基于转录组测序与定量PCR技术挖掘北沙柳株型相关候选基因.pdf

浙江农业学报 ():/.贺嵘赵恺贺玉娇等.基于转录组测序与定量 技术挖掘北沙柳株型相关候选基因.浙江农业学报():.:/.收稿日期:基金项目:内蒙古自治区自然科学基金项目()内蒙古自治区科学技术厅项目()作者简介:贺嵘()女山西朔州人硕士研究生研究方向为林木遗传育种:.通信作者张国盛:.基于转录组测序与定量 技术挖掘北沙柳株型相关候选基因贺 嵘赵 恺贺玉娇阿拉腾苏和王爱君宁 静韩若霜孙贵荣张国盛(.内蒙古农业大学 林学院内蒙古 呼和浩特 .鄂尔多斯市造林总场内蒙古 鄂尔多斯 .内蒙古林业科学研究院内蒙古 呼和浩特 .内蒙古自治区林业和草原种苗总站内蒙古 呼和浩特)摘 要:为构建北沙柳株型分子辅助育种体系实现高效定向育种采用水培群体转录组测序与野外训练群体定量 分析相结合的方法以 分析中的基因表达量(值)与冠高比(株型特征值)的相关系数作为预测值探讨北沙柳株型相关候选基因挖掘技术 结果表明北沙柳冠高比与 值间存在相关性在水培预测群体和野外训练群体中保持基本一致的趋势 文献中已报道的株型(或者分枝)相关基因(、和)的预测值在 、和 基因(未报道与株型相关)的预测值较高()按照“基因个数最少相关系数最高”的原则选择双基因组合 作为鉴别北沙柳株形的基因 将形态学、转录组学作为一个整体来挖掘株型性状相关基因是本研究特色研究结果也可为其他植物、其他性状的分子辅助育种提供理论基础关键词:冠高比相关系数转录组测序技术定量 技术基因挖掘北沙柳中图分类号:文献标志码:文章编号:()()(.):().().()()()().()“”.:生物体的表型性状是基因和外界环境共同作用下的外在体现是可以直接观测的性状受到一个或多个基因共同调控 李忠南等报道玉米()的分蘖率由 对主基因与多对微效基因功能决定的 主基因决定性状的稳定性多对微效基因决定该性状的表现 糯玉米种子的活性是由 对主基因和几个基因协同调控的但以主基因遗传为主 家族参与调控植物的生长发育等生理过程拟南芥()中 与 共同调控植物花粉的发育 转录因子也可以通过调控 的表达来调控植物下胚轴的生长发育 在水稻()理想型形成过程中克隆得到 基因其功能获得性突变体表现为分蘖数少、抗倒伏、茎秆粗壮 不仅可以结合 来调控水稻的株型与产量还可以增强水稻的抗病性 植物基因的调控功能是多方位的多层次的综合研究分析对挖掘完善基因功能是十分必要的 植物株型是影响其生物量和利用效率的关键性状之一开展株型定向培育的重要意义已经在农作物及经济树种育种中得到了充分的证明 然而植物株型性状多数是数量遗传性状由多个彼此独立或协同的基因共同决定的呈现出增效或减效的作用采用主效基因的评价方法难以实现育种目标北沙柳()别称沙柳或西北沙柳为杨柳科柳属的速生、多年生灌木是中国西北地区沙产业的重要资源树种 北沙柳产于毛乌素沙地和库布齐沙漠西北、华北等地区均有引种栽培 北沙柳根系发达繁殖和萌蘖力强抗旱耐贫瘠抗风沙耐盐碱是西北地区特色树种也是“三北”地区土地荒漠化防治的首选树种 由于北沙柳是木型材、纤维板、刨花板、造纸、柳编、医药、活性炭等产业的重要原料目前已经形成了以北沙柳为原料的新兴沙产业链北沙柳的株型呈现直立型、开放型、中间型等特征 不同的利用方式对北沙柳株型的要求不同:作为木材产业化的原料理想的株型是通直少(或无)侧枝的直立型而防沙固土的理想株型是多分枝开散生长的开散型 如何能够通过现代生物技术结合北沙柳生物学特性开展快速精准定向化育种以满足沙产业发展的需要是北沙柳资源精细化利用的主要问题本研究利用定量 技术和转录组测序技术相结合的方法分析水培预测群体和野外训练群体不同株型无性系基因表达量的变化特征以及与株型特征值冠高比的相关性 创建基于冠高比相关系数的北沙柳株型后备基因初步筛选方法为北沙柳株型定向育种亲本筛选提供理论基础具有重要的现实意义 材料与方法 实验材料本研究试验材料全部来自于鄂尔多斯市造林总场沙柳国家林木种质资源库的基本群体(年种植)和无性系测定林(年营造)采样部位为茎的尖端(茎尖)和茎尖以下前 个节间的嫩茎(腋芽)年 月种质资源库的基本群体中筛选个北沙柳无性系(即直立型、中间型、开散型各 个)分别采集枝条在内蒙古农业大学智能温室(平均温度 、平均湿度)中进行水培构成预测群体水培 个月采集茎尖和腋芽 年 月按照生长旺盛、病虫害少且株型特征有明显变化的标准从种质资源库的无性系贺嵘 等.基于转录组测序与定量 技术挖掘北沙柳株型相关候选基因测定林中筛选 个左右的无性系标记后组成北沙柳训练群体并采集茎尖和腋芽(液氮低温保存待用)研究方法 株型特征的调查 年 月和 年 月分别对无性系测定林中 个无性系的株高、冠幅(东西向和南北向)、地径、萌生枝条数量、叶片特征等指标进行了调查计算株型特征值冠高比(平均冠幅与高度之比)两年计算获得的冠高比呈现相同的趋势既能体现无性系间的差异又具有稳定性且具有正态分布趋势是体现株型性状较理想的特征值(图)北沙柳株型组的划分依据无性系间冠高比变化特征按照“冠高比平均值 倍标准差”将从无性系测定林中筛选的 个北沙柳无性系划分为 个株型组(表)的提取及 的合成采用 试剂盒(天根生化科技有限公司北京)提取北沙柳腋芽与茎尖的 利用 试剂盒(天根生化科技有限公司北京)将 反转录成 在 冰箱中进行保存 转录组测序及预测值计算将水培测试群体(个北沙柳无性系)腋芽及茎尖 送到基迪奥生物科技有限公司进行转录组测序获得 条序列其中与桤柳()对应的序列有 条未知序列有 条 利用 中 的平方计算所有基因序列的 值与冠高比的预测值(相关系数)相关系数 为极强相关 为强相关 为中相关 为弱相关 为极弱相关(表)目标基因的选择为了验证目标基因在训练群体中的表达特征探讨预测值与北沙柳的株型是否相关本研究的目标基因包括已报道的与北沙柳分枝相关的基因、其他植物中与株型 相 关 的 基 因、和 以及本研究转录组测序结果中预测值较高的、和 共 个基因组成 引物设计将从转录组测序结果中筛选的目标基因登录号在数据库 (:/./)中进行比对获得对应的桤柳编码区序列根据编码区序列用(:/./.)设计引物(表)引物由擎科公司(北京)合成 定量 年 年 .图 无性系群体冠高比变化趋势.浙江农业学报 第 卷 第 期表 北沙柳无性系株型组 组别无性系号冠高比 组别无性系号冠高比 组别无性系号冠高比 第一组 第二组 第三组 第四组 第五组 第六组 表 部分基因序列的相关性系数 极强相关 中相关 极弱相关 基因序列号相关系数基因序列号相关系数基因序列号相关系数.贺嵘 等.基于转录组测序与定量 技术挖掘北沙柳株型相关候选基因表 引物序列 引物名称 引物序列()引物名称 引物序列()将反转录的 稀释 倍作为模板将 作为内参基因目的基因和内参基因均设置 个重复用 仪器进行定量 测定 反应体系为 其中 酶 模板 上下游引物各 程序设置为 个循环 保存基因的相对表达量采用 法计算 首先将性状明显、冠高比最小的无性系设为实验对照组 实验组 对照组 转录组测序的 值与 计算结果均表示基因的表达量但二者只是表达量变化的趋势相同二者之间没有关系 秩和分析及多元回归分析利用 中秩和分析计算目标基因在株型组中的差异显著性、平均值、标准偏差和极值选择达到统计显著水平()的基因将基因进行随机组合统计组合方式为(其中 为显著水平 的基因数量并从 中随机抽取 个基因)利用多元回归分析计算每个组合中基因表达量与冠高比的相关系数 以“基因个数最少相关系数最高”为原则初步筛选最佳与调控株型有关的基因组合 高相关目标基因蛋白互作网络分析利用(:/./)对相关系数高的目标基因分别进行蛋白互作分析通过分析蛋白质 蛋白质相互作用()网络图中蛋白结构信息、蛋白与蛋白之间的相互作用以及蛋白与蛋白间的连接程度来预测蛋白质的功能 结果与分析 初选目标基因预测值()特征 个初选目标基因的预测值在测定群体和训练群体的茎尖中虽然存在差异但基因表达量的变化趋势是相同的 预测值在测定群体中最高为 最低为 训练群体中最高为 最低为 训练群体的预测值明显低于测定群体 个初选目标基因中、的预测值较低、与冠高比呈正相关趋势其余均为负相关(图)在腋芽中测定群体的预测值高于训练群体基因表达量具有相同的变化趋势 预测值在测定群体中变化范围为 训练群体中为 的预测值在两个群体中均相对较高 相对较低 和 的表达量与冠高比呈正相关其余都呈现负相关(图)秩和分析与多元回归分析按照 个株型组对每个初选目标基因表达量的秩和分析 结果表明 在茎尖与腋芽、在 茎 尖、在腋芽均有显著差异()(表)浙江农业学报 第 卷 第 期贺嵘 等.基于转录组测序与定量 技术挖掘北沙柳株型相关候选基因水培预测群体野外训练群体 .图 茎尖中目标基因表达量趋势.浙江农业学报 第 卷 第 期贺嵘 等.基于转录组测序与定量 技术挖掘北沙柳株型相关候选基因水培预测群体野外训练群体 .图 腋芽中目标基因表达量趋势.浙江农业学报 第 卷 第 期表 目标基因秩和分析 基因名称 采样部位 平均值标准偏差 值 最小值最大值茎尖 腋芽 茎尖 腋芽 茎尖 腋芽 茎尖 腋芽 茎尖 腋芽 茎尖 腋芽 茎尖 腋芽 茎尖 腋芽 茎尖 腋芽 茎尖 腋芽 将腋芽中具有差异性的目标基因、和 按照、的组合方式进行组合利用 中多元线性回归分析每个组合的相关性系数两基因组合 共产生 个组合其中相关性系数最高的是 组合()最低的是 组合()且所有基因组合显著性均小于 三基因组合中 产生 个组合相关系数最高的是 组合()相关系数 最 小 的 是 组 合()所有基因组合显著性均小于 四基因组合中 共产生 个组合相关系数最高的是 组合()相关系数最小的组合为 ()所有基因组合显著性均小于 五基因组合中 共产生 个组合 与 基因组合相关系数最高()相关性最小的组合为 ()显著性小于 对冠高比影响最大的是 基因六基因组合中与冠高比相关系数为 预测模型为 在六基因组合中、与冠高比的相关性最小所有组合对比发现 对株型形成贡献最大其次为、基因组合中双基因组合()的相关性较高()蛋白互作网络分析将与冠高比相关性较高的、基因进行蛋白互作分析预测其功能置信度为 (高等)结果如图 所示在 蛋白互作网络中与 直接相关的 基 因 有、和 为铜转运蛋白、为铜伴侣蛋白 铜蛋白 可以提供铜离子 和 可将铜离子传递给、再将铜离子整合到乙烯受体里产生乙烯信号通过调控乙烯的合成来影响植物的生长在 蛋白互作网络中与 直接相关的是 基因、基因可以通过调控光形态建成来影响植物的生长 贺嵘 等.基于转录组测序与定量 技术挖掘北沙柳株型相关候选基因 .图 高相关基因蛋白互作网络.为生长素受体 和 互为同源蛋白 是一种光敏色素互作蛋白可以与赤霉素信号通路中的 蛋白相互作用来调控植物的生长发育 是与植物育性恢复有关的基因其与调控植物生长发育方面的基因互作较少数据支撑较少但仍具有一定的参考价值可能在调控北沙柳生长发育方面有着重要作用 讨论 采样部位的影响植物的上表型由产生新细胞和器官的分生组织所形成 茎尖分生组织()促进垂直生长腋生分生组织()出现在叶腋中可以产生侧生枝或次生枝 决定了植物叶序并影响 的形成 的维持与分化涉及生长素、细胞分裂素和多肽的复杂互作它们协同调控植物的株型 张磊等通过实验发现、沉默时会引起侧枝的水平生长且基因主要在茎和叶腋处表达 袁梦如等研究发现 基因与植物的分枝发育有关且在茎中表达最丰富其次是叶腋茎尖与腋芽都是最活跃的生长点但茎尖分生组织的分化能力较强茎尖细胞会通过不断地分裂生长和分化促进茎的伸长来影响植物的高生长腋芽的分化程度较为稳定主要影响植物的分枝 本实验采样部位选择了与株型有关的茎尖及腋芽 在大群体中通过 实验证明北沙柳茎尖和腋芽均与株型均有一定相关性但腋芽与冠高比的相关系数更接近预测值这可能是因为茎尖细胞较为活跃会不断地进行分裂分化和生长导致营养物质的分配主要促进植物茎的伸长生长而非分枝的生长 、与株型的关系、已被证明与北沙柳的分枝有关但实验结果表明基因表达量与北沙柳的冠高比相关性较小(腋芽中 相关系数为、为 )除了可以调控分蘖角度外还可以结合下游基因调控其他性状 在玉米中 还可以调节花序的发育 可能通过调控一类分子和基因从而调控大量下游基因的表达 在 下游候选基因中、被报道与水稻的穗粒数有关 研究发现在杨树中 基因过表达会影响其他基因的表达量 如、等基因的表达量会高于野生型 的表达量也受内源激素影响在桃树中的表达量随着生长素含量的升高而减少 在预测值与实验结果中、与北沙柳株型相关性较小为极弱相关 这可能是因为、在北沙柳株型中为非主效基因是通过调节其他基因间接来影响株型 、和 与株型的关系、在其他物种中已被证明是与植物的生长发育有关的基因 影响 基因表达的因素有很多如光照、植物激素等红光受体 会抑制 的表达在麻风树()中赤霉素与细胞分裂素共同作用对 浙江农业学报 第 卷 第 期起着负调控的作用促进侧芽的萌发在拟南芥中 被认定为红光和远红光受体光敏色素信号传导过程中的下游负调控因子光照强度或红光、远红光降低时 植物的分枝会受到 抑制秦琳琳等发现白桦()中 基因含有多个脱落酸响应顺式作用元件通过调控脱落酸信号途径来调控植物的生长在脱落酸信号通路中 和 基因起负调节作用具体来说它们可以抑制脱落酸受体和脱落酸应答转录因子的活性从而影响脱落酸信号通路的整个过程 这一机制使得 和 基因能够影响植物的开散程度和直立度 在北沙柳中水培群体预测值与训练群体实验结果的趋势一致有一定的线性关系初步预测这些基因在北沙柳中同样可以调控植物的生长发育 、与株型的关系、是与北沙柳株型相关性高的基因 在训练群体实验结果中 相关性最高()相关性最低()相关系数在 为中等程度的相关 转录因子现已证明是远红光信号通路的重要组成部分在拟南芥中 转录因子在调节开花时间、枝条分生组织的发育等重要生命过程中都具有非常重要的功能 通过蛋白互作网络分析可知 可能通过与光敏色素的相互作用来影响北沙柳的株型也可能在生长素或赤霉素的影响下调节北沙柳的株型铜是植物生长发育所需的微量元素 为铜伴侣蛋白其作用就是供应植物生长所需的金属离子将过量的金属离子排出从而达到解除重金属毒害的作用 通过蛋白互作网络分析可知 可能通过转运铜离子调节铜的浓度来影响北沙柳的生长发育也可能通过调节乙烯信号来影响北沙柳的生长发育 目前在北沙柳上未见报道在本研究中腋芽部分的 基因与北沙柳的株型相关性较高显著高于茎尖这说明 基因作为北沙柳株型的后备基因作用是不可忽视的 结论按照“基因个数最少相关系数最高”的原则选择双基因组合 作为鉴别北沙柳株型的基因该基因组合与冠高比的相关性较高相关系数达 基因组合法是通过基因与北沙柳株型的相关性构建起来的存在误差因此不能完全依靠基因组合的相关系数作为北沙柳株型的预测指标 如果想更准确地预测北沙柳的株型可适当地增加基因数量提高基因组合与冠高比的相关性以不同株型北沙柳作为研究材料从预测值与训练群体实验结果的相关性来看利用转录组测序结果可以初步筛选北沙柳株型的后备基因推测相关性越高功能基因与目标性状的关系越密切 通过同一性状不同表现形式的个体与功能基因表达量的关系可利用少数水培个体的转录组测序结果筛选目标性状的后备基因 这种方法不但去掉了复杂的转基因技术加快了林木育种效率同时还可以提高后备基因的选择精度参考文献():李忠南 王越人 李光发 等.玉米分蘖率的遗传研究.玉米科学 ():.():.()蒋锋 闫艳 黄正刚 等.糯玉米种子活力性状的主基因 多基因混合遗传分析.西北农林科技大学学报(自然科学版)():.()():.().():.:.:.():.:贺嵘 等.基于转录组测序与定量 技术挖掘北沙柳株型相关候选基因.郝蕾.北沙柳种质资源评价、鉴定及核心库构建.呼和浩特:内蒙古农业大学.:.()张磊 叶志玮 赵晨曦 等.沙柳 和 基因克隆及生物信息学分析.西北林学院学报():.():.()袁梦如 杨杨 张磊 等.沙柳 基因克隆、生物信息学及组织特异表达分析.分子植物育种 ():.():.()./.():.():.丁超 张树伟 王新胜 等.植物光信号传导途径中重要调控基因概述 .山西农业科学 ():.():.()林莹莹 李晓云 刘帅 等.过表达转录因子 对拟南芥生长素分布的影响.华南师范大学学报(自然科学版)():.()():.().():.():.陈渝 邓洁 陈君愉 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