基于二代测序技术的玉米内标准基因扩增子的筛选与评估.pdf

146 2023,Vol.44,No.20 食品科学 生物工程基于二代测序技术的玉米内标准基因 扩增子的筛选与评估陈利红1，周俊飞1，梁晋刚2，李甜甜1，王颢潜2，方治伟1，陈 红2,*，彭 海1,*（1.江汉大学生命科学学院，湖北 武汉 430056；2.农业农村部科技发展中心，北京 100176）摘 要：通过对先前研究报道的7 个内标准基因的核苷酸序列分析，设计13 个扩增区域（扩增子）；利用208 个普通玉米品种（系）对这13 个扩增子进行高通量测序与分析，并对其序列保守性、特异性、检出稳定性及其动态检测范围进行评估，以获得合适的基于二代测序技术定量检测玉米DNA含量或拷贝数的内标准基因扩增子。结果显示，7 个内标准基因的13 个扩增子在208 个玉米样品中的检出率为94.7%100%，而在水稻、大豆、棉花、白菜等25 个非玉米样品中均未被检出，基本符合内标准基因种内高度一致与种间高度特异的标准；种内保守性分析显示E3-UBI-1扩增子不含单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）和插入缺失（insertion-deletion，InDel），而剩余12 个扩增子至少含有一个SNP或InDel；稳定性分析结果显示最不稳定的内标准基因扩增子是IVR，最稳定的是ADH1-2；它们的动态检测范围为0.2200 ng。综合上述结果，ADH1-2与E3-UBI-1比较适合作为二代测序技术平台中定量检测玉米DNA含量或转基因玉米成分的内标准基因扩增子。关键词：玉米；二代测序；内标准基因；定量检测；稳定性Screening and Evaluation of Amplicons of Maize Endogenous Reference Genes Based on Next-Generation Sequencing TechnologyCHEN Lihong1,ZHOU Junfei1,LIANG Jingang2,LI Tiantian1,WANG Haoqian2,FANG Zhiwei1,CHEN Hong2,*,PENG Hai1,*(1.College of Life Science,Jianghan University,Wuhan 430056,China;2.Development Center of Science and Technology,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Beijing 100176,China)Abstract:In this study,13 amplification regions(amplicons)were designed by analyzing the nucleotide sequences of seven endogenous reference genes reported in previous studies.Totally 208 common maize varieties(lines)were used for high-throughput sequencing analysis of these 13 amplicons,and their sequence conservation,specificity,detection stability and dynamic detection range were evaluated to select appropriate amplicons of the endogenous reference genes for quantitative detection of maize DNA content or copy number based on next-generation sequencing technology.The results showed that the detection rates of the 13 amplicons of the seven endogenous reference genes were 94.7%100%in the 208 maize samples,while they were not detected in 25 non-maize samples of rice,soybean,cotton and Chinese cabbage,indicating that these amplicons met the standards of high intraspecies consistency and interspecies specificity.Intraspecies conservation analysis showed that E3-UBI-1 did not contain single nucleotide polymorphism(SNP)or insertion deletion(InDel),while the remaining 12 amplicons contained at least one SNP or InDel.Stability analysis showed that the most unstable amplicon in these endogenous reference genes was IVR,and the most stable one was ADH1-2.Their dynamic detection range was 收稿日期：2022-11-01基金项目：农业生物育种重大项目（2022ZD04020）；湖北省自然科学基金面上项目（2021CFB563）；武汉市科技局应用基础前沿专项（2020020601012234）第一作者简介：陈利红（1982）（ORCID:0000-0002-1404-6208），女，副研究员，博士，研究方向为转基因检测。E-mail:*通信作者简介：陈红（1975）（ORCID:0000-0003-4246-2927），男，研究员，博士，研究方向为转基因检测。E-mail:彭海（1974）（ORCID:0000-0001-7827-3322），男，教授，博士，研究方向为分子标记开发。E-mail:生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.20 1470.2200 ng.Based on these results,ADH1-2 and E3-UBI-1 are suitable amplicons of the endogenous reference genes for quantitative detection of maize DNA content or transgenic maize components on the next-generation sequencing platform.Keywords:Zea mays;next-generation sequencing;endogenous reference gene;quantitative detection;stabilityDOI:10.7506/spkx1002-6630-20221101-006中图分类号：TS201.6 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2023）20-0146-09引文格式：陈利红,周俊飞,梁晋刚,等.基于二代测序技术的玉米内标准基因扩增子的筛选与评估J.食品科学,2023,44(20):146-154.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221101-006.http:/ CHEN Lihong,ZHOU Junfei,LIANG Jingang,et al.Screening and evaluation of amplicons of maize endogenous reference genes based on next-generation sequencing technologyJ.Food Science,2023,44(20):146-154.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221101-006.http:/玉米（Zea mays）是世界三大粮食作物之一，也是重要的饲料作物，是世界农业生产中的重中之重。玉米产业的健康发展对保障国家粮食安全和农产品有效供给具有重要意义1。目前玉米已成为我国面积最大、总产最多的作物，但是玉米生长过程中极易受到外界环境及各种病虫害的干扰，严重影响其品质和产量3；而传统的杂交育种技术因耗时长、效率低、需要大量人力物力，已经难以满足玉米产业快速发展过程中对优良品种的迫切需求2。因此人们开始利用基因工程手段将外源基因导入玉米中，以提高玉米对环境与病虫害的耐受性。然而转基因技术在生产中产生巨大经济效益与社会效应的同时，其安全问题也引起了人们的广泛关注3-4。为了充分保障消费者的知情权，各个国家与组织机构要求企业对生产的转基因产品进行标识5。目前国际上对于转基因标识的管理主要分为四大类：一是如美国、加拿大、阿根廷等国家采取自愿标识；二是如欧盟6、巴西等国家实行定量全面强制标识7，即对所有产品只要其转基因成分含量超过一定的阈值就必须标识；三是如日本采取定量部分强制性标识，即对特定类别产品实行超过规定的阈值就必须标识，四是如我国是采取定性按目录强制标识，即凡是列入目录的产品，只要含有转基因成分就必须标识。转基因产品“标识阈值”的实施尤其需要对样品中的转基因成分进行定量检测8。在转基因定量检测过程中，需要对样品基因组DNA含量或拷贝数目、转入外源基因的拷贝数目进行计算，进而获得样品的转基因含量，这个过程需要对植物的内标准基因与转入的外源基因进行有效扩增。因此内标准基因对样品转基因成分的定性定量检测显得尤为重要，其扩增区域、扩增效果将直接影响转基因成分检测的准确性9。对于转基因农产品的检测，内标准基因是指植物中具有种内非特异性、种间特异性与基因组上拷贝数低且拷贝数恒定的一类基因，这类基因在不同品种（品系）之间异质性低9。转基因植物及其相关农产品的成分来源、实验系统的可靠性与稳定性、混合样品中的转基因含量的计算均需通过对内标准基因的检验实现10-12，因此内标准基因及其扩增区域的筛选对于获得可靠的实验结果至关重要。目前，已有多个内标准基因用于转基因植物的实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）检测系统中，如水稻（Oryza sativa）的蔗糖磷酸合成酶基因（sucrose phosphate synthase，SPS）13、根部表达基因（rice root-specific gene，gos9）14、磷脂酶D基因（phospholipase D，PLD）8、磷酸果糖激酶基因（ppi phosphofructokinase，ppi-PPF）9，玉米的转化酶基因（invertase，IVR）15、醇溶蛋白基因（zein）16、玉米淀粉合成酶II（Zea mays starch synthase isoform zSTSII-2，zSSIIb）17、乙醇脱氢酶基因（alcohol dehydrogenase，ADH1）15、高迁移率族蛋白基因（high mobility group protein，HMG）18，大豆（Glycine max）的凝集素基因（lectin）19、热休克蛋白基因（heat shock proteins，HSP）20，小麦（Triticum aestivum）的乙酰辅酶A羧化酶基因（acetyl-CoA carboxylase，ACC1）21，还有其他物种的泛素结合酶基因（ubiquitin-protein ligase，E3-UBI）22等。近年来全球范围内转基因生物（genetically modified organisms，GMO）和未授权的GMO数量日益增多，特征也越来越多样化，给现在转基因检测金标准real-time PCR检测技术带来了巨大的挑战。如传统的real-time PCR技术一次只能实现检测一个靶标，需要多次扩增和检测才能满足多靶标转基因成分检测的需求，而新兴的二代测序技术弥补了该传统技术的 缺陷22-27，显著提高了检测效率。目前尚鲜见基于二代测序技术的玉米内标准基因扩增子筛选、评估方面的研究与报道。本研究基于现有文献中报道的玉米、水稻、大豆等植物中的内标准基因及其定义，从玉米基因组中选择7 个候选内标准基因，共设计13 个扩增区域（扩增子），利用二代测序技术对这些内标准基因的扩增子进行种内一致性、种间特异性等系统性评估，进而为后续利用二代测序技术对转基因玉米的定量检测提供合适的内标准基因扩增子。148 2023,Vol.44,No.20 食品科学 生物工程1 材料与方法1.1 材料与试剂表 1 常规玉米品种（品系）信息Table 1 Information about common maize varieties(lines)tested in this study样品编号样品名字样品编号样品名字样品编号样品名字样品编号样品名字M000036四单154号M001506吉单257M018786奥育7020M019021玉龙9号M000045承单15号M001981云试5号M018788桂花糯522M019025锦华1245M000215铁D9125M002186中科4号M018789雅玉98M019030金通152M000437农大108M002231中农二号M018790雅玉26M019032锦华318M000453双741M002386铁7922M018791万盛68M019033锦华103M000461掖单22号M002531掖52106M018792玉迪216M019034金1510M000488掖单4号M002838吉新203M018793垦单27M019035农华803M000490鲁单50M002983郁青1号M018794垦单28M019036锦华659M000492鲁单981M003139高油5546M018795龙垦7号M019037增玉1572M000494登海1号M003253吉单29M018796垦单26M019132金冠218M000512西单2M003359协单969M018797垦单24M019133中单121M000536沈137M003363丹科2109M018804铁源15号M019134豫禾357M000551中单2号M016024秦龙998M018805龙育11号M019135美豫39M000641郑单958M016228五谷309M018806龙育4号M019137郑单2098M000647掖478M017226金来6227M018815户单109M019141垦粘1号M011882北玉16号M017260京科甜183M018849先达905M019142东单119M011884京科甜158M017262邢36M018851西星红糯4号M019143东单308M011886京科甜189M018149农大178M018852洰丰558M019145富友1133M011888京科389M018441先玉335M018854云天3号M019146沃玉3号M011890京单68M018548丹1133M018855金都2138M019147丰玉601M011891京华8号M018550丹玉603号M018859新引KWS7461M019148冀农802M011902源申213M018623绥玉28M018860渝糯851M019149冀农698M011919德单9号M018624绥玉21M018863锦华336M019150冀农608M011927郑58M018641辽单506M018865农华816M019151良硕88M011930黔259M018643敦玉328M018919华皖611M019153真金389M011949宜单858M018653辽单145M018924省原80M019250宁玉735M011970天玉168M018667金赛34M018938墨255M019291稷秾108M011974俊达001M018676京BD123096M018946联创799M019297三北301M011976丹福6号M018677京BD110899M018949迪卡159M019298桂单901M011988石玉10号M018678京BD122314M018950中农大青贮67M019300秀青823M011990天泰33M018679京BD121040M018975富诚796M019304宁晨187M003899四单19号M018680京BD121602M018976海玉92M019306农大375M003944纪元一号M018681京BD110878M018979禾玉158M019314宽诚818M005241莱1029M018682京BD124360M018987德单1229M019315宽诚329M005298昌7-2M018683京BD123049M018988德单1108M019317互邦101M005454掖单13M018684京BD110749M018989纪元158M019323辽单588M006054黄早四M018685京H113417M018990纪元118M019324齐2839M006157正红311号M018687京BD121048M018991纪元168M019325齐诱201M007308隆平2008M018689京H101662M018992源育13M019326高诱2号M007528瑞丰1号M018690京BD110746M018993源育18M019327明玉178M007567众望玉18M018691京BD121039M018994源玉8号M019328明玉268M007608吉单602M018692京BD122945M018996西蒙青贮707M019329明玉168M009781金系865M018693京BD121344M019001鲁单9088M019330晨强808M009820长3M018695京BD110894M019002稷秾103M019331明玉33M011050鑫达5号M018716农甜88M019003冀植选3M011074铁研33M011129苏科糯2号M018747德单1104M019005屯玉188M011082大玉M737M011131苏科糯3号M018748德单1029M019006永珍七号M011252金秋963M011134巴单28M018750京甜糯2M019007先源998M018647昌8848M011289伟科7M018752宏硕899M019009华耘301M018649昌9231M011291伟科606M018756富尔1号M019010西农211M018650昌20B1M000866佳13M018757鑫鑫1号M019013济玉901M000035未命名1M001361吉单180M018781正成018M019014宇玉30号M000265未命名2供试的208 个常规玉米品种或品系（表1）由农业农村部科技发展中心提供。其他非玉米物种水稻（5 个样品）、棉花（Gossypium spp.，3 个样品）、大豆（4 个样品）、花生（Arachis hypogaea，1 个样品）、西瓜（Citrullus lanatus，2 个样品）、黄瓜（Cucumis sativus L.，2 个样品）、甜瓜（Cucumis melo，2 个样品）、番茄（Lycopersicon esculentum，2 个样品）、辣椒（Capsicum annuum L.，2 个样品）、白菜（Brassica pekinensis，2 个样品）的DNA为本实验室保存。多重扩增建库试剂盒（GP000505）石家庄博瑞迪生物技术有限公司；植物DNA提取试剂盒（DP320）、DNA/Hind III Marker、DNA Marker I、D2000 DNA Marker 北京Tiangen生化科技有限公司；Qubit dsDNA检测试剂盒（Q33230）美国Thermo Fisher公司；所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。1.2 仪器与设备Nanodrop 2000微量紫外分光光度计、Qubit 4.0核酸定量仪、Qubit 2.0荧光计 美国Thermo Fisher公司。1.3 方法1.3.1 DNA提取与定量待检样品叶片用液氮充分研磨后，用天根植物DNA提取试剂盒（DP320）按照其说明书进行基因组DNA提取。用Qubit 4.0核酸定量仪检测DNA浓度，用1%琼脂糖凝胶检测DNA质量。1.3.2 内标准基因的选择与引物设计根据文献中或者国家标准中报道的常用内标准基因、内标准基因的定义及玉米基因组序列，本研究共选择7 个候选基因用于后续研究。引物设计与合成由博瑞迪生物技术有限公司完成。引物信息见表2。表 2 研究所用的引物及其相关信息Table 2 Information about primers used in this study基因扩增子引物名称引物序列扩增长度拷贝数目zeinzein-1zein-F1GATGTCACCATTGATGATGCCG1371zein-R1TGAACATGAATGGTAACTGCTGTTGzein-2zein-F2AGCCAAGATGCTTGCATTGTTC2521zein-R2GACATCATGTTAGGCGTCATCATCTzSSIIbzSSIIb-1zSSIIb-F1AGGACCTCAGCTGGGACC1371zSSIIb-R1AAGAGCCTTCTAAATAACGTCCAGGzSSIIb-2zSSIIb-F2AGACTTCGGAAGGCGGGT2801zSSIIb-R2ATGATGTCCACGCCCTTCTGADH1ADH1-1ADH1-F1CGTCGTTTCCCATCTCTTCCT2421ADH1-R1CAGATCAAGAGACAGAGGAGAAACAADH1-2ADH1-F2TAGATATGATACAACAACTCGCGGT2171ADH1-R2CCAACCATACCCATAAATTCAGACG生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.20 149基因扩增子引物名称引物序列扩增长度拷贝数目IVR1IVRIVR-FCTAGCTTTCGCGTATTGATGTCG2631IVR-RCCCGTGTAGAGCATGACGATHMGHMG-1HMG-F1ATGAAGGGGGCCAAATCCAA1451HMG-R1CGGCGGATGTCATAATAACAGAAATHMG-2HMG-F2CCTGCTGGTCATTTATTCAAATACGT1251HMG-R2GACTTGTCAGACTCCTCTTCATCTTE3-UBIE3-UBI-1E3-UBI-F1AGCACAATATTTGATGAATAATCCCGA1291E3-UBI-R1TAGTAGGATTGGTATTGGAGGGTCTE3-UBI-2E3-UBI-F2CAATAGCTTTTCCTTTTCCTTTGGC2801E3-UBI-R2CTTATCGACCCATTTGCTAGTCTTGHSP70HSP70-1HSP70-F1AATTTAGGCACAGGCTTCATACTAC2671HSP70-R1 ATTTCTTCAGACAACAATATTTAAAACAAGTHSP70-2HSP70-F2ATTACACTCTGAAATCGTGTTCTGC1341HSP70-R2AAGCACCAAATTACACATTTCTCGT1.3.3 扩增子文库构建与测序按照石家庄博瑞迪生物技术有限公司的建库试剂盒GenoPlexs Multiplex-PCR Library Prep Kit for MGI说明书（GP000505）进行建库，具体过程如下：取50200 ng基因组DNA（稳定性和检出丰度比较分析所用的样品DNA起始量均是200 ng/样品，其他的样品若DNA量足够的话，也尽量使每个样品的起始DNA量为200 ng），用设计的多重引物对样品中目标序列进行第1轮PCR扩增。扩增体系为30 L，多重扩增引物（每条引物 0.2 mol/L）：4 L，基因组DNA：50200 ng，GenoPlexs 3T Master Mix：10 L，用ddH2O补足到30 L，然后按照表3进行PCR扩增。其扩增产物用磁珠法进行目标片段筛选后再进行第2轮PCR扩增，第2轮扩增时为每个样品加上不同的测序条形码（Barcode）。扩增体系为30 L，GenoPlexs 3xT Enzyme mix：10 L，P5 Barcode：2 L，P7 Barcode：2 L，ddH2O：16 L，按照表4进行扩增。最后纯化获得扩增子建库文库，该建库过程经过适当调整以匹配Illumina平台，文库经质检合格后进行测序。文库质检首先用2%琼脂糖凝胶电泳检测，然后用Qubit对文库浓度进行检测，符合文库片段大小及文库质量浓度在10 ng/L以上由南京诺禾致源生物信息科技有限公司进行PE150测序（NovaSeq 6000）。表 3 文库构建的第1轮PCR扩增条件Table 3 Conditions of first round of PCR amplification for library construction循环次数温度/保持时间无95 3 min15 个循环9520 s604 min724 min无7210 min表 4 文库构建的第2轮PCR扩增条件Table 4 Conditions of second round of PCR amplification for library construction循环次数温度/保持时间无95 3 min8 个循环9515 s6030 s7230 s无7210 min1.3.4 普通PCR验证对zSSIIb-1扩增子检出reads数目高低不一的8 个样品（M000265、M019298、M019325、M019314、M000036、M016228、M019142和M019143）进行普通PCR验证，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。PCR扩增体系20 L，zSSIIb-1上下游引物（10 mol/L）各0.5 L、基因组DNA 20 ng，2Prime Star GC Buffer 10 L、2.5 mmol/L的dNTP mix 2 L、TaKaRa Prime Star Taq酶0.2 L用ddH2O补足到20 L，然后按照表5进行PCR扩增。大豆lectin基因是以大豆4 个样品文库构建的第1轮PCR产物为模板（0.5 L），利用文献19报道的大豆lectin内标准基因的引物（F：TGGGACAAAGAAACCGGTAG，R：GTCAAACTCAACAGCGACGA，扩增长度201 bp）及PCR扩增条件进行扩增与电泳检测。其中，zSSIIb-1扩增子与lectin内标准基因的PCR验证均以H2O作为空白对照。表 5 zSSIIb-1基因普通定性PCR条件Table 5 Conditions for qualitative PCR amplification of the zSSIIb-1 gene循环次数温度/保持时间无95 5 min35 个循环9515 s6020 s7220 s无7210 min1.3.5 测序数据分析下机的测序数据经过以下几个步骤分析进而获得归一化的内标准基因扩增子测序序列数目，1）根据Barcode序列和各扩增子引物序列从下机数据中拆分出各样品数据，Illumina接头序列使用Cutadapt v1.8.1去除；2）使用FLASH（V1.2.7，http:/ccb.jhu.edu/software/FLASH/）对每个样品的reads进行拼接，得到拼接序列，其中拼接成功与未拼接成功的序列统称为原始Tags数据（Raw Tags）；3）将这些原始的Raw Tags，利用FASTX-toolkit v0.014（http:/hannonlab.cshi.edu/fastx_toolkit）去除低质量的序列（序列质量Q20值20），得到高质量的Tags数据（Clean Tags）；4）将Clean Tags比对到玉米参考基因组序列上，并确定每个扩增子的原始reads数目；续表2150 2023,Vol.44,No.20 食品科学 生物工程5）最后把所有样品按照测序1 000 000 条reads，每个内标准基因200 bp长度进行归一化处理，进而获得每个样品中每个扩增子的测序reads数目，即为每个扩增子的检出丰度。单个样品中每个扩增子若有一条测序read检出，则认为该扩增子在此样品中被检出，每个扩增子的检出率为该扩增子检出样品的数目占所有样品中的百分比。1.3.6 内标准基因扩增子的种内一致性、种间特异性、保守性、稳定性与动态检测范围分析分别用208 个常规玉米样品与10 个非玉米物种进行内标准基因扩增子的种内一致性与种间特异性评估。种内保守性是通过分析这些内标准基因扩增子在所测试的208 个常规玉米样品中的拷贝数目及单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）数目进行评估。然后用建库DNA起始量相等的25 个常规玉米测试所选内标准基因扩增子的稳定性，利用geNorm28和NormFinder29分析软件并参考相关文献30-31对这些扩增子进行评估，其中，最优内标准基因扩增子数量采用geNorm软件对配对扩增子变异系数进行分析完成。内标准基因扩增子的动态检测范围分析按照以下步骤进行，将5 个常规玉米品种（未知1、四单154、承单15、铁D9125和未知2）的DNA（每个样品起始DNA量为200 ng），依次稀释1、50、100、500 倍和1 000 倍进行文库构建与测序分析以获得每个内标准基因各扩增子的检出丰度，进而确定所筛选的内标准基因各扩增子的动态检测范围。2 结果与分析2.1 所选内标准基因的引物设计与拷贝数分析根据文献中或者国家标准中报道内标准基因及其定义，共筛选7 个内标准基因，分别为zSSIIb、zein、ADH1、IVR、HMG、E3-UBI和HSP70。为了确定同一个内标准基因不同的扩增区域是否对其检出有影响，每个内标准基因拟计划设计2 对引物。设计结果显示除了IVR只设计出 1对引物外（该基因设计的另外一对引物和引物组的其他引物容易形成二聚体），其他基因均设计出2 对引物，因此共有13 个扩增子区域。利用在线BLAST程序对这7 个内标准基因的13 个扩增子进行拷贝数分析，发现这些内标准基因的13 个扩增子在玉米基因组上均只有1 个拷贝（表2）。2.2 种内一致性、检出丰度与种间特异性分析通过对待检的208 个玉米样品进行建库、测序与分析，发现IVR（京BD123096、京BD122945）与HSP70-1扩增子（雅玉98和增玉1572）均只有两个样品没有被检出（图1），检出率为99.0%；zein-2扩增子在11 个样品中（伟科7、京BD123096、京BD122314、京BD121602、京BD124360、京H113417、京H101662、京BD122945、锦华336、冀植选3和高诱2号）没有被检出，检出率为94.7%；而剩余的10 个扩增子在所有样品中均有不同丰度的检出，检出率为100%；说明这些扩增子在玉米种内的一致性均较好。9296100A999897959493?/%?zein-2zSSIIb-1zSSIIb-2ADH1-1ADH1-2IVRHMG-1HMG-2E3-UBI-1E3-UBI-2HSP70-2HSP70-1zein-11 5004 0003 500B3 0002 5002 0001 0005000?zein-2zSSIIb-1zSSIIb-2ADH1-1ADH1-2IVRHMG-1HMG-2E3-UBI-1E3-UBI-2HSP70-2HSP70-1zein-1图 1 13 个扩增子在208 个样品中的检出率（A）与检出丰度（B）Fig.1 Detection rates(A)and abundance(B)of 13 amplicons in 208 samples此外用建库起始DNA量相等（200 ng）的25 个玉米品种对所选7 个内标准基因的13 个扩增子进行检出丰度分析。结果显示每个内标准基因的各扩增子在所有样品中均被检出（图2），同一个内标准基因，除了ADH1内标准基因的两个扩增子ADH1-1和ADH1-2检出丰度相对比较接近外，其他5 个内标准基因的2个扩增子检出丰度均有一定差异，说明同一个内标准基因的不同扩增子检出丰度有差异。在13 个扩增子中，zSSIIb-1检出丰度最高，其次为E3-UBI-1、HSP70-2和zein-1，它们检出丰度均变异较大，而zein-2、ADH1-1、ADH1-2、HMG-2、E3-UBI-2与HSP70-1的变异较小（标准偏差均在100以内）。从检出率及检出丰度高低看，zSSIIb-1作为内标准基因相对较好，但其在各样品的检出丰度变异较大。为了验证丰度变异较大的zSSIIb-1扩增子在普通琼脂糖电泳图上的目标条带亮度是否差异较大，用zSSIIb-1引物对检出丰度高低不一的8 个样品进行普通PCR验证，发现zSSIIb-1检出丰度在2 0003 000 条reads的样品，其PCR产物在琼脂糖凝胶上的条带亮度差异并不大（图3），因此直接通过琼脂糖电泳图无法精准确定各扩增子的检出丰度。生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.20 1511 5003 5003 0002 5002 0001 0005000?zein-2zSSIIb-1zSSIIb-2ADH1-1ADH1-2IVRHMG-1HMG-2E3-UBI-1E3-UBI-2HSP70-2HSP70-1zein-1图 2 13 个扩增子在建库DNA起始量相等的25 个样品中的 检出丰度箱线图及散点图Fig.2 Boxplot and scatter plot of the detected abundance of the 13 amplicons in 25 samples with equal initial amount of DNA for library construction03 500A2 5002 0003 0001 5001 000500?M019298M000265M019325M019314M000036M016228M019142M019143MarkerB2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bpH2O123456782 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bpCMarker H2OABCD泳道M.D2000 DNA Marker；18.样品M000265、M019298、M019325、M019314、M000036、M016228、M019142和M019143；AD.大豆样品1、2、3和4。图 3 玉米zSSIIb-1扩增子在8 个样品中的检出丰度（A）及定性PCR验证（B）和大豆lectin基因的PCR验证（C）Fig.3 Detected abundance of zSSIIb-1 amplicon(A)and qualitative PCR validation(B)in eight samples,and PC