基于网络药理学和体外研究探讨木犀草素抑制食管鳞状细胞癌的分子机制.pdf

中国药物警戒 第 20 卷第 9 期 2023 年 9 月 September,2023,Vol.20,No.9992DOI:10.19803/j.1672-8629.20220744 中图分类号：R994.11;R285文献标志码：A 文章编号：1672-8629（2023）09-0992-10基金项目：河南省自然科学基金资助项目（212300410393）；河南省医学科技攻关计划联合共建项目（LHGJ20210696）。作者简介：杨珍珍，女，硕士，主管药师，肿瘤药理。*通信作者：范天黎，女，博士，教授，肿瘤药理。E-mail:基于网络药理学和体外研究探讨木犀草素抑制食管鳞状细胞癌的分子机制杨珍珍1,3，常成2，高娜1,3，张晓林1，宋银森1，刘颖1，范天黎3*（1河南中医药大学第五临床医学院，郑州人民医院，河南 郑州 450003；2郑州城建职业学院，河南 郑州 451200；3郑州大学基础医学院，河南 郑州 450001）摘要：目的 采用网络药理学和体外研究探讨木犀草素（luteolin）抑制食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）的分子机制。方法 通过构建活性成分和疾病维恩图（Venn图）确定木犀草素和ESCC 共同靶点，String 数据库将共同靶点进行可视化，建立蛋白互作网络（PPI）。使用Cytoscape 3.9.1内置插件对 Hub 基因筛选，并运用 R 语言进行基因本体（GO）生物过程富集分析及 KEGG 通路分析。体外试验观察木犀草素对 ESCC 细胞系（TE-13 和 KYSE-510）的抑制作用，采用分子对接验证木犀草素和部分 Hub 基因的结合活性。结果 共收集到木犀草素与ESCC 共同靶点69个，并筛选出以 AKT1、ESR1和SRC为代表的Hub 靶基因。靶点主要涉及细胞氧化应激、蛋白质修饰等生物学功能和活性氧、炎症、细胞外基质等信号通路。其中选择 PI3K-Akt 信号通路验证网络药理分析结果的合理性。体外研究表明，木犀草素可阻止TE-13 和 KYSE-510 细胞增殖、迁移和侵袭的能力，并抑制了FAK-SRC-PI3K-Akt 通路中磷酸化蛋白的表达。此外，分子对接结果表明，木犀草素对 FAK、SRC、Akt 蛋白表现出良好的亲和力。结论木犀草素对 ESCC 的抑制性表现出多靶点多通路的特征，其阻碍了ESCC 细胞增殖、迁移和侵袭，这可能与抑制 FAK-SRC-PI3K-Akt 通路有关。关键词：木犀草素；食管鳞状细胞癌；网络药理学；分子对接；信号通路；作用机制Molecular mechanism of luteolin for inhibiting esophageal squamous cell carcinoma based on network pharmacology and in vitro studiesYANG Zhenzhen1,3,CHANG Cheng2,GAO Na1,3,ZHANG Xiaolin1,SONG Yinsen1,LIU Ying1,FAN Tianli3*(1The Fifth Clinical Medical College of Henan University of Chinese Medicine,Zhengzhou Peoples Hospital,Zhengzhou Henan 450003,China;2Zhengzhou Urban Construction Vocational College,Zhengzhou Henan 451200,China;3School of Basic Medical Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou Henan 450001,China)Abstract:Objective To investigate the molecular mechanism by which luteolin inhibits esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)based on network pharmacology and in vitro studies.Methods The common targets of luteolin and ESCC were identified by constructing Venn diagrams of active ingredients and diseases.The common targets were visualized via the String database before a protein-protein interaction network(PPI)was established.The Hub genes were screened using the plug-in of Cytoscape 3.9.1.Gene Ontology(GO)enrichment analysis and KEGG pathway analysis were performed using the R programming language.The inhibitory effect of luteolin on ESCC cell lines(TE-13 and KYSE-510)was observed in vitro,and the binding activity of luteolin and Hub genes was verified by molecular docking.Results A total of 69 common targets of luteolin and ESCC were collected,and Hub target genes represented by AKT1,ESR1 and SRC were screened.The targets involved not only such biological functions as cellular oxidative stress and protein modification,but such signaling pathways as reactive oxygen species,inflammation,and extracellular matrix.The PI3K-Akt signaling was selected to verify the rationality of the results of the network pharmacology analysis.In vitro studies showed that luteolin inhibited the ability of TE-13 and KYSE-510 cells to proliferate,migrate,and invade,and reduced the expressions of phosphorylated proteins in the FAK-SRC-PI3K-Akt pathway.In addition,the results of molecular docking showed that luteolin showed good affinity for FAK,SRC and Akt.Conclusion The inhibition of ESCC by luteolin is characterized by multiple targets and multiple pathways,which may be related to the inhibition of the FAK-SRC-PI3K-Akt pathway.Keywords:luteolin;esophageal squamous cell carcinoma;network pharmacology;molecular docking;signaling pathway;mechanism of action食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是最常见的恶性肿瘤之一，其 5 年生存率较低，据统计发病率在全球排名第六，中国排名第三 1-2。尽管其研究已取得多项突破，但手术仍中国药物警戒 第 20 卷第 9 期 2023 年 9 月 September,2023,Vol.20,No.99931.1.5 构建成分-靶点-疾病-信号通路网络 对上述所得出的共同靶点和 KEGG 富集分析结果导入Cytoscape 3.9.1，对数据进行可视化处理，并绘制“木犀草素-靶点-ESCC-信号通路”图。1.1.6 分子对接 从 NCBI PubChem 数据库中确定活性成分的化合物名称、相对分子质量和 3D 结构，然后在 RCSB PDB 数据库中下载活性成分所对应的3D 结构。然后利用 AutoDock 软件，准备分子对接所需的配体和蛋白质，对于目标蛋白，其晶体结构去除水分子、加氢、修饰氨基酸、优化能量和调整力场参数，之后满足配体结构的低能量构象。最后将靶点结构与木犀草素关键活性成分结构进行分子对接，其 Affinity（kcalmol-1）值即代表两者结合的结合能力，结合能力越低，配体与受体结合越稳定。最后使用 Discovery Studio 软件分析和观察对接结果。1.2 体外试验验证1.2.1 药物与主要试剂 木犀草素（中国食品药品检定研究院，VIP(AL)0625，PLC）；RPMI 1640 培养基（以色列 Biological Industries 公司，01-101-1A）；紫杉醇（海南卓泰制药有限公司，5 mL:30 mg）；兔抗人 FAK 抗体（批号：ab131435）、鼠抗人 p-FAK（Tyr397）抗体（批号：ab24781）、兔抗人 Akt 抗体（批号：ab8805）、兔抗人 p-Akt（Ser473）抗体（批号：ab81283）、兔抗人 SRC 抗体（批号：ab47405）、兔 抗人 p-SRC（Tyr416）抗体（批号：ab194739）均购于英国 Abcam 公司，兔抗人-actin 抗体（批号：81115-1-RR）、羊抗兔 IgG-HRP（批号：PR30011）和羊抗鼠 IgG-HRP 抗体（批号：PR30012）抗体均购自武汉三鹰生物技术有限公司；结晶紫粉末（北京索莱宝科技有限公司，批号：C8470）；Cocktail（美国MCE公司，批号：HY-K0010）；二甲基亚砜（DMSO）（北京索莱宝科技有限公司，批号：D8371，99.5%）；CCK-8 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：C0037）；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：P1200）；甲醇（天津市大茂化学试剂厂，批号：3845）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物有限公司，批号：P0012S）；Transwell 小室（美国 Corning 公司）；6 孔板和 96孔板（美国 Corning 公司）；全波长型酶标仪（美国Thermo Fisher 公司，型号：MultiskanFC）；BIO-RAD电泳仪系统（美国 BIO-RAD 公司，型号：1658033）；超灵敏全自动成像分析系统（美国 Proteinsimple 公司，型号：FluorChem R）。是该恶性肿瘤的最佳治疗选择。鉴于手术切除后癌症复发的机会仍然很高3，因此寻找并开发出新的有效化疗药物对于治疗食管癌是必不可少的。中药活性成分单体治疗 ESCC 已被报道有效并引起世界各国研究人员关注。目前对于木犀草素抗 ESCC 的研究较少。网络药理学方法是研究和阐明药物作用机制的有效方法，以系统生物学为基础，构建生物网络，揭示药物的药理作用，从宏观角度探讨药物与疾病的关系。通过分析与成分和疾病相关靶点，有助于分析中药单体治疗疾病的作用机制。本文应用现代化生物信息学及网络药理学手段分析木犀草素抗ESCC 的作用靶点，进而深入探讨其防治 ESCC 的分子机制和调控网络，并在 ESCC 细胞系进行验证，为防治 ESCC 提供依据。1 材料与方法1.1 网络药理学研究1.1.1 化合物成分收集与筛选 在 NCBI PubChem 数据库中检索“luteolin”的化学分子信息获取其 2D 结构，导入 Swiss Target Prediction 数据库预测木犀草素活性成分靶点，设定物种为人类，以 Probability 0.1为筛选条件。1.1.2 ESCC 和木犀草素共同靶点的筛选 在数据库GeneCards 和 OMIM 数据库检索“esophageal squamous cell carcinoma”，选择物种为“人类”得到 ESCC 的靶点。将木犀草素与 ESCC 的两者靶点输入Venny2.1中筛选出共同靶点。1.1.3 PPI 互作网络构建并确定 Hub 靶点 通过 String数据库选择 Multiple proteins 选项导入交集靶点后选择物种为“人类”，最低相互作用阈值为 0.4，并隐藏网络中断开连接的节点。导出 PNG.格式图片和TSV.格式文件，然后将 TSV.导入 Cytoscape 3.9.1 软件。利用 CytoHubba 内置插件分析 69 个共同靶点的 degree 值的个数，按照从大到小的顺序排序，选取 degree 值前 10 位为核心靶点蛋白。MCODE 内置插件对共同靶点的内部子网络进行 Cluster 聚类，设置“node score cutoff=0.2,kcore=2,maximum depth=100,degree cutoff=2”作过滤标准，根据得分进行排序确定子网络。1.1.4 共同靶点通路分析 利用 R 语言的 cluster profiler软件包，对木犀草素抗 ESCC 的 69 个共同靶点进行基因本体（GO）功能富集分析和 KEGG 富集通路分析，根据 Count 值从大到小排列。中国药物警戒 第 20 卷第 9 期 2023 年 9 月 September,2023,Vol.20,No.99941.2.2 细胞培养 人 ESCC 细胞株（TE-13 和 KYSE-510）购自上海中心细胞库，复苏后培养于含 10%胎牛血清、100 UmL-1青霉素及 100 gmL-1链霉素的 RPMI 1640 培养基，放在 37、5%CO2培养箱中培养。待细胞贴壁 80%左右，用胰酶消化传代，选取对数生长期细胞进行后续实验。1.2.3 CCK-8 检测 ESCC 细胞增殖活性 采用 CCK-8试剂盒检测木犀草素对 TE13 和 KYSE-510 细胞增殖活性的影响。细胞铺板：取对数生长期 ESCC 细胞，按照每孔 3.0103个的细胞密度接种到 96 孔板中，置于培养箱继续培养。药物浓度梯度制备：分别将不同药物紫杉醇和木犀草素的母液用完全培养基进行梯度稀释，共设置 9 个浓度梯度，分别为 0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、120 molL-1。分别加入含有药物的培养基，每个浓度设置 3 个复孔，同时设置不含药物培养基孔为对照组（DMSO），不含细胞孔为空白组，置于培养箱继续培养 24 和 48 h。每孔加入 10 L的 CCK-8 溶液，置于培养箱中避光孵育 24 h，用酶标仪测定 450 nm 波长处的 OD 值。计算细胞存活率=（OD实验组-OD空白组/OD对照组-OD空白组）100%，SPSS 21.0 软件计算药物的 IC50值（50%细胞生长抑制所需的药物浓度）。1.2.4 划痕实验检测 ESCC 细胞迁移能力 取对数生长期 TE13 和 KYSE-510 细胞，进行胰蛋白酶处理，离心去上清，制成单细胞悬液，以适宜浓度接种于 6 孔板中。培养 24 h 后观察细胞密度，当细胞融合达到80%90%时，用 20 L 无菌枪头在孔板底部中央垂直划线，PBS 洗去挂落细胞，每孔分别加入 2 mL含有 20、40 mol L-1木犀草素培养基，置于培养箱继续培养。分别于 0、24 h 观察划痕并拍照，Image J软件计算细胞划痕面积，计算不同处理组细胞的迁移率并分析结果。划痕愈合率（%）=（0 h 划痕距离24 h 划痕距离）/0 h 划痕距离100%。1.2.5 Transwell 检测 ESCC 细胞侵袭能力 用无血清培养基将 Matrigel 胶稀释为终浓度 300 gmL-1，取100 L 稀释后的 Matrigel 胶涂布至Transwell 小室上室，培养箱中孵育1 h。重悬细胞调整密度为每毫升5105个，取 200 L 细胞悬液加入上室，取 600 L含血清的培养液加入下室，继续培养 24 h，PBS 漂洗细胞。最后4%多聚甲醛溶液固定 30 min，0.1%结晶紫染色 30 min，随机选 3 个视野，Image J 软件计算细胞穿膜数，分析不同处理组细胞的侵袭能力。1.2.6 Western Blot 检测 ESCC 细胞蛋白表达 用 RIPA缓冲液在冰上裂解不同组的 TE13 和 KYSE-510 细胞。然后，蛋白质裂解物在 10%SDS-PAGE 凝胶电泳，转移到 PVDF 膜上，并用 5%脱脂牛奶封闭 2 h。之后加入一抗：兔抗人 FAK 抗体、兔抗人 p-FAK 抗体、兔抗人 Akt 抗、兔抗人 p-Akt 抗体、兔抗人 SRC抗体、兔抗人 p-SRC 抗体和兔抗人-actin 抗体在4下加入过夜，TBST 洗膜 3 次，每次10 min；随后，加入 HRP 标记的二抗羊或兔抗 IgG-HRP 抗体孵育1 h。TBST 洗膜 3 次，每次 10 min；加入 ECL 发光液，分别采用超灵敏全自动成像分析系统和 Image J软件进行显影和分析。1.3 统计学分析采用 IBM SPSS 21.0 进行分析统计，结果资料以x-s表示，2 组内采用独立样本 t 检验分析，多组间采用单因素方差分析，进一步两两比较采用 LSD-t检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 木犀草素与 ESCC 共同靶点的预测及构建PPI 网络在 SwissTargetPrediction 数据库获得103 个木犀草素分子靶点，在 GenecCards 和 OMIM 数据库中获取 3 226 个 ESCC 疾病靶点。通过 Venny2.1 共获取木犀草素与 ESCC 共同靶点 69 个（图1A）。随后使用相互作用数据库平台 STRING 搜索药物-疾病交叉靶基因，并构建 PPI 网络（图1B）。2.2 确定 Hub 靶点与子网络聚类使用 Cytoscape 3.9.1 软件网络分析插件统计网络图中节点，并根据 degree 值分析其连通性；节点度越大，节点在网络中的生物学功能越多。其Hub 靶点前 10 位依次为：AKT1、ESR1、SRC、EGFR、PTGS2、MMP9、AR、MMP2、CCNB1、KDR（图 2A）。随后，通过 MCODE 插件分析进行靶点网络聚类，得到 6 个子网络。按照得分高低，列举前 3 名聚类网络（图 2B、表 1）。2.3 木犀草素-ESCC 靶点 GO 功能富集分析和 KEGG 通路分析木犀草素-ESCC 的 69 个靶点通过 GO 功能富集分析结果共得到 GO 分析条目 1 242 条，其 中1 128 条生物过程（BP）条目、21条细胞组成（CC）条目、93 条分子功能条目，分别占比 90.82%、1.69%、7.49%，各类占比前 10 的条目如图 3A 所示，BP 条目涉及到的有氧化应激反应、细胞对氧化应激的中国药物警戒 第 20 卷第 9 期 2023 年 9 月 September,2023,Vol.20,No.9995反应、肽基丝氨酸修饰等过程，提示木犀草素抑制ESCC 的靶点主要与细胞氧化应激、蛋白质修饰等有关。随后，经 R 语言运行后进行 KEGG 富集分析，得到 64 条富集通路，结果显示基因主要富集在活性氧、PI3K-Akt 信号通路和蛋白聚糖等信号通路（图3B），表明木犀草素抑制 ESCC 可能与抑制活性氧、抗炎、抑制细胞外基质等信号通路有密切关系。根据 KEGG 富集分析结果，木犀草素-ESCC 共同靶点与 PI3K-Akt 信号通路相关度较高（图 4）。2.4 成分-靶点-疾病-信号通路网络构建与分析将木犀草素与 ESCC 的 69 个分子-疾病共同靶点通过 Cytoscape v3.9.1 软件绘制“成分-靶点-疾病-信号通路”相互作用的网络图（图 5）。2.5 木犀草素对 ESCC 细胞形态和细胞增殖的影响为了观察木犀草素在体外对ESCC的抑制作用，采用木犀草素（0、10、20 mol L-1）处理食管鳞癌TE-13和 KYSE-510 细胞 48 h，结果显示对照组（DMSO）细胞形态正常，细胞间连接紧密，边缘清晰，处理组细胞则出现皱缩，生长缓慢，胞质浑浊，细胞边缘模糊（图 6A）；细胞增殖结果显示，紫杉醇处理食管鳞癌TE-13 和 KYSE-510 细胞 24、48 h 后，细胞增殖均被抑制（表 2），同时与紫杉醇组相比，木犀草素也表现出抑制细胞增殖的作用（图 6B、表 2，P0.05）。2.6 木犀草素抑制 ESCC 细胞迁移和细胞侵袭细胞划痕和 Transwell 结果显示，与对照组注：A.通过 Venny2.1获取木犀草素与ESCC 共同靶点；B.通过数据库平台STRING 构建木犀草素与ESCC PPI 网络Note:A.The shared targets for luteolin and ESCC were obtained by Venny2.1;B.The network of luteolin and ESCC PPI was constructed by STRING database图1 木犀草素与 ESCC 共同靶点及 PPI 网络Figure 1 Shared targets for luteolin and ESCC shown and visualized by PPI networkAB注：A.Cytoscape 3.9.1软件获取和分析木犀草素与ESCC Hub 靶点，红色代表核心靶点，其周围相关线的密集程度、颜色深浅和圆圈的大小反映了Degree 值的大小；B.MCODE 插件分析 Hub 靶点子网络聚类（Cluster 13）Note:A.Cytoscape 3.9.1 software was used to acquire and analyze Hub targets for luteolin and ESCC.Red represented the core target,and the Degree value was reflected in the density of the surrounding correlation lines,color depth and circle size;B.The clustering(Cluster 13)Hub targets were analyzed by MCODE plug-in of Cytoscape 3.9.1图 2 木犀草素与 ESCC Hub 靶点与子网络聚类Figure 2 Hub targets for luteolin and ESCC and subnetwork clusteringBA中国药物警戒 第 20 卷第 9 期 2023 年 9 月 September,2023,Vol.20,No.9996（DMSO）相比，10、20 molL-1木犀草素处理组细胞的迁移率和穿膜数均显著降低（P0.05）（图78，表 34）。2.7 木犀草素抑制 FAK-SRC-PI3K-Akt 通路关键蛋白的表达水平Western blot 检测 FAK-SRC-PI3K-Akt 通路关键蛋白及耐药相关蛋白的表达变化。结果显示，与对照组（DMSO）相比，木犀草素处理组细胞中 p-FAK（Tyr397）、SRC、p-SRC（Tyr416）和 p-Akt（Ser473）的表达水平均被显著下调（P0.05）（图 9，表 56）。2.8 木犀草素与靶点蛋白的分子对接将木犀草素与靶点蛋白AKT1、ESR1、SRC、EGFR、PTGS2、MMP9、AR、MMP2、CCNB1、KDR 和 FAK 分别做分子对接验证，若结合能越小，则对接效果越好，结果表明均具有良好的结合活性（表7），其中AKT1、SRC 和FAK分子对接图分析如图10 所示。3 讨论在体外，木犀草素对多种癌症具有抑制作用，表1 Hub 靶点子网络聚类列表Table 1 List of the clustering Hub targets 聚类得分节点边Hub 靶点Cluster 110.4281573GSK3B,SRC,MMP9,CCNB1,PTGS2,APP,PARP1,CYP19A1,PLG,IGF1R,AKT1,KDR,MMP3,MMP2,ARCluster 24.8331329AHR,ESR2,TERT,MET,AURKB,ABCB1,TOP1,CDK1,EGFR,CA9,ESR1,PTK2,CCNB2Cluster 33.00033CDK2,CDK6,PLK1注：A.木犀草素-ESCC 共同靶点GO 分析；B.木犀草素-ESCC 共同靶点 KEGG 分析；BP.生物学过程；CC 细胞组分；MF.分子功能Note:A.The GO analysis for shared targets of luteolin and ESCC;B.The KEGG analysis for shared targets of luteolin and ESCC;BP.Biological process;CC cell component;MF.Molecular function图 3 木犀草素-ESCC 共同靶点 GO 分析与 KEGG 分析Figure 3 GO and KEGG analysis of shared targets of luteolin and ESCCBA中国药物警戒 第 20 卷第 9 期 2023 年 9 月 September,2023,Vol.20,No.9997图 4 木犀草素-ESCC 共同靶点与 PI3K-Akt 通路关系图Figure 4 Shared targets of luteolin and ESCC and PI3K-Akt pathway注：ESCC.食管鳞状细胞癌；luteolin.木犀草素；木犀草素和 ESCC 共同靶点（四周，蓝色）；KEGG 富集信号通路（中心，绿色）Note:ESCC.Esophageal squamous cell carcinoma;luteolin.Luteolin;the shared targets for luteolin and ESCC(surrounding,blue);KEGG enriched signal pathways(center,green)图 5 木犀草素-靶点-疾病-通路相互作用的网络图Figure 5 Network of luteolin-target-disease-pathway interactions中国药物警戒 第 20 卷第 9 期 2023 年 9 月 September,2023,Vol.20,No.9998表 2 TE-13 和 KYSE-510 细胞中不同药物的 IC50值(x-s，n=3)Table 2 IC50 values of different drugs in TE-13 and KYSE-510 cells(x-s，n=3)时间/hLUT-IC50/mmolL-1PTX-IC50/mmolL-1TE-13KYSE-510TE-13KYSE-51024 58.982.8148.131.8460.451.8455.321.8448 20.691.9624.610.9828.490.9824.880.98t19.3415.9917.3120.17P 0.001 0.001 0.001 0.001注：A.木犀草素对 ESCC 细胞形态的影响；B.木犀草素对 ESCC 细胞增殖的影响（x-s，n=3）Note:A.Effects of luteolin on morphology in ESCC cells;B.Effects of luteolin on proliferation in ESCC cells（x-s，n=3）图 6 木犀草素对 ESCC 细胞形态和细胞增殖的影响Figure 6 Effects of luteolin on morphology and proliferation of ESCC cells BA注：A.不同处理组 ESCC 细胞的迁移能力；B.不同处理组 ESCC 细胞的迁移率（*P0.001 vs DMSO，x-s，n=3）Note:A.The migration ability of ESCC cells in different treatment groups;B.The migration rate of ESCC cells in different treatment groups(*P0.001 vs DMSO，x-s，n=3)图 7 木犀草素对 ESCC 细胞迁移能力的影响Figure 7 Effects of luteolin on migration ability of ESCC cellsAB中国药物警戒 第 20 卷第 9 期 2023 年 9 月 September,2023,Vol.20,No.9999包括肝细胞癌、乳腺癌、肺癌、口腔鳞状细胞癌、胃癌、结直肠癌以及 ESCC 4。本研究发现，在木犀草素作用于 ESCC 的 PPI 网络中，AKT1、ESR1、SRC、EGFR、PTGS2、MMP9、AR、MMP2、CCNB1 和KDR 是基于节点 Degree 值的前 10 个靶点。这些蛋白被认为是 Hub 靶点，可能在木犀草素抗 ESCC 的过程中起重要作用。为了预测木犀草素抗 ESCC 的潜在机制，对 69个潜在靶点进行了GO 富集和 KEGG 分析，结果表明上述靶点主要涉及细胞氧化应激、蛋白质修饰等生物学过程，与抑制活性氧、抗炎、抑制细胞外基质等信号通路有密切关系。其中相关信号通路包括蛋白聚糖、活性氧、PI3K-Akt 等。多种研究表明蛋白聚糖作为细胞外基质的成分之一，在基质组织和调节肿瘤细胞-基质相互作用中尤为重要，可调节 ESCC表4 木犀草素对 ESCC 细胞穿膜细胞数的影响（x-s，n=3）Table 4 Effects of luteolin on numbers of ESCC cells（x-s，n=3）ESCC 细胞细胞数(*P0.001 vs DMSO)DMSOLUT-10 mmolL-1LUT-20 mmolL-1TE-138136538120*21720*KYSE-5103572311113*6314*注：与DMSO 组比，*P0.001Note:*P0.001 vs DMSO表 3 木犀草素对 ESCC 细胞 24 h 迁移率的影响（x-s，n=3）Table 3 Effects of luteolin on 24 h migration rate of ESCC cells（x-s，n=3）ESCC 细胞24 h 迁移率/%DMSOLUT-10 mmolL-1LUT-20 mmolL-1TE-1355.745.55 17.973.16*10.903.71*KYSE-51069.262.56 48.643.12*37.543.98*注：与DMSO 组比，*P0.001Note:*P0.001 vs DMSO细胞迁移/侵袭和上皮间质转化5。活性氧水平升高被认为是致癌因素，会导致 DNA、蛋白质和脂质受损，促进遗传不稳定性和肿瘤发生6-7。其还在癌症中充当信号分子，有助于变异细胞生长、转移、抗凋亡，并在癌症中诱导分化阻滞8-9。而 PI3K-Akt 信号通路是最重要的细胞内通路之一，可调节细胞的生长、分化、代谢和细胞骨架重组，并对一系列信号作出反应，包括生长因子受体酪氨酸激酶和 G 蛋白偶联受体信号转导10-12。该信号通路受到各种癌基因和生长因子受体的刺激，如 InsR、IGF-1R、EGF、PDGF-R13。大多数癌蛋白和肿瘤抑制因子参与细胞代谢/信号传导调节，其在 PI3K-Akt 信号转导通路中以平衡状态会聚，可被激活、失活、靶向关联的蛋白而改变14。黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）是一种由 PTK2 编码的细胞质非受体酪氨酸激酶15-16，在各种类型的肿瘤中过度表达并与不良临床结果相关，包括 ESCC17-18。重要的是，由于 FAK 将来自上游 RTK 的信号转化为下游信号通路中的作用19，因此常作为信号枢纽来控制分子网络并介导肿瘤细胞的各种细胞活动。FAK 磷酸化后可促进黏着斑的形成，促进肿瘤的 EMT 和侵袭转移，激活后可以引发SRC 的激活，导致下游底物的活化进而调节 PI3K-Akt、MAPK 与 STAT3 等多条信号通路，促进肿瘤的侵袭转移20。多种研究表明21-22，通过抑制 FAK的表达，发现其介导下游 PI3K-Akt 信号和 ESCC 特异性肿瘤标志物的表达均受到抑制。以上研究内容提示在关注 PI3K-Akt 前提下，FAK 作为上游靶点可能起到抑制 ESCC 的作用。本文研究表明木犀注：A.通过小室实验观察不同处理组 ESCC 细胞的侵袭能力；B.比较不同处理组 ESCC 细胞的穿膜数（*P0.001 vs DMSO,x-s，n=3）Note:A.The invasion ability of ESCC cells in different treatment groups was observed by Transwell assay;B.The number of cells in different treatment groups was compared(*P0.001 vs DMSO,x-s，n=3）图 8 木犀草素对 ESCC 细胞侵袭能力的影响Figure 8 Effects of luteolin on invasion ability of ESCC cells AB中国药物警戒 第 20 卷第 9 期 2023 年 9 月 September,2023,Vol.20,No.91000表5 木犀草素对 TE-13 细胞中FAK-SRC-PI3K-Akt 通路蛋白表达的影响（x-s，n=3）Table 5 Effect of luteolin on FAK-SRC-PI3K-Akt signaling pathway in TE-13 cells（x-s，n=3）蛋白相对表达量（TE-13）DMSOLUT-10 mmolL-1LUT-20 mmolL-1LUT-40 mmolL-1FAK1.040.041.030.090.990.030.960.03P-FAK1.060.060.820.02*0.650.04*0.280.02*SRC0.990.070.850.02*0.720.05*0.450.05*p-SRC0.990.040.840.01*0.610.07*0.320.10*AKT0.990.061.030.051.020.050.920.06p-AKT1.010.050.800.03*0.500.10*0.240.10*注：与DMSO 组比，*