浊毒清对db_db小鼠胰岛...抗及胰岛β细胞保护作用研究_李光美.pdf

收稿日期：；修订日期：基金项目：国家自然科学基金地区基金（）；贵州省科技合作计划（黔科合 字 号）作者简介：李光美（），女（汉族），贵州遵义人，贵州中医药大学在读硕士研究生，学士学位，主要从事中医药对内分泌代谢性疾病的防治研究工作通讯作者简介：赵 伟（），男（白族），贵州毕节人，贵州中医药大学主任医师，硕士研究生导师，硕士学位，主要从事中医药对内分泌代谢性疾病的防治研究工作浊毒清对 小鼠胰岛素抵抗及胰岛 细胞保护作用研究李光美，邓春艳，赵 伟，李珊珊，吴 青，陈永华（贵州中医药大学，贵州 贵阳；贵州省职工医院，贵州 贵阳；贵州省第二人民医院，贵州 贵阳）摘要：目的 通过 样受体（）核因子 （）炎症通路，探讨浊毒清改善自发性 型糖尿病 小鼠胰岛素抵抗的作用机制。方法 选择 周龄 级雄性自发性 型糖尿病 小鼠 只及同周龄雄性同系正常 小鼠 只。小鼠随机平均分为模型组（）、浊毒清低剂量组（）、浊毒清高剂量组（）及罗格列酮组（），小鼠设为空白对照组（），连续灌胃给药 周后检测指标。采用口服葡萄糖耐量试验曲线下面积（，）、稳态模型测定胰岛素抵抗指数（，）及定量胰岛素敏感性检查指数（，）评价胰岛素抵抗，蛋白免疫印迹法（）及逆转录聚合酶链反应（）技术检测小鼠骨骼肌组织中、激酶复合物（）、抑制蛋白（）的蛋白及 表达水平，免疫组化及 染色检测小鼠胰腺组织。结果 与模型组相比，浊毒清组能降低 小鼠口服葡萄糖耐量曲线下面积及 （），升高（），下调 小鼠骨骼肌组织中、蛋白及 表达水平（）；浊毒清组小鼠胰岛结构相对完整，形态较良好，边界相对清楚，胰岛细胞排列相对整齐、规则，细胞核呈（类）圆形，大小较均一，核染色较深，胞浆相对丰富，胞核居中。结论 浊毒清能抑制代谢性炎症，改善胰岛素抵抗，其机制可能与抑制 炎症通路有关，且可能对胰岛 细胞具有保护作用。关键词：代谢性炎症；通路；浊毒清；型糖尿病；胰岛素抵抗 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，；，；，）：（），（），（）（）（）（），（）（），（）（），（），：；时珍国医国药 年第 卷第 期 胰岛素抵抗（，）是 型糖尿病（，）发病的中心环节和病理生理学基础，其机制尚未完全阐明。代谢性炎症（）被认为是由营养过剩或营养过剩驱动的慢性炎症的形式，其分子机制类似于传统的炎症反应，但它是一种慢性的低程度的炎症反应。目前认为，代谢性炎症与 型糖尿病胰岛素抵抗密切相关，是 的一个关键组成部分，可导致胰岛素抵抗。是重要的炎症介质，最近研究表明，及其信号通路与胰岛素抵抗的发生发展密切相关。是核 信号通路的上游物质，可通过激活 信号通路引起代谢性炎症反应导致胰岛素抵抗，进而发生。罗格列酮可通过抑制 信号传导通路的活性，下调下游促炎细胞因子水平，从而抑制代谢炎症。属于中医学“消渴”范畴，目前越来越多的研究表明解毒化浊法是治疗 的有效方法。笔者基于解毒化浊法创立的中药复方“浊毒清”在临床上治疗本病已取得较好疗效，但其机制有待进一步阐明。因此，本研究拟探讨浊毒清方通过 信号通路改善 型糖尿病胰岛素抵抗的作用机制，将探究结果报道如下。材料与仪器 动动物物 级雄性 周龄自发性 型糖尿病 小鼠 只，同周龄雄性正常 小鼠 只，重量 ，均购自常州卡文斯实验动物有限公司（合格证号：），此试验开展经贵州中医药大学实验动物研究所，伦理委员会审查批准。药药物物与与试试剂剂 浊毒清（，）由贵州中医药大学第二附属医院药剂室统一采购，罗格列酮（，）（成都恒瑞制药有限公司，批准文号：），苏木、组化一抗稀释液、显色试剂盒、增强酶标山羊抗小鼠 兔 聚合物、辣根酶标记山羊抗兔（）（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号分别为：、），、抗体（公司，批号分别为：、）；试剂盒（南京建成生物公司研究所，批号：），蛋白、反转录试剂盒、蛋白浓度测定试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司，批号分别为：、），一抗稀释液（公司，批号：）。仪仪器器 超净工作台（济南鑫贝西生物技术有限公司），离心振荡器、离心机（美国 公司），低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），荧光定量 仪、电转仪、电泳槽、酶标仪（美国伯乐公司），、电冰箱（青岛海尔股份有限公司），超低温冷冻箱（中科美菱低温科技股份有限公司），水平摇床（江苏海门其林贝尔仪器制造公司），显影仪（美国 公司），切片机（德国 公司），包埋机（湖北泰维科技实业有限公司），血糖仪及试纸（德国罗氏整合型血糖仪）。方法 药药物物制制备备 浊毒清：佩兰，黄连，茯苓，陈皮，水蛭，苦杏仁，薏苡仁，白豆蔻，甘草 组成，将药材用相当于药材量 倍的纯水浸泡，武火煮沸后文火煎煮，过滤后收集煎液；原渣再加水煎煮，过滤取煎液，两液相混合，浓缩成 煎液含 原药材。罗格列酮，规格 片，以上药材由贵州中医药大学第二附属医院药剂室统一采购及制备。实实验验动动物物的的分分组组及及给给药药 级雄性 周龄自发性 型糖尿病 小鼠 只，同周龄雄性正常 小鼠 只，重量 ，适应性喂养 周后随机将 小鼠分为模型组（）、浊毒清低剂量组（）、浊毒清高剂量组（）和罗格列酮组（）组，每组 只，正常 小鼠设为空白对照组（）。连续 周每日灌胃给药，其中 组和 组予蒸馏水灌胃，给药剂量均为 （）；组给药剂量为 （），组剂量为 （），组剂量为 （）。指指标标检检测测 水水平平 小鼠灌胃至第 周末，所有小鼠禁食不禁水，于次日清晨尾尖采血检测各小鼠空腹血糖，记录为 血糖值。记录完毕后按 葡萄糖灌胃，分别于灌胃后、和 尾尖采血测血糖。绘制各组小鼠各时间点血糖水平曲线图，计算。及及 水水平平 空腹血糖 空腹胰岛素；（空腹血糖 空腹胰岛素）。、蛋蛋白白及及 表表达达 法检测小鼠骨骼肌组织中、蛋白表达；法检测小鼠骨骼肌组织中、表达。小小鼠鼠胰胰腺腺组组织织的的病病理理检检测测 染色及免疫组化法检测小鼠胰腺组织的病理改变。统统计计分分析析 统计学分析用 软件，所有数据经正态性检测符合正态分布后，计量资料以标准差 均数（?）表示，各组间比较采用单因素方差分析（）进行分析，以 视为差异有统计学意义。结果 口口服服葡葡萄萄糖糖耐耐量量曲曲线线下下面面积积（）与模型组相比，浊毒清低、高剂量组及罗格列酮组小鼠 明显减小（）；与罗格列酮组相比，浊毒清低、高剂量组曲线下面积无明显差异（）；浊毒清低、高剂量组相比无明显差异（）。结果见表。表 各组小鼠口服葡萄糖耐量试验曲线下面积比较（?）组别空白组（）模型组（）浊毒清低剂量组（）浊毒清高剂量组（）罗格列酮组（）与 组相比，、水水平平 与模型组比较，浊毒清低、高剂量组及罗格列酮组小鼠、水平明显降低（），升高（）；与罗格列酮组比较，浊毒清低剂量组、升高（）、降低（），浊毒清高剂量组、无明显差异（）；与低剂量组相比，浊毒清高剂量组、降低（）、升高（）。结果见表。表 小鼠各组、比较（?）组别 空白组（）模型组（）浊毒清低剂量组（）浊毒清高剂量组（）罗格列酮组（）与 组相比，；与 组相比，；与 相比，时珍国医国药 年第 卷第 期 、蛋蛋白白表表达达 与模型组相比，浊毒清低、高剂量组及罗格列酮组小鼠、蛋白表达减少（）；与罗格列酮组相比，浊毒清低剂量组 蛋白表达明显增多（），而、蛋白表达无差异（），浊毒清高剂量组、蛋白表达无显著差异（）；浊毒清低、高剂量组相比，高剂量组 蛋白表达较低剂量组明显减低（），、蛋白表达较低剂量组有减低趋势，但差异无统计学意义。结果见表、图。表 检测小鼠各组、比较（?）组别空白组（）模型组（）浊毒清低剂量组（）浊毒清该机两组（）罗格列酮组（）与 组相比，；与 组相比，；与 相比，图 小鼠骨骼肌组织、的蛋白表达水平 、的的表表达达 与模型组相比，浊毒清低、高剂量组及罗格列酮组小鼠、表达显著降低（）；与罗格列酮组相比，浊毒清低、高剂量组小鼠、表达未见明显差异（）；浊毒清低、高剂量组相比，、表达未见明显差异（），见表。浊浊毒毒清清对对小小鼠鼠胰胰腺腺组组织织的的影影响响 染染色色 见图。正常对照组小鼠胰岛结构完整，形态良好，边界清楚，胰岛细胞排列整齐、规则，细胞核呈（类）圆形，大小较均一，核深染，胞浆丰富，胞核居中，未见炎症细胞浸润。模型组小鼠胰岛结构不完整，形态异常，边界不清，胰岛内细胞排列紊乱，大小不等，局部呈“拥挤状”，细胞核可见较多（类）椭圆形，核淡染，部分细胞胞浆欠丰富，胞核靠近细胞膜见细胞空泡。浊毒清低、高剂量组及罗格列酮组与模型组相比胰岛结构相对完整，形态较良好，边界相对清楚，胰岛细胞排列相对整齐、规则，细胞核呈（类）圆形，大小较均一，核染色较深，胞浆相对丰富，胞核居中。表 检测小鼠各组、比较（?）组别空白组（）模型组（）浊毒清低剂量组（）浊毒清高剂量组（）罗格列酮组（）与 组相比，图 各组小鼠胰岛形态 免免疫疫组组化化检检测测 见如图。正常组小鼠胰岛细胞团中胰岛细胞浆呈明显棕黄色着色，只局部胰岛细胞核有着色。而模型组小鼠胰岛细胞团中胰岛细胞核呈明显棕黄色着色，细胞浆几乎不着色。浊毒清低、高剂量组及罗格列酮组与模型组相比，胰岛细胞团中胰岛细胞浆着色较深，胰岛细胞核较模型组着色浅。讨论现代医学普遍认为糖、脂毒性及炎症论是 发生发展的主要病理机制，糖脂毒性可引起胰岛 细胞功能障碍，进而导致糖尿病。炎症因子如 、等可抑制胰岛素信号通路导致胰岛素抵抗从而诱发 。在炎症因子产生过程中，是一种介导多种炎症介质生成的重要转录因子，其信号通路包括受体和受体近端信号衔接蛋白、和 二聚体，可以启动炎症相关基因，从而促发炎症因子的产生。研究表明，可通过增加炎症介质转录、促进炎症因子生成从而导致胰岛素抵抗。是 信号通路的上游物质，及其信号通路的上调和激活与胰岛素抵抗糖尿病患者的炎症反应有关，通过激活，促进炎性因子分泌，从而导致胰岛素抵抗。图 、在胰腺组织的表达目前中医认为糖脂毒性及低度炎症是机体组织的“中毒状态”，糖脂、炎症等浊邪壅滞于血分，郁久化毒，从而导致胰岛素功能障碍。“浊毒”既是消渴病的病理产物，同时又是其致病因素，是消渴病发生发展的核心所在，胰岛素抵抗的实质即浊阴为患，并提出浊毒瘀滞而致消及解毒化浊法是消渴治疗的重要治法的观点。进一步的研究证实，具有解毒化浊功效的黄连时珍国医国药 年第 卷第 期 解毒汤、葛根芩连汤可降低体内炎症因子水平，进而改善胰岛素抵抗，。解毒化浊中药复方浊毒清治疗糖尿病及其并发症的机制与其改善胰岛素抵抗有关，且实验研究表明浊毒清可降低炎症因子水平。上述研究提示解毒化浊法可通过抑制代谢性炎症改善胰岛素抵抗，从而治疗。本研发现，基于解毒化浊法创制的中药复方浊毒清可显著降低、，升高；且可显著降低炎症因子 、水平。研究表明，浊毒清可呈剂量相关性的改善胰岛素抵抗、抑制代谢性炎症，浊毒清可能是通过抑制代谢性炎症进而改善胰岛素抵抗。本研究进一步发现，与模型组相比，浊毒清组干预的小鼠骨骼肌中、蛋白及 水平的表达明显降低，表明浊毒清能够抑制 信号通路，其改善胰岛素抵抗的机制可能与其抑制 信号通路有关。本研究还发现，与模型组相比，浊毒清治疗组胰岛结构相对完整，形态较良好，边界相对清楚，胰岛细胞排列相对整齐、规则，细胞核呈（类）圆形，大小较均一，核染色较深，胞浆相对丰富，胞核居中。表明浊毒清在改善胰岛素抵抗的同时，对胰岛 细胞具有保护作用。这是本研究一个令人惊喜的“意外”发现。胰岛 细胞分泌缺乏、功能下降是 发生发展的关键原因，短期胰岛素强化治疗可提高 患者的血糖达标率，降低 表达，并改善了胰岛 细胞功能。过氧化物酶（）通过 磷酸化参与细胞质中关键促炎转录因子 的调节，促进胰腺细胞再生，恢复胰岛细胞功能。谷甾醇（佩兰提取物）、京尼平苷（栀子提取物）等具有解毒化浊利湿功效，可通过促进胰岛 细胞的增殖及再生进而治疗，。降糖三黄片具有延缓“糖脂毒性”作用下 细胞去分化的作用。藉此推测，浊毒清保护胰岛 细胞作用可能与促进胰岛 细胞的增殖及再生、影响 细胞的去分化与再分化相关。综上所述，浊毒清能够有效改善胰岛素抵抗，抑制代谢性炎症反应，且其改善胰岛素抵抗的机制极大可能与抑制 信号通路有关；且浊毒清还对胰岛 细胞具有保护作用，其机制可能与促进胰岛 细胞的增殖及再生、影响 细胞的去分化与转分化相关，但具体作用及机制尚需进一步研究。参考文献：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，：陆 贝，于源泉，殷俊杰，等 信号通路在急性胰腺炎大鼠肝损伤中的表达及 激动剂的保护作用 中国现代医生，（）：赵 伟，李双蕾，唐爱华，等 浊毒清治疗糖尿病周围神经病变 例临床观察 新中医，（）：赵伟，覃美琳，李双蕾，等 浊毒清颗粒对糖尿病肾病患者、影响的研究 时珍国医国药，（）：赵 伟，李双蕾，唐爱华，等 浊毒清治疗单纯型糖尿病视网膜病变临床研究 时珍国医国药，（）：赵 伟，冯晓桃，李双蕾，等 基于浊毒理论探讨浊毒清颗粒对糖尿病性膀胱的疗效 世界科学技术 中医药现代化，（）：，（）：简磊，胡斌，高明杰 过表达 抑制脂多糖诱导的胰岛 细胞炎症因子表达及 信号通路激活 免疫学杂志，（）：，（）：，（）：，（）：庆 泽，李雪可，刘建平，等 国医大师李佃贵基于浊毒学说分期辨治溃疡性结肠炎 吉林中医药，（）：吉训超，谢志雄，刘艳霞 型糖尿病胰岛素抵抗的中医实质初探 新中医，（）：吕雄，邱健行 吕雄教授糖尿病治验与临床应用 广州：广东科技出版社，：章常华，马广强，邓永兵，等 葛根芩连汤对 糖尿病小鼠血浆中、及肠道菌群的影响 中草药，（）：黄秀芳，陶彦谷，张茹兰，等 黄连解毒汤对胰岛素抵抗大鼠炎症因子和氧化应激水平的影响 中国中医药科技，（）：，（）：杨明明，程 霖，许 冰，等 短期胰岛素强化治疗对 型糖尿病患者外周血 和 表达的影响 海南医学，（）：，：，（）：，（）：降糖三黄片对高糖高脂饮食大鼠胰岛 细胞去分化的作用 广州中医药大学学报，（）：时珍国医国药 年第 卷第 期