摇匀制得朝藿定A等对照品系列溶液，依法进样，测定峰面积，以对照品质量浓度对峰面积作线性回归，结果见表1。表1HPLC法测定13种成分的线性关系成分回归方程线性范围（gmL-1）r朝藿定AY=2.467 9106X+1 575.71.68 84.000.999 4朝藿定BY=2.652 4106X-335.22.41 120.50 0.999 1朝藿定CY=2.703 6106X+1 479.94.29 214.50 0.999 2淫羊藿苷Y=3.375 9106X-833.56.45 322.50 0.999 4宝藿苷IY=2.424 7106X+509.81.87 93.500.999 1双去甲氧基姜黄素Y=1.383 3106X+1 113.61.23 61.500.999 2去甲氧基姜黄素Y=1.803 6106X-578.61.46 73.000.999 1姜黄素Y=3.395 9106X+1 051.85.65 282.50 0.999 43-羟基葛根素Y=1.136 0106X-496.01.09 54.500.999 2葛根素Y=3.232 1106X-907.67.55 377.50 0.999 13-甲氧基葛根素Y=9.112 8105X-1 634.4 0.36 18.000.999 2补骨脂素Y=2.333 2106X-1 310.8 3.78 189.00 0.999 4异补骨脂素Y=2.179 3106X-689.23.15 157.50 0.999 32.1.3精密度、稳定性及重复性取骨力胶囊（S1），按2.1.2项步骤制成供试品溶液，重复进样6次，测定曲线，计算峰面积的RSD值均 2.0%，表明仪器精密度良好。取一份骨力胶囊（S1）供试品溶液，于制备后0、2、5、9、16、24和36 h进样，测定曲线，计算峰面中国药物应用与监测 2024 年2月 第21卷第1期 Chin J Drug Appl&Monit，Feb 2024,Vol.21,No.1 31 A 混合对照品，B 骨力胶囊，C 淫羊藿阴性样品，D 姜黄阴性样品，E 粉葛阴性样品，F 补骨脂阴性样品；1 朝藿定A，2 朝藿定B，3 朝藿定C，4 淫羊藿苷，5 宝藿苷I，6 双去甲氧基姜黄素，7 去甲氧基姜黄素，8 姜黄素，9 3-羟基葛根素，10 葛根素，11 3-甲氧基葛根素，12 补骨脂素，13 异补骨脂素图1HPLC色谱图t（min）mAUA3503002502001501005000510152025303540455055606512345678910111213t（min）mAUB3503002502001501005000510152025303540455055606512345678910111213t（min）mAUC35030025020015010050005101520253035404550556065678910111213t（min）mAUD3503002502001501005000510152025303540455055606512345910111213t（min）mAUF350300250200150100500051015202530354045505560651234567891011t（min）mAUE35030025020015010050005101520253035404550556065678121312345积的RSD值均 2.0%，表明骨力胶囊供试品溶液36 h内稳定。取骨力胶囊（S1）6份，各按1.2.2项方法制成供试品溶液，进样，测定曲线，用外标法计算朝藿定A等13个成分的含量，得含量的RSD值均 2.0%，表明方法重复性良好。2.1.4加样回收率取已知含量的骨力胶囊（S1）内容物9份，均分成3组，每份精密称定0.3 g，分别按低、中、高水平加入混合对照品溶液（朝藿定 A 等对照品质量浓度分别为0.259、0.371、0.638、0.952、0.289、0.172、0.221、0.854、0.115、1.057、0.037、0.589和0.481 mgmL-1）0.8、1.0、1.2 mL，按照2.1.2项步骤处理后，进样，测定曲线，计算得13种成分的平均加样回收率均在96.80%100.18%之间（RSD值均 2.0%）。2.1.5相对校正因子计算精密吸取2.1.4项6个混合对照品溶液进样检测，记录流出曲线图，以葛根素为内参物，参考相关公式4分别计算葛根素与其他成分的相对校正因子的均值为1.306 0、1.211 8、1.201 2、0.954 2、1.331 0、2.332 4、1.781 2、0.950 3、2.837 4、3.558 6、1.380 0和1.478 9（RSD值均 2.0%）。2.1.6相对校正因子重现性考察精确吸取混合对照品溶液，进样，检测曲线，以葛根素为内参物，参考相关公式4分别计算各成分采用色谱柱（Waters Symmetry C18柱、Lichrospher 100 RP-C18柱和Agilent Zorbax C18柱）在仪器（Waters e2695型和LC-10AT型）系统上、流速（0.8、1.0、1.2 mLmin-1）和柱温（25、30、35）条件下的相对校正因子，并计算相应的RSD值，结果各成分相对校正因子的RSD值均 2.0%，表明相对校正因子重现性良好。2.1.7色谱峰定位记录2.1.6项下各成分采用不同色谱柱在不同仪器系统上的保留时间，采用相对保留时间值法考察不同高效液相色谱仪和色谱柱对相对保留时间值的影响，结果各成分相对保留时间的均值为0.249 5、0.296 6、0.366 1、0.438 3、0.531 7、0.697 6、0.752 4、0.781 0、0.935 6、1.062 1、1.189 6和1.225 8（RSD值均 1为阈值，筛选出贡献值较大的淫羊藿苷（VIP=1.857 7）、葛根素（VIP=1.455 7）、朝藿定C（VIP=1.284 7）、补骨脂素（VIP=1.158 6）和姜黄素（VIP=1.020 3），判断这5个成分为骨力胶囊样品中的代表性差异成分。2.3灰色关联度分析（grey relation analysis，GRA）由于骨力胶囊13种成分QAMS法含量数据差异较大，需按照相关公式6对原始数据进行标准化处理，得最优参考序列分别为1.306 9、1.286 4、1.34 5、1.706 3、1.295 a3、1.520 9、1.336 7、1.241 1、1.398 4、1.399 0、1.513 1、1.312 3和1.303 8，最差参考序列分别为0.761 4、0.749 5、0.602 0、0.475 0、0.655 4、0.567 2、0.730 7、0.782 9、0.708 3、0.640 5、0.515 8、0.615 9和0.749 9。再按相关公式6计算各评价单元相对于最优、最差参考序列关联系数、关联度和相对关联度。中国药物应用与监测 2024 年2月 第21卷第1期 Chin J Drug Appl&Monit，Feb 2024,Vol.21,No.1 33 按照GRA分析中相对关联度大小对15批骨力胶囊样品质量优劣进行排序，结果见表3。表315批骨力胶囊相对关联度与质量的排序编号Ri排序S10.444411S20.51948S30.50709S40.53976S50.53037S60.502510S70.396412S80.309515S90.354413S100.342614S110.59062S120.58503S130.61451S140.54324S150.542853讨论在前期预试验中分别考察了提取溶剂、提取方式、提取时间，结果发现70%甲醇提取30 min时，13种成分的色谱峰响应值较大、峰形均较好，且操作简单。同时还考察了不同色谱系统、不同洗脱程序对供试品溶液色谱图的影响。结果显示乙腈-0.2%冰醋酸运行时，所得色谱图中基线平稳、色谱峰数量较多。各成分响应值最大、分离度最好。本文选取淫羊藿的有效成分朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和宝藿苷I，姜黄的特征成分双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素，粉葛的代表性成分3-羟基葛根素、葛根素和3-甲氧基葛根素，补骨脂的活性成分补骨脂素和异补骨脂素为目标成分，建立了骨力胶囊QAMS多组分定量控制方法，所建立的质控模式操作便捷、结果准确。从13个指标成分的含量检测结果可以看出，不同批次间各指标成分含有量存在一定差异，表明多组分定量控制方法的建立对稳定骨力胶囊整体质量具有一定的指导意义。GRA模型综合评价结果与化学计量学聚类结果基本一致，能够对骨力胶囊质量优劣进行综合评价。本试验以葛根素为内参物，采用QAMS法同时检测骨力胶囊中13个成分含量，所建立的方法可用于骨力胶囊的质控研究。化学计量学联合GRA综合评价模型全面可靠，避免了人为主观性，有助于完善骨力胶囊制剂生产过程控制参数，该模型可作为不同来源骨力胶囊质量优劣的综合评价方法。参考文献1 国家药品管理局.国家药品标准WS-11450（ZD-1450）-2002-2012ZS.2012.2 张伟，刘兆力，汤波，等.骨力胶囊联合鲑鱼降钙素注射液治疗老年骨质疏松症的效果及对骨代谢指标的影响J.中国医药导报，2021，18（6）:107-110.3 王戈，刘煊文，高志，等.骨力胶囊联合鲑降钙素治疗老年骨质疏松症的临床研究J.现代药物与临床，2019，34（8）:2473-2476.4 闫艳，杜晨晖.一测多评法在中药质量控制中的应用及研究进展J.世界科学技术-中医药现代化，2022，24（6）:2378-2387.5 陈薇娜，冯霞，陈丹丹，等.基于高效液相色谱一测多评法联合化学计量学的决明降脂片综合质量评价J.中国药物应用与监测，2022，19（2）:83-87.6 邹佳莉，王康宇，何文媛，等.基于熵权法和灰色关联度分析对当归道地产区划分研究J.中药材，2022，45（5）:1173-1178.7 吴蕾.一测多评法同时测定不同产地淫羊藿提取物中的 4 种黄酮类成份J.中国兽药杂志，2022，56（8）:80-86.8 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