基因编辑及全基因组选择技术在水稻育种中的应用展望.pdf

中国水稻科学(Chin J Rice Sci),2024,38(1):112 http:/ 1 DOI:10.16819/j.1001-7216.2024.230503 基因编辑及全基因组选择技术在水稻育种中的应用展望 梁楚炎1,2 巫明明2 黄凤明1,2 翟荣荣2 叶靖2 朱国富2 俞法明2 张小明2 叶胜海2,*(1中国计量大学 生命科学学院，杭州 310018；2浙江省农业科学院 作物与核技术利用研究所，杭州 310021；*通信联系人，email:)Prospects for the Application of Gene Editing and Genomic Selection in Rice Breeding LIANG Chuyan1,2,WU Mingming2,HUANG Fengming1,2,ZHAI Rongrong2,YE Jing2,ZHU Guofu2,YU Faming2,ZHANG Xiaoming2,YE Shenghai2,*(1 College of Life Science,China Jiliang University,Hangzhou 310018,China;2 Institute of Crop and Nuclear Technology Utilization,Zhejiang Academy of Agricultural Science,Hangzhou 310021,China;*Corresponding author,email:)Abstract:Rice is the main grain crop in China.Due to large population and limited land resources in China,rice breeding goals have long been yield oriented.Chinese researchers have continuously achieved breakthroughs in rice breeding technology,and the adoption of dwarf breeding and hybrid rice breeding technology has resulted in two significant leaps in rice yield in China.However,with the improvement of living standards and the increasing frequency of extreme weather events,higher demands have been placed on rice in terms of yield,quality,and resistance.At present,biotechnology is undergoing constant innovation,particularly with the rapid development of gene editing and genomic selection breeding technology.This progress is expected to provide robust support for the development of new rice varieties with high yield,superior quality,and resistance to multiple factors.It helps promote the green and sustainable development of rice production.This paper reviews the recent advancements in gene editing technology and genomic selection technology in rice breeding for high yield,superior quality,disease and insect resistance,stress tolerance,and heterosis.The goal is to provide breeding strategies for the efficient development of new varieties to meet demands.Key words:rice;breeding techniques;gene editing;genomic selection 摘 要：水稻是我国主要的粮食作物。由于我国人多地少的现状，长期以来水稻的育种目标是以产量为导向。我国科研人员通过协同攻关实现了水稻育种技术突破，矮化育种和杂交水稻育种技术的利用促进了水稻产量两次大的飞跃。随着我国消费者生活水平的提高以及极端天气出现的频次上升，水稻育种对品质、抗性与耐逆等也提出了更高要求。目前，生物技术正在不断革新，特别是基因编辑和全基因组选择育种技术的迅速发展，为高产优质多抗耐逆的水稻新品种选育提供强有力支持，推动着我国水稻生产向绿色可持续发展。本文就基因编辑技术和全基因组选择技术在水稻高产优质、抗病虫、耐逆及杂种优势育种应用中的新进展进行简述，旨在为高效培育能够满足市场需求的水稻新品种提供一些育种思路。关键词：水稻；育种技术；基因编辑；全基因组选择 我国水稻育种目标长期以产量为导向。20 世纪 50 年代末黄耀祥成功选育“广场矮”，促使水稻育种步入矮化育种时代，水稻单产提高了约20%；袁隆平发现野败型不育株，开创了“第一代杂交水稻技术”，即三系法，利用细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility,CMS）的育种系统进一步提升了水稻的单产和总产；随后研发“第二代杂交水稻技术”，即两系法，开创了隐性光/温敏雄性不育的育种系统（photoperiod/thermo-sensitive genic male sterile，PTGMS）。目前，以遗传工程结合基因工程手段的“第三代杂交水稻技 术”，即 利 用 OsNP1 突 变 致 使 雄 性 不 育（nuclear male sterile，NMS）构建的育种系统也已成熟。依据杂种优势理论，近年来“籼母粳收稿日期：2023-05-11；修改稿收到日期：2023-07-18。基金项目：浙江省水稻新品种选育重大科技专项（2021C02063-5）；海南省重点研发计划资助项目（ZDYF2023XDNY086）；浙江省部共建农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室开放课题资助项目（2010DS700124）；浙江省“尖兵领雁”研发攻关计划资助项目（2023C02055、2022C02034）。2 中国水稻科学(Chin J Rice Sci)第 38 卷第 1 期(2024 年 1 月)父”和“粳母籼父”亚种间杂交水稻育种较好地解决了不亲和的技术难点，使新品种（组合）培育取得了新的突破，甬优系列、浙粳优系列等一批超高产籼粳杂交稻品种在生产上得到了广泛应用1-3。在国家科技计划的支持下，我国科学家在水稻高产优质、抗病虫、耐逆等基因功能方面开展了广泛研究，储备了大量重要基因和相关种质资源，为生命科学前沿问题与育种实践有机结合的分子模块设计育种奠定了坚实基础。前期，育种家利用分子标记辅助选择育种技术定向筛选含目标基因的新品系，培育新品种，如香型高产优质、综合抗性好的宁香粳 9 号，半糯性兼具条纹叶枯病抗性的南粳 9108，具有多个稻瘟病抗性基因和Bph3 褐飞虱抗性基因的浙粳 99 等。另外，育种家利用转基因育种技术定向改良目标性状培育出新品系，如耐除草剂株系、水稻胚乳富含花青素的“紫晶米”、高抗条纹病的株系、“黄金大米”等4-7。转基因育种的发展，为后续基因编辑育种奠定扎实基础。国际农业生物技术应用服务组织（ISAAA）转基因产品审批数据库显示，在已批准商品化种植转基因作物的主要国家中，转基因作物种植比例已经接近饱和，性状集中在抗虫和耐除草剂。以“华恢 1 号”、“Bt 汕优 63”为代表的抗病虫、耐逆优质转基因水稻，在 2009 年获得了安全证书，说明我国转基因水稻技术完全成熟，具备自主创新能力及产业化条件。但 20102013 年间出于对转基因安全性的考虑，国家转基因政策趋向保守，致使我国水稻转基因产业化处于停滞阶段。生物育种是培养优良生物的生物学技术，水稻育种由 1.0 时代的人工驯化（水稻矮化选育）、2.0 时代的传统育种（杂种优势利用）到 3.0 时代的分子标记辅助育种和转基因育种，技术的不断进步与突破，使水稻产量得到大幅度提高，而基因编辑技术和全基因组选择技术等生物技术也正在与传统育种、大数据、人工智能等技术进行融合，推动着水稻生物育种技术的变革8。如今，在例如乌俄冲突等国际复杂环境和国内极端高/低温、干旱等自然灾害方面频发的情况下，我国在实现粮食自给可控，提升农业全球竞争力等方面面临诸多严峻挑战。20212023 年中央一号文件均提及生物育种的重要性，有望推动我国生物育种技术的应用，以确保我国种子及粮食安全，改变当前我国处于以杂交选育为主、前沿生物育种技术未大量投入水稻实际生产应用的 2.0 阶段育种局面。基因编辑育种及全基因组选择育种作为生物育种技术的重要组成，是当前水稻育种技术受关注重点。前者在近十年的研究中已积累大量经验，后者也初有成果。因此，本文就基因编辑技术和全基因组选择技术在水稻高产优质、抗病虫、耐逆、杂交优势利用方面的一些新进展进行简述，旨在为水稻产量和质量的进一步提升提供一些思路。1 水稻基因编辑技术和水稻全基因组选择技术 水稻基因编辑育种可以获得不含外源 DNA 的遗传变异植株。基因编辑技术的迭代是从锌指核酸酶（ZFNs）到转录激活样效应因子核酸酶（TALENs），再到 CRISPR/Cas9 高效基因编辑系统9-10。这些技术应用于水稻基因编辑可获得不含外源 DNA 的遗传变异植株。基于 CRISPR 又发展出碱基编辑器(Base Editor，BE)、引导编辑器（Prime Editor，PE）等技术11-12。融合胞苷脱氨酶的碱基编辑，可以在不断裂 dsDNA 前提下实现单碱基 CT（或 GA）的取代，应用于编辑OsEPSPS 基因后可获得耐草甘膦新种质13。随后各类碱基编辑器接踵而至，如各具特点的腺嘌呤单碱基编辑器（A/TG/C）、糖基化酶单碱基编辑器（CG 互换）、双碱基编辑器（CG/TA 同时互换）等。2019 年报道的引导编辑器（PE 系统）融合了逆转录酶，并在 sgRNA 3末端引入逆转录模板、引物结合位点序列，经不断优化后建立了适用于植物的引导编辑系统（Plant Prime Editing，PPE）并成功应用于水稻14。2023 年朱健康团队采用定向寡核苷酸介导靶向敲入（DOTI）技术，实现了对内源蛋白的高效检测。在水稻 Xa23 基因启 动 子 区 域 靶 向 敲 入 顺 式 元 件（AvrXa7/PthXo3EBE元件或 TalC EBE元件），获得了对特定白叶枯病菌株具有抗性的水稻植株，实现了该基因编辑系统在育种中的应用15。近十年来，随着基因编辑技术的逐渐成熟，种植两代即可获得稳定性状的个体，为水稻性状改良提供了高效精确的诱变手段，在缩短育种周期、培育综合抗性强的水稻品系方面具有重要作用，并在基因研究等方面展示出巨大的潜力。此外，多靶标编辑还可以实现复杂性状的定向改良16。全基因组选择育种（genomic-wide selection breeding）通过收集分析不同自交系相互配组产生梁楚炎等：基因编辑及全基因组选择技术在水稻育种中的应用展望 3 的训练群体（training population，TP）的表型与基因型数据，能够建立起表型与基因型关联模型，进而通过该模型计算预测群体的预估育种值（genomic estimated breeding value，GEBV），有利于利用大量全基因组标记结合表型数据建立模型，在全基因组范围预测目标性状在新品系中的潜能，分析遗传变异数据预测该性状的表型及选择后代品系优良的杂交亲本组合，在早期就可以实现个体表型预测和选择，减少育种工作量，缩短育种周期。与分子标记辅助选择育种相比，全基因组选择在多基因调控的数量性状上具有更高的效率，在实际应用中，不受常规种或杂交种的限制17。Vincent 等18发现水稻超过 90%抽穗期表型变异可以通过构建模型进行预测。He 等19利用1999 份水稻种质材料对 6 种不同性状的进行表型测定，证实了在籼稻和粳稻两个亚种内部的各亚群间，以及籼稻与粳稻两个亚种间构建复合训练群体的可行性。在对 575 份材料（2 054 293 个SNP）进行全基因组选择时发现，只需 SNP 的数据量达到 5000，预测准确性即可达到峰值20。此外，全基因组选择育种仅涉及低成本的高通量分子标记、精准的基因效应分析模型和准确的性状测定17，相较于其他前沿育种技术，该育种技术并未在生物安全性方面引发争议。目前，全基因组选择育种应用主要集中在家禽、家畜上，在玉米、小麦上的报道也较多，但在水稻上的研究应用尚不多见。2 前沿生物育种技术在水稻高产优质方面的研究应用 2.1 基因编辑技术 水稻株型、穗型和粒型是与产量相关的重要性状，目前已有不少实例证明基因编辑技术可以用于这些重要性状的改良。例如，编辑理想株型基因 IPA1 顺式调控区，获得 54 bp 缺失的品系IPA1-Pro10，定向改良株型与穗型，使水稻产量增加 15.9%21。通过编辑生长素运输基因 SD8 改良株型，实现在密植条件下水稻产量的提高22。在穗型和粒型方 面，OsKRN2 与功能 未 知 基 因DUF1644 协同调控穗分枝，负调控籽粒数，敲除OsKRN2 可在不影响其他农艺性状的前提下增产约823。OsMADS17 是一个同时调控穗粒数和粒重的关键基因，并参与调控 OsAP2-39 的表达。OsMADS17 5UTR 区域缺失 65 bp 片段，可使其mRNA 翻译效率降低，导致穗粒数和粒重增加，产量提高24。多靶标敲除粒重主要基因 GW2、GW5、TGW6，突变体粒重增加25。多靶标敲除穗长基因 OsPIN5b、籽粒大小基因 GS3 及耐寒基因OsMYB30，可获得兼具耐冷性的新型高产水稻资源26。基因编辑在探究多效性基因、解析多基因联动调控水稻产量的机理方面有着较好的效果，如 sg2(small grain2)基因的纯合敲除株系的株型、穗型及粒型均有新的表型 27。GBSS（Wx）是引起水稻中直链淀粉含量不同的关键因子，OsGBSS受 Wxb第 1 内含子调控。Wxb第 1内含子中一个 G突变成 T以及高温胁迫两种情况均可以导致其剪接效率和 GBSS蛋白含量降低，影响稻谷品质28-29。万建民院士团队发现编辑 Dull 基因，胚乳中 Wx 的 pre-mRNA剪接、部分 miRNA 加工受影响，降低 Wxb第 1 内含子剪接效率，GBSS活性降低30。此外，通过编辑 Wxb第 1 内含子，使稻米直链淀粉含量提升约 1131；编辑 Wxb核心启动子 TATA 盒，可获得多个微调直链淀粉含量的新 Wx 等位基因32；刘耀光院士团队通过编辑 Wxa 5UTR 内含子剪接点，使籽粒直链淀粉含量降低了约 10%，成功创制出软米新种质33。高彩霞团队编辑 Wxb N-末端结构域，获得了一系列具有低直链淀粉含量（1.4%11.9%）的突变体34。水稻籽粒主要成分为淀粉，人体摄取普通淀粉极易快速吸收转化为血糖，进而诱发敏感人群的相关疾病。普通大米抗性淀粉通常低于1%，如何提高抗性淀粉含量，是水稻优质改良的另一重要研究方向。对 SS3a、SS3b 进行单敲及共敲除，ss3a 单敲突变体抗性淀粉显著增加至4.7%5.0%，可消化淀粉含量及消化速率均大幅度降低，双敲突变体进一步表现出显著差异，抗性淀粉增含量至 9.5%9.7%，创制出新的营养健康型水稻种质35。水稻香味是优质水稻的评判点之一，胡培松团队编辑 OsBADH2，获得了香味主要化合物 2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）显著积累的水稻新种质36。稻米蛋白质含量影响稻米的食味品质。Yang等37利用 CRISPR/Cas9 对谷蛋白基因家族中高表达的 8 个基因进行同时敲除，获得 7 种不同基因突变组合的突变体。在不影响其他储藏物质含量及各项农艺性状、稻米外观等的情况下，稻米蛋白含量均不同程度下调。此外，对 DEP1 定点编辑发现该蛋白 C 端的长度可以平衡稻米品质与产量之间的关系，较长的 C 端利于品质的提升，较短的4 中国水稻科学(Chin J Rice Sci)第 38 卷第 1 期(2024 年 1 月)C 端利于产量的提高，通过靶向编辑 DEP1 基因可以协同改良稻米品质与产量，从而实现稻米 的优质高产38。2.2 全基因组选择技术 全基因组选择对水稻产量相关性状具有较强的预测能力。选取产量、籽粒形态及生物量相关的 7 个性状构建模型，对全基因预测准确性进行评估，发现在高遗传力的性状上全基因组预测的准确性较高，例如粒长、粒宽39。在颖花长度、抽穗期及穗长方面，对 475 份水稻材料采用两种预测模型进行预测验证，这三个性状的预测值均大于 0.5，具有较好的预测准确性40。通过利用国际水稻研究所 363 份优良水稻品种构建产量、株高和开花时间预测模型，预测结果与实际验收数据间无显著差异41。张启发院士团队首次使用标记推断的亲属关系矩阵对杂交后代的产量和千粒重潜力进行预测。利用重组自交系随机选取的 278 个组合作为训练群体，结合经典的 GBLUP模型对 21 945 份杂交材料产量相关性状进行预测，显示有 100 份杂交组合的预测产量超平均产量的 16%42。基于国际水稻研究所 3 024 份水稻测序数据构建的模型在籽粒产量、秸秆生物量和抽穗期上具有较高的预测精度。利用该模型筛选出表现最优的两份材料得到了成功应用，同时还筛选出适宜在非洲撒哈拉以南土壤肥力差、肥料施用量低的地区种植的水稻材料，解决了该地区水稻因缺磷导致产量低下的问题43。以上研究利用基因组选择技术加速了基因资源库在作物改良中的应用，并提供了明确的经验数据。目前已有的报道主要集中在株高、抽穗期、稻米外观品质等性状上，表明全基因选择技术在水稻的开发及应用上有很大的发展空间。根据目前数据分析，全基因组选择技术在稻米品质方面的研究还鲜有报道，未来运用全基因选择技术对水稻高产优质改良会将水稻育种提高至新维度。3 前沿生物育种技术在水稻抗病虫、耐逆方面的研究应用 3.1 基因编辑技术 目前，基因编辑技术已经在稻瘟病、白叶枯病、二化螟、线虫等生物胁迫抗性育种中得到了广泛的应用，提高抗性兼顾主要农艺性状和品质性状，在未来育种中具有广阔的应用前景。如利用 CRISPR/Cas9 编辑广谱抗稻瘟病基因 Bsr-d1、Pi21 和 ERF922，单突或三突变体均具有较高的稻瘟病抗性，其中 pi21 或 erf922 单突变体对白叶枯病的抗性也增强44。水杨酸是植物抗病反应的重要信号物质，敲除水杨酸羟化酶家族基因 OsS5H1或 OsS5H2，可以在产量不变的前提下提升水稻对稻瘟病及白叶枯病的抗性45。水稻蛋白激酶OsMPK5 磷酸化 OsCPK18 第 50 位的苏氨酸，编辑 OsMPK5 在 OsCPK18 上的磷酸化位点，意外获得 OsCPK18-GE 新等位基因，可同时提高水稻产量和稻瘟病抗性46。Xa13 对水稻白叶枯病抗性起正向调控作用，但对水稻育性起负向调控作用。编辑 Xa13 基因启动子部分序列，包括病原菌诱导表达元件，突变体仅丧失了病原体诱导基因表达的能力，叶片和花药中基因表达不受影响，从而兼具正常产量和白叶枯病抗性47。OsSWEET 家族是 水 稻 抗 白 叶 枯 病 主 要 基 因。多 靶 标 编 辑OsSWEET11、13、14 启动子上效应子结合元件，可以培育出广谱白叶枯病抗性水稻资源48；高彩霞 团 队 利 用AFID-3（APOBEC-Cas9 Fusion-induced Deletion Systems-3）系 统 靶 向 水 稻OsSWEET14 基因启动子上的效应子结合元件，获得了多核苷酸删除的突变体植株，经白叶枯病接种试验发现，相较于 12 bp 的插入缺失，该系统产生的多核苷酸删除水稻突变体对白叶枯病菌的抗性更强49。水稻害虫二化螟的防治一直依赖化学手段。湖南农业大学致力于寻找基于生殖发育调控的害虫防控新策略，利用 CRISPR 敲除二化螟自身FAR 基因，证明了该基因的缺失可显著降低二化螟存活率，再利用寄主诱导的基因沉默(host induced gene silencing，HIGS)技术成功构建了表达dsFAR 的转基因水稻株系，dsFAR 能被水稻内切酶切割为特异的 siRNAs，以具有较高 dsFAR 表达水平的水稻株系进行室内外饲喂生物测定实验，发现二化螟在取食过程中可有效吸收外源 siRNAs从而高效沉默靶基因，导致其死亡率升高50。对OsWRKY53 进行 RNAi 处理，所得突变体显著提高了对二化螟的抗性，以该突变体为食的幼虫数量约为以野生型为食的幼虫 65%51。水稻铜金属伴侣蛋白基因 OsHPP04 是拟禾本科根结线虫的感病基因，OsHPP04 敲除突变体的活性氧水平胼胝质沉积累及防卫相关基因表达均明显提高，突变体 Oshpp04 中线虫总虫数及雌虫数均显著下降，而其他农艺性状无明显影响，这一研究为线虫抗梁楚炎等：基因编辑及全基因组选择技术在水稻育种中的应用展望 5 病育种提供了一种新的思路52。研究人员在挖掘水稻具有根结线虫抗性背后发挥作用的基因时，利用 CRISPR/Cas9 排除了候选基因，成功鉴定水稻根结线虫抗性基因 MG1（M.GRAMINICOLA-RESISTANCE GENE 1）53。近年来，随着基因编辑技术在水稻育种中应用愈发成熟，通过基因编辑优化内源基因的时空表达特性成为水稻育种的重要方式。水稻中靶向敲入翻译增强子，在不改变内源基因转录水平的情况下，上调 OsWRKY71 或 OsSKC1 的翻译水平，能有效提高水稻对非生物胁迫的抗性54。OsHYPK调节水稻 N 末端乙酰基转移酶（Nat A）的活性及该酶作用底物 N 端残基的乙酰化，敲除该基因会导致由非生物胁迫诱导引发的自身蛋白降解，Nat A 失活，获得抗旱耐盐水稻种质55。脱落酸(ABA)能有效增强植物的综合抗性，抵抗逆境56。水稻AFP 家族基因 AFP1(MODD)编辑后可以降低水稻对脱落酸的敏感性，提升水稻耐旱耐热能力57。Ca2+信号通路的转录因子 SCT1 和其同源基因SCT2 敲除突变可以增加蜡含量和合成基因的表达水平，进而增强水稻的耐热性58。水稻作为低温敏感作物，孕穗期冷害会造成水稻的严重减产，当日均温度低于 20或高于 35，水稻育性急剧下降。OsWRKY53 是赤霉素生物合成基因的上游调控基因，在水稻孕穗期耐冷性中起负调控作用。Oswrky53 突变体在正常生长条件下，产量不受影响，经低温胁迫后，其产量高于野生型。对该基因敲除发现，突变体孕穗期耐冷性增强，花粉活力增加，植株结实率提高59。盐胁迫方面，利用 CRISPR/Cas9 系统编辑粳稻品种连粳 11 OsRR22 基因，在不影响原遗传背景的产量性状下获得稳定遗传且无外源基因插入的耐盐水稻材料60。除草剂方面，基因“敲高”策略为水稻基因编辑育种创造了新的技术应用方式，芦钰等61敲除 PPO1、HPPD 基因附近的高表达基因 CP12、Ubiquitin2，CP12、Ubiquitin2 启动子分别驱动 PPO1、HPPD 高水平表达，培育出新的抗除草剂水稻资源。野生稻比栽培稻对生物及非生物胁迫抗性更强，除通过传统水稻育种方式使“绿色”性状富集，利用基因编辑等生物技术将野生稻的抗性基因聚合在栽培稻上，可实现水稻“绿色高产”62。3.2 全基因组选择技术 立枯丝核菌侵染引起严重的水稻纹枯病，可导致水稻严重减产。培育抗纹枯病水稻是最直接有效的策略，但纹枯病相关抗性 QTL 报道较少，可利用的种质资源十分稀缺。Mahanesh 等63利用1545 份水稻重组材料，通过 BayesB 和 GBLUP 模型获得了高精准度的水稻抗纹枯病预测能力，并且随着 SNP 标记数据包增加，其预测能力显著提高。全基因组预测也被应用在水稻抗稻瘟病研究中，Huang等64利用 161 份非洲水稻材料和 162份美国水稻材料评估 7 种模型的准确性，评估全基因组选择技术在改善稻瘟病抗性上的作用，发现由分离株系数据构建的模型，能很好地预测其余株系的抗病性，其中，GBLUP 模型对该性状的预测准确度最高可达 0.72。水稻非生物胁迫育种中，耐高/低温胁迫与水稻根系性状备受关注，这类表型属数量性状，受多个基因联合调控，遗传结构复杂。以 246 份水稻三叶一心时期幼苗在高温条件下的存活率为耐热指标，获得 4 个耐热表型关联位点，包含钙调节蛋白、泛素偶联酶等 21 个基因65。对 529 份水稻材料在干旱条件下分析其根系表型，鉴定出 21个性状相关的 264 个 QTL，其中大部分已有文献报道66。虽然目前利用全基因组选择育种技术预测其他耐逆性状的报道较少，但相关遗传基础的研究可以为今后相关表型采集提供基础，利于创建相应全基因组选择育种模型。4 前沿生物育种技术在水稻杂种优势利用方面的研究应用 4.1 基因编辑技术 杂交稻育种展现了杂种优势潜能，为水稻的高产稳产及世界粮食安全提供了重要保障。由于杂交稻 F1存在性状分离，不能通过自留种的手段应用于农业生产。因此，需要种子公司重复繁琐的流程生产杂交种，但该过程极易受环境因素影响，导致制种产量低，也使杂交种的价格居高不下。如何实现杂交稻自留种，一直被认为是杂交育种的最高目标。将无融合生殖方式引入杂交水稻中，有望实现杂交稻自留种。CRISPR/Cas9 敲除F1杂交种 PAIR1、REC8、OSD1 获得了抑制减数分裂的突变体材料 MiMe，后代植株均表现为四倍体；在此背景上增加卵细胞特异性启动子 EC1.2驱动水稻 BBM1 基因，后代植株保留了杂合亲本基因型，表明 MiMe 突变结合 BBM1 卵细胞表达诱导可以实现水稻高效无性繁殖，即允许杂交 F1进行非常有效的克隆繁殖实现自留种67。此外，6 中国水稻科学(Chin J Rice Sci)第 38 卷第 1 期(2024 年 1 月)多靶标编辑籼粳杂交稻 REC8、PAIR1、OSD1、MTL 四个内源基因，多靶标敲除常规稻 REC8、OsSPO11-1、OSD1、MTL 均可获得无融合生殖的水稻种质，建立水稻无融合生殖体系，实现杂合基因型的固定68-69。在杂交水稻制种中，雄性不育系柱头外露率（SER）是关键因素。多靶标敲除粒形调控基因GS3、GS9 和 GW8，在不影响各项农艺性状前提下实现 SER 提升 50%以上，水稻异交结实率也显著提高70。在中花 11 中敲除 DFOT1（Diurnal Flower Opening Time 1）基因或与之直接相互作用的果胶甲基酯酶基因 PME40，均导致细胞壁变软，使得浆片细胞更易吸水膨胀，推开颖壳，使开花时间提前。将籼型 DFOT1 导入粳稻中可促进其在早晨开花。在籼型晚开花水稻和粳型不育系中敲除 DFOT1 都可以促进它们开花71。若将该技术运用在籼粳杂交制种上，能解决籼稻在早晨开花，粳稻在接近中午或午后开花，这个由花时不遇现象导致的籼粳杂交制种产量极低难题，有望实现制种产量的突破。此外，研究者发现双敲除基因OsSWEET11a、OsSWEET11b 可以获得抗水稻细菌性枯萎病的雄性不育材料72。杂种优势的应用重在杂交种子的生产，雄性不育的利用是亲本间杂交的先决条件。利用CRISPR/Cas9 技术编辑籼型恢复系台恢 31 温敏雄性核不育基因 TMS5，可以获得全新水稻温敏雄性不育系，使传统杂交转育方法对水稻两系不育系选育限制得到突破73。而在四倍体中编辑温敏基因 TMS5，无论自然或控温条件，日平均温度为 2326时，突变体均表现为不育；与四倍体杂交后，可以将杂种优势高水平保持几代，为水稻四倍体温敏核不育系研发提供了新的思路74。4.2 全基因组选择技术 通过所有杂交后代在大田的真实表现评估其杂种优势潜能，需要大量的人力物力，且周期长。使用较高预测准确率的预测模型，可以对种质资源的遗传实质进行可靠的预测，显著提高种质的利用效率，缩短在育种过程中选择亲本及评估杂交组合田间表现所需的时间。黎志康等75对杂交育种预测模型进行比较，发现线性无偏预测为最佳模型，对 44 636 份潜在杂交种的杂交优势进行预测，得到了包含 10 个性状的综合育种指标，并认为该方法有望成为水稻杂交育种的有效辅助方法。利用 2 种环境 575份杂交材料的 8个性状构建模型，预测 120 份材料与其他材料杂交后代优良性状的表现潜能，对高遗传力性状（如株高）和低遗传力性状（如籽粒产量）都呈现出较高且稳定的杂交预测能力76。依据籼粳稻亚种内杂交组合的实际产值构建模型，用来预测亚种间杂交组合的产量，亚种间的产量预测值比亚种内的产量高，并对产量预测值得分前 20 个亚种间杂交组合进行分析，发现这些组合在小穗育性上与预测数值相近。结合其他表型预测得分，推荐的杂交组合中，亲本包括一些广泛种植的优质高产品种，如黄华占、空育 131等39。全基因组选择技术在杂交种中的预测只需获取一定量杂交组合表型数据，就可以构建模型来分析杂交组合的其他表型和预测其他材料的表型，因此全基因组选择技术在水稻杂种优势利用育种中具有显著优势。5 总结与展望 水稻育种优良农艺性状包括株型、穗型、穗数、粒重以及品种的广适性、对生物及非生物胁迫的抗性等。随着生物技术的发展，水稻品种的培育从经验育种向精准育种转变。究其根本，是通过生物技术明确各农艺性状调控的分子机制，并利用生物育种技术聚合各优良农艺性状的调控基因，对水稻品种进行定向改良。基因编辑育种在水稻高产优质、抗病虫、耐逆、杂种优势利用等作物改良中开展了大量的基础研究，创制了各种水稻新种质，储备了丰富的技术应用理论（表 1）。但不可否认的是，该技术手段主要用来敲除基因，尽管有芦钰等60突破性敲高培育出新抗除草剂水稻资源的报道，但正向调控基因敲入或敲高中的研究依旧匮乏。此外，农业农村部 2022 年和 2023 年分别发布了农业用基因编辑植物安全评价指南（试行）、农业用基因编辑植物评审细则，2023 年中国第一个农业用基因编辑生物获得安全证书，这些举措正加快基因编辑作物的产业化应用，促进基因编辑技 术 在 我 国 从 技 术 研 究 到 商 品 应 用 的 转 变（http:/ 2），但在水稻改良研究中仍处于基础 梁楚炎等：基因编辑及全基因组选择技术在水稻育种中的应用展望 7 表 1 基因编辑在水稻育种中的应用 Table 1.Application of gene editing in rice breeding.基因名称 Gene name 方法 Method 编辑区域 Editing region 表型 Phenotype 参考文献ReferenceIPA1 敲除 Knockout 顺式调控区 Cis-regulatory element产量提高 15.9%15.9%increase in yield 21 SD8 敲除 Knockout 外显子 Exon密植条件下增产 10%10%increase in yield 22OsKRN2 敲除 Knockout 外显子 Exon增产 8%8%increase in yield23OsMADS17 敲除 Knockout 5UTR 穗粒数、粒重增加 Grain number and weight increased 24GW2,GW5,TGW6 敲除 Knockout 外显子 Exon 粒重增加 Grain weight increased 25 OsPIN56,GS3,OsMYB30 敲除 Knockout 外显子 Exon高产、耐冷 High yield and cold resistance increased 26Dull 敲除 Knockout 外显子 Exon直链淀粉含量下降 Decreased amylose content 30Wxb 敲除 Knockout TATA box微调直链淀粉含量 Fine-tune amylose content 32Wxa 敲除 Knockout 5UTR直链淀粉含量下降 Decreased amylose content 33Wxb 敲除 Knockout N-末端结构域 N-terminal domain低淀粉含量 Low starch content 34 SS3a,SS3b 敲除 Knockout 外显子 Exon 抗性淀粉增加 Resistant starch increased 35 OsBADH2 敲除 Knockout 外显子 Exon 稻米香味增加 Aroma of rice increased 35 OsGlus 敲除 Knockout 外显子 Exon 稻米蛋白质含量下降 Decreased protein content 37 DEP1 敲除 Knockout 蛋白质 C端 C-terminus 提高产量和稻米品质 Improved yield and rice quality 38 Bsr-d1,Pi21,ERF922 敲除 Knockout 外显子 Exon 稻瘟病及白叶枯病抗性增强 Resistance to rice blast and rice bacterial blight was enhanced 44 OsS5H1,OsS5H2 敲除 Knockout 外显子 Exon 稻瘟病及白叶枯病抗性增强 Resistance to rice blast and rice bacterial blight was enhanced 45 OsMPK5 敲除 Knockout 磷酸化位点Phosphorylation site 产量及稻瘟病抗性提高 Yield and blast resistance improved 46 Xa13 敲除 Knockout 启动子 Promoter 产量不变、强白叶枯病抗性 Unchanged yield and stronger resistance to rice bacterial blight47 OsSWEET11,13,14 敲除 Knockout 启动子 Promoter 广谱白叶枯病抗性 Broad-spectrum rice bacterial blight resistance 48 OsSWEET14 敲除 Knockout 启动子 Promoter 白叶枯病抗性增加 Increased resistance to rice bacterial blight 49 FAS HIGS 二化螟存活率下降 Survival rate of C.suppressalis decreased 50 OsWRKY53 iRNA 二化螟抗性增加 C.suppressalis resistance increased 51 OsHPP04 敲除 Knockout 外显子 Exon 对拟禾本科根结线虫抗性增加 Resistance to Meloidogynegraminicola increased 52 OsWRKY71,OsSKC1 敲入 Knock-in 增强子 Enhancer非生物胁迫抗性增加 Increased resistance to abiotic stresses 54OsHYPK 敲除 Knockout 外显子 Exon 抗旱耐盐 Increased droug