复旦大学生化噬菌体策略.ppt

第四章第四章噬菌体策略噬菌体策略Phagestrategies1.一些概念一些概念v噬菌体（噬菌体（bacteriophage）：感染）：感染细菌的病毒（菌的病毒（virus）v噬菌斑（噬菌斑（plaque）：噬菌体裂解宿主）：噬菌体裂解宿主细胞的斑胞的斑v裂解感染（裂解感染（lytic infection）：）：细菌被噬菌体感染后致使菌被噬菌体感染后致使细菌死亡并菌死亡并释放出子代噬菌体放出子代噬菌体v溶源（溶源（lysogeny）：噬菌体以原噬菌体形式成）：噬菌体以原噬菌体形式成为细菌基因菌基因组中中稳定的定的组分而分而继续存活存活v原噬菌体（原噬菌体（prophage）：噬菌体的基因）：噬菌体的基因组通通过整合整合（integrate）成）成为细菌菌线性染色体的一部分性染色体的一部分v免疫（免疫（immunity）：原噬菌体可以阻止同）：原噬菌体可以阻止同类其他的噬菌体其他的噬菌体感染同一个感染同一个细胞胞v诱导（induction）：原噬菌体通）：原噬菌体通过诱导解除溶源化的限制解除溶源化的限制2.1 裂解周期（裂解周期（lytic cycle）v有些噬菌体只有一种生存方式（有些噬菌体只有一种生存方式（strategy），在感），在感染了一个易感宿主之后，破坏了宿主的功能而同染了一个易感宿主之后，破坏了宿主的功能而同时产生大量子代噬菌体生大量子代噬菌体颗粒，宿主粒，宿主细菌菌则裂解死亡裂解死亡v一个典型的裂解周期中，噬菌体一个典型的裂解周期中，噬菌体 DNA（或（或RNA）注入宿主注入宿主细胞，其基因以一定的胞，其基因以一定的顺序序转录，并且复，并且复制出噬菌体的制出噬菌体的遗传物物质，合成噬菌体，合成噬菌体颗粒需要的蛋粒需要的蛋白白质成分。最后宿主成分。最后宿主细菌裂解而菌裂解而释放出放出组装好的子装好的子代噬菌体代噬菌体3.噬菌体噬菌体颗粒（粒（particle）感染（感染（infection）附着（附着（attach）DNA被注射被注射进细菌菌早期早期发育（育（early development）产生生DNA合成合成酶类DNA复制开始复制开始晚期晚期发育（育（late development）产生基因生基因组、头、尾、尾DNA包装包装进头，尾附着，尾附着裂解（裂解（lysis）细胞破裂胞破裂释放出子代噬菌体放出子代噬菌体4.裂解裂解发育的育的2个个时期期早期早期发育育 从噬菌体从噬菌体DNA进入到复制开始。主要合成与入到复制开始。主要合成与DNA复制相关的复制相关的酶（DNA合成、重合成、重组和修和修饰的的酶），），导致基因致基因组不断的复制和重不断的复制和重组晚期晚期发育育 从复制开始到从复制开始到细胞裂解胞裂解释放出子代噬菌体。噬菌体放出子代噬菌体。噬菌体颗粒的蛋白粒的蛋白质成分被合成（成分被合成（结构蛋白和装配蛋白）构蛋白和装配蛋白）噬菌体通常噬菌体通常拥有保有保证使噬菌体使噬菌体DNA优先复制的功能基因先复制的功能基因（复制起始或新的（复制起始或新的DNA聚合聚合酶）；）；噬菌体的噬菌体的mRNA被被优先先转录（改（改变RNA聚合聚合酶的起始和的起始和终止能力或更止能力或更换RNA聚合聚合酶）噬菌体通常利用宿主的合成机器合成自己的蛋白噬菌体通常利用宿主的合成机器合成自己的蛋白质 5.裂解裂解发育的基因表达育的基因表达u早期基因（早期基因（earlygene）：最初）：最初阶段必段必须依依赖宿主宿主转录机构表达的基因（机构表达的基因（噬箘体噬箘体中中为早早早早期期immediateearlygene）u中期基因（中期基因（middlegene）获得早期基因得早期基因编码的的调控蛋白后表达的基因（或称控蛋白后表达的基因（或称迟早期早期delayedearlygene）u晚期基因（晚期基因（lategene）中期基因）中期基因编码的的调控因控因子控制的基因子控制的基因6.裂解表达的裂解表达的级联控制控制v噬箘体基因位置噬箘体基因位置组成（成（遗传图谱）反映了裂解）反映了裂解进程的次程的次序，它的操序，它的操纵子是一个极其有序的子是一个极其有序的结构，构，编码相关功能相关功能蛋白蛋白质的基因成簇排列使得的基因成簇排列使得调控最控最为经济，使得裂解的，使得裂解的进程能由少数的程能由少数的调控开关控制控开关控制v裂解周期受到正裂解周期受到正调控，噬菌体的基因只有接受到恰当的控，噬菌体的基因只有接受到恰当的信号才被表达。信号才被表达。在在这个个级联反反应中，上个步中，上个步骤合成的蛋合成的蛋白白质将是下一个步将是下一个步骤要表达的基因所必要表达的基因所必须的的v在每个表达的在每个表达的阶段，一个或多个活段，一个或多个活跃的基因就是下个的基因就是下个阶段所需的段所需的调节因子，因子，这些些调节因子可以是一种新的因子可以是一种新的RNA聚合聚合酶、改、改变宿主宿主RNA聚合聚合酶特异性的特异性的sigma因子、或因子、或是能使之通是能使之通读的抗的抗终止因子止因子7.级联控制的控制的2种途径种途径u转录起始：起始：识别新的噬菌体启新的噬菌体启动子，用一种子，用一种因子取因子取代宿主代宿主酶的的因子因子（spo1）或合成新的）或合成新的RNA聚合聚合酶。新新因子或因子或RNA聚合聚合酶生成后，早期基因表达可被生成后，早期基因表达可被终止止u抗抗终止作用：早期基因与下一期基因相止作用：早期基因与下一期基因相邻，由，由终止位止位点隔开。如果点隔开。如果终止作用被阻止，止作用被阻止，RNA聚合聚合酶便通便通读至至另一另一边基因，基因，这样早期基因与晚期基因一起表达早期基因与晚期基因一起表达8.2 溶源（溶源（lysogeny）v另一些噬菌体有两种存在方式：裂解和溶源另一些噬菌体有两种存在方式：裂解和溶源v溶源的溶源的结果是原噬箘体整合到果是原噬箘体整合到细菌基因菌基因组上，上，并与并与细菌基因一起菌基因一起遗传v由于含有一个原噬箘体，溶源菌会由于含有一个原噬箘体，溶源菌会对同同样类型型的噬箘体的噬箘体产生免疫，一个生免疫，一个细菌基因菌基因组只包含一只包含一个拷个拷贝的同一的同一类型的原噬箘体型的原噬箘体v有两种策略的噬菌体可以有两种策略的噬菌体可以进行溶源和裂解生活行溶源和裂解生活周期的交替周期的交替9.溶原和裂解的相互溶原和裂解的相互转化化v由由裂裂解解周周期期产生生的的一一个个噬噬菌菌体体进入入一一个个新新的的宿宿主主细胞胞后后，或或者者会会重重复复裂裂解解周周期期，或或者者进入入溶溶源源状状态，这取取决决于于感感染染的的状状态及及噬噬菌菌体体和和细菌菌的的基基因因型型v在在诱导（induction）的的过程程中中，原原噬噬菌菌体体被被切切除除下下来来，从从而而脱脱离离溶溶源源生生存存方方式式约束束获得得自自由由，产生一个自由的噬菌体生一个自由的噬菌体DNA，由此，由此进行裂解旁路行裂解旁路v噬菌体以何种方式繁殖是由噬菌体以何种方式繁殖是由转录调节来控制的来控制的10.11.v噬菌斑（噬菌斑（plaque）v最初一个噬菌体感染一个最初一个噬菌体感染一个细胞，裂解胞，裂解释放的子代噬放的子代噬菌体又感染旁菌体又感染旁边的的细胞，胞，感染的感染的连锁反反应呈放射状呈放射状分布，逐分布，逐渐形成一个噬菌形成一个噬菌斑斑v烈性噬菌体形成清晰的噬烈性噬菌体形成清晰的噬菌斑菌斑v温和的噬菌体形成温和的噬菌体形成浑浊的的噬菌斑噬菌斑12.3 噬箘体的表达噬箘体的表达调控控v（lambda）噬箘体噬箘体基因基因组：48502bpv线性双性双链DNAv两端有两端有12碱基的粘性末端（碱基的粘性末端（cohesive cos），），进入入细胞后胞后变为环状状DNAv DNA环化后，晚期基因在化后，晚期基因在转录时是完整是完整的的v噬箘体噬箘体基因基因组编码约35个蛋白个蛋白质13.噬菌体的操噬菌体的操纵子子v早早期基因：早早期基因：PR、PL v迟早期基因：早期基因：PR、PLv裂解晚期基因：裂解晚期基因：PR、PL、PRv溶源晚期基因：溶源晚期基因：PRE、PaQ、PIv溶源溶源维持基因：持基因：PRM14.15.16.17.3.1 噬菌体的裂解途径噬菌体的裂解途径v 噬箘体噬箘体DNA进入一个新的宿主入一个新的宿主细胞后，裂胞后，裂解与溶源以相同的途径启解与溶源以相同的途径启动v第一第一阶段是利用宿主的段是利用宿主的RNA聚合聚合酶进行早早行早早期（期（immediate early）基因的）基因的转录v 噬菌体只有两个早早期基因，各自独立地噬菌体只有两个早早期基因，各自独立地由宿主由宿主RNA聚合聚合酶表达表达v 噬菌体的裂解噬菌体的裂解级联反反应建立在抗建立在抗终止作用止作用基基础上上18.早早期基因的表达早早期基因的表达v从启从启动子子PR向右向右转录到到tR1，可以表达，可以表达cro蛋白蛋白 vcro蛋白有双重功能：蛋白有双重功能：v抑制阻遏物的合成（抑制阻遏物的合成（对裂解裂解进行是必需的）行是必需的）v关关闭早早期基因的表达（在裂解周期晚期已不需要）早早期基因的表达（在裂解周期晚期已不需要）v（cro在后面在后面还要要详细介介绍）v从启从启动子子PL向左向左转录到到tL1，可以表达，可以表达N蛋白蛋白vpN是一个抗是一个抗终止子，它作用在止子，它作用在nut位点将允位点将允许转录过程程进入入迟早期基因早期基因v从启从启动子子 PR向右向右转录到到tR，无任何，无任何编码序列序列19.20.抗抗终止（止（antitermination）v抗抗终止作用提供了病毒控制从早期基因到下一期止作用提供了病毒控制从早期基因到下一期基因表达基因表达转变的一种机制的一种机制v抗抗终止作用依止作用依赖于基因位置的特殊安排：早期基于基因位置的特殊安排：早期基因与接下来要表达的基因非常接近，由因与接下来要表达的基因非常接近，由终止子隔止子隔开开v如果如果终止子位点被抑制，聚合止子位点被抑制，聚合酶越越过通通读另一另一边的基因，同的基因，同样的启的启动子子继续被被RNA聚合聚合酶识别v新基因的表达只在于伸新基因的表达只在于伸长RNA链，使之在，使之在5端含端含有早期基因，在有早期基因，在3端含有新的基因端含有新的基因v抗抗终止是正控制，病毒必止是正控制，病毒必须先合成早期基因的先合成早期基因的产物，然后才能表达下一物，然后才能表达下一组基因基因21.抗抗终止依止依赖特定的位点特定的位点v噬菌体的噬菌体的pN能分能分别解除解除终止子止子tR1、tL1等的等的终止作用止作用vpN的抗的抗终止作用是高度特异性的，但抗止作用是高度特异性的，但抗终止止事件并不是由事件并不是由终止子止子tR1 和和tL1决定的决定的v抗抗终止作用的止作用的识别位点在位点在转录单位的上游，是位的上游，是在与作用完成的在与作用完成的终止子位点不同的其它区域止子位点不同的其它区域vpN 识别位点：位点：nut位点（位点（N utilization site）nutL、nutR分分别决定向左或向右抗决定向左或向右抗终止作用止作用22.nut位点位点vnutL在在PL的起始点和的起始点和N编码区域的开始区域的开始之之间，接近于起始子，接近于起始子vnutR位于位于cro基因的末端和基因的末端和tR1之之间，接，接近于近于终止子止子vqut位于起始子之前位于起始子之前v这个作用涉及个作用涉及rho-依依赖性性终止子的抗止子的抗终止，但是止，但是pN也可抑制非依也可抑制非依赖终止子的抗止子的抗终止作用止作用 23.24.25.26.27.PR迟早期基因表达早期基因表达v从从PR开始的开始的迟早期（早期（delayed early）转录本表达本表达转录一直到一直到终止子止子tR3，除了，除了cro外外还有有vcII蛋白（溶源中重点介蛋白（溶源中重点介绍）vO&P蛋白：噬菌体复制所必需蛋白：噬菌体复制所必需vQ蛋白：另一个抗蛋白：另一个抗终止因子，止因子，Q是晚期基因表达所必需的是晚期基因表达所必需的28.PL迟早期表达早期表达v除了除了N蛋白，从蛋白，从PL开始的早期开始的早期转录本本还表达：表达：cIII、xis、int蛋白（后面溶源中介蛋白（后面溶源中介绍）29.裂解裂解级联依依赖抗抗终止止v早早期早早期v宿主宿主RNA聚合聚合酶从从PL、PR起始起始转录N和和crov迟早期早期vpN允允许转录越越过N和和cro后后继续，产生生pQv晚期晚期v从从Q与与S间的启的启动子子PR 开始，如果缺少开始，如果缺少了了pQ，晚期，晚期转录将在将在 tR3位点位点终止，止，转录产物物194nt，为6SRNAvpQ出出现后，抑制后，抑制tR3的的终止，止，6SRNA 得以延伸得以延伸v晚期基因的晚期基因的转录不在特定点不在特定点终止，持止，持续转录所有晚期基因乃至走出所有晚期基因乃至走出这个区域个区域v晚期基因左端的晚期基因左端的转录时也有相似的情形，也有相似的情形，经过重重组功能区后仍功能区后仍继续v每个方向上每个方向上进行的行的转录可能在聚合可能在聚合酶撞撞到一到一块前就前就终止了止了30.3.2 噬菌体的溶源途径噬菌体的溶源途径v如果要在如果要在E.coli 中建立溶源，中建立溶源，噬菌体必噬菌体必需做到：需做到：v合成阻遏物合成阻遏物v噬菌体整合到宿主染色体上噬菌体整合到宿主染色体上v既便噬菌体既便噬菌体选择溶源途径，早早期基因的溶源途径，早早期基因的表达与裂解途径相同表达与裂解途径相同31.PR迟早期表达早期表达vpN作用下的作用下的迟早期早期转录，从，从PR开始一直到开始一直到终止子止子tR3表表达达cII（其他蛋白在裂解中起作用，前面已介（其他蛋白在裂解中起作用，前面已介绍）vcII是是溶源生溶源生长所需的所需的转录激活因子，可以激活激活因子，可以激活3个启个启动子子：PRE、PaQ和和PIvcII不不稳定，定，对蛋白蛋白酶敏感敏感vcIII能能够保保护cII防止其降解防止其降解32.vpN作用下的作用下的迟早期早期转录，从，从PL开始的开始的转录表达表达cIII、xis、int（N蛋白不再介蛋白不再介绍）vcIII可以保可以保护cII蛋白蛋白vcII单独存在的半衰期独存在的半衰期 1 min；有有cIII时的半衰期的半衰期 5 minvXis一般一般认为是原噬菌体切除所必需的是原噬菌体切除所必需的vInt一般一般认为是前噬菌体整合所必需的是前噬菌体整合所必需的v值得注意的是，得注意的是，这里的里的xis和和int由于由于sib位点的反向位点的反向调节（retroregulation），），并不表达出蛋白并不表达出蛋白PL 迟早期表达早期表达33.反向反向调节（retroregulation）v在在pN作用下，由作用下，由PL的的转录越越过终止子，形成了核酸止子，形成了核酸酶的的靶位点靶位点sibvsib首先被首先被RNaseIII剪切，剪切，接着核酸外切接着核酸外切酶从从35降解降解mRNAvsib是是int基因下游的基因下游的负调节位位点，降解由下游向上游点，降解由下游向上游进行，行，故称故称为反向反向调节vsib突突变是阻止了是阻止了RNaseIII识别靶位点，靶位点，rnc-的突的突变具同具同样效果效果v由由PI的的转录在在tI终止，具止，具终止止子子结构的构的 mRNA稳定，可以定，可以表达蛋白表达蛋白34.vcII 是溶源所必需是溶源所必需的，没有或者量不的，没有或者量不够，都不能都不能进行行溶原生溶原生长vcII 是建立溶源所是建立溶源所必需的，但必需的，但维持溶持溶源是不需要的源是不需要的35.细胞中胞中cII的水平的水平v与宿主蛋白与宿主蛋白酶的水平相关的水平相关vHflA 和和 HflB是两是两类消化消化cII 的蛋白的蛋白酶（High Frequency of Lysogenization）v基因基因hflA座位座位实际上上编码3个基因个基因，其中，其中HflC 和和 HflK 是消化是消化cII 的蛋白的蛋白酶vHflB编码的蛋白的蛋白酶可以消化可以消化cII和和s s32v宿主宿主细胞的蛋白胞的蛋白酶水平与生水平与生长状状态相关，相关，营养丰富的养丰富的细胞蛋白胞蛋白酶水平高，水平高，饥饿的的细胞水平低胞水平低v与与cII、cIII的基因的基因剂量有关量有关v感染复数（感染复数（multiplicity of infection）10倍的倍的细胞胞cII半衰期可以半衰期可以长4050倍倍v野生型的模糊噬菌斑由于不同的野生型的模糊噬菌斑由于不同的moi引起引起v诱导的不可逆性是由于原噬菌体的一份基因不足以重新的不可逆性是由于原噬菌体的一份基因不足以重新建立起溶原建立起溶原36.CII激活的激活的转录37.PROMOTERSEQUENCEPRETTGCGTTTGTTTGCAAGTATPITTGCGTGTAATTGCTGTACTPaQTTGCGAGCACTTGCTAGTATconservedcIIbindingsitesareshowninred;-35sequencesareingreen;-10sequencesareinblue.保守的保守的cII结合位点合位点TTGC突突变，将影响噬菌体建立溶原的能力，将影响噬菌体建立溶原的能力38.PRE晚期表达晚期表达v由由cII激活的激活的转录，从启，从启动子子PRE开始的开始的转录v直接表达直接表达cIv细胞中有胞中有cI蛋白的蛋白的积累，就可以通累，就可以通过与操与操纵基因基因OR的的结合合激活自己的启激活自己的启动子子PRMv因因为从从PRE 转录的的mRNA 与与cro的的mRNA（从（从PR转录）有）有一段反一段反义（anti-sense）序列）序列，由于，由于编码区是双区是双链RNA而而导致致cro不能翻不能翻译，这属于反属于反义控制（控制（Antisense control）39.PRM和和PREvRE：repressor for establishment of lysogenyvRM：repressor for maintenance of lysogenyv由由PRM起始起始转录的的mRNA缺少缺少SD序列，翻序列，翻译效率差效率差v由由PRE 起始起始转录的的mRNA较长，有，有SD（Shine-Dalgarno）序列，翻）序列，翻译效果好，得到的效果好，得到的cI蛋白量比由蛋白量比由PRM启启动得到的量多得到的量多67倍倍40.41.PaQ晚期表达晚期表达v由于自我由于自我终止，从止，从PaQ 开始的开始的转录产物是一段短物是一段短的的 60 nt的反的反义 RNA，用于，用于调节 Q蛋白的表达蛋白的表达v它与它与PR的的mRNA的核糖体的核糖体结合位点（合位点（SD序列）序列）互互补，抑制，抑制Q蛋白的表达蛋白的表达v由由PaQ、PRE启启动的的转录抵消（抵消（counteract）cro和和Q在推在推动裂解裂解进程中的作用程中的作用42.PI晚期表达晚期表达v由于由于PI位于位于xis的内部，从的内部，从PI开始的开始的转录终止于止于 tI，只有只有Int蛋白能表达，适合噬菌蛋白能表达，适合噬菌体整合体整合为原噬菌体，原噬菌体，进行溶源化生行溶源化生长43.3.3 噬菌体的表达噬菌体的表达调控控v调控区：控区：基因基因组内与内与调控有关的基因和位点集中控有关的基因和位点集中在在cIII到到cII范范围内内v调控区内有控区内有4个启个启动子，子，PR、PL、PRE、和和PRMv与乳糖操与乳糖操纵子不同，子不同，噬菌体的噬菌体的启启动子子P与操与操纵基基因因O序列相互重叠，且有序列相互重叠，且有6个与阻遏物（个与阻遏物（cI和和cro）结合的位点合的位点OR3、OR2、OR1；OL3、OL2、OL1PR与与OR2、OR1重叠；重叠；PL与与OL2、OL1重叠；重叠；PRM与与OR2、OR3重叠重叠v每个操每个操纵基因上基因上3个位点和阻遏物的个位点和阻遏物的亲和力各不相和力各不相同，同，这种差异种差异对裂解或溶原途径起重要的作用裂解或溶原途径起重要的作用44.操操纵基因基因v每个操每个操纵基因由基因由17bp组成，之成，之间间隔隔37bp，间隔序列大多隔序列大多为A/Tv6个序列相似，都表个序列相似，都表现一一定程度的回文定程度的回文对称性称性v烈性突烈性突变（方框中的突（方框中的突变）减弱了回文）减弱了回文对称性，称性，减弱了与减弱了与cI的的亲和力和力v合成的参考序列，有合成的参考序列，有绝对的回文的回文对称性，具最称性，具最大的大的亲和力和力45.操操纵基因突基因突变v操操纵基因突基因突变v减弱减弱对称性的突称性的突变结合合cI的能力弱的能力弱溶原性弱溶原性弱烈烈性噬菌体性噬菌体v增增强对称性的突称性的突变结合合cI的能力的能力强溶源性溶源性强温温和噬菌体和噬菌体v间隔区突隔区突变vOR3与与OR2之之间，cI基因上游第基因上游第33个碱基个碱基对：C/G T/A，造成，造成PRM启启动功能缺陷功能缺陷vOL2与与OL1之之间，N基因上游第基因上游第31个碱基个碱基对：C/G T/A，破坏了，破坏了PL的启的启动功能功能v都都发生在生在间隔区唯一的隔区唯一的C/G 对上上46.47.调节蛋白蛋白vcI、cII和和cIIIv野生型的噬箘体感染，其噬菌斑野生型的噬箘体感染，其噬菌斑浑浊而不透明，因而不透明，因为其中包含了一部分溶源未裂解的其中包含了一部分溶源未裂解的细胞胞vcI基因突基因突变的的结果会阻止溶源，因此噬菌斑只含有裂果会阻止溶源，因此噬菌斑只含有裂解的解的细胞，感染胞，感染产生了透亮的噬菌斑（生了透亮的噬菌斑（clear plaque，c），基因），基因cI、cII和和cIII就是由于他就是由于他们所涉及的表所涉及的表型而得名型而得名vcro 蛋白蛋白vcontrol of repressor and other things48.49.各种各种 噬箘体噬箘体突突变型的溶原化型的溶原化频率率菌种菌种溶原化溶原化频率率 +410-1 cIOR2OR3v邻近位点上的近位点上的cI蛋白二聚体由于蛋白二聚体由于缔合作用而合作用而有有协同效同效应vcI蛋白的蛋白的N端片段不具有端片段不具有协同效同效应cI蛋白与操蛋白与操纵基因基因亲和力和力60.cro蛋白的蛋白的结构和功能构和功能v有有66个氨基酸残基个氨基酸残基vcro蛋白与蛋白与cI蛋白无序列同源性，但功能相似：蛋白无序列同源性，但功能相似：v以二聚体形式和操以二聚体形式和操纵基因基因结合合vcro蛋白也能和蛋白也能和OR1、OR2、OR3三个位点三个位点结合合v和和cI蛋白蛋白结合力下降的突合力下降的突变和和cro蛋白的蛋白的结合力也下降合力也下降vcro蛋白与蛋白与3个操个操纵基因基因亲和力：和力：vOR3OR2OR1v没有没有协同效同效应61.cro蛋白与操蛋白与操纵基因的基因的结合合DNA(野生型或突野生型或突变型型)OR3OR2OR1OR+188OR1-18-OR2-8OR1-OR3-8-62.cro和和cI对转录的影响的影响vcro蛋白蛋白对cI基因和基因和cro基因的基因的转录都起都起负控制作用控制作用vcI蛋白蛋白对cro基因的基因的转录起起负控制作用；控制作用；对cI基因本身的基因本身的转录既有正控制又有既有正控制又有负控制控制vcro蛋白和蛋白和cI蛋白相互蛋白相互竞争、相互制争、相互制约，的的调控存在于控存在于这两种蛋白的相互作用中两种蛋白的相互作用中63.64.融合操融合操纵子技子技术v构建融合操构建融合操纵子子质粒粒vlac I的的产物阻遏物阻遏cI的表达的表达v将将质粒粒转化到特定的溶原性化到特定的溶原性E.coli中中v由由l l ORPRM 启启动的的lac Zv培养基中加入培养基中加入诱导物物-IPTGv质粒表达的粒表达的cI蛋白蛋白对由由ORPRM启启动的的lac Z产生影响生影响v测定定-半乳糖苷半乳糖苷酶的活力可以衡量的活力可以衡量这种种影响影响v把把PRM换成成PR，可以研究，可以研究cI蛋白蛋白对PR的影响的影响v把把cI换成成cro，可以研究可以研究cro蛋白蛋白对PRM、PR的影响的影响65.cI和和cro对PRM、PR的影响的影响66.67.68.cI蛋白的自我蛋白的自我调节69.70.3.6.7 cI蛋白的正控制机制蛋白的正控制机制vcI蛋白蛋白N端端helix-turn-helix motif：vN端端92AA，有，有5个个-螺旋，螺旋，-螺旋螺旋3嵌入到嵌入到DNA大沟中，大沟中，-螺旋螺旋2及及-螺旋螺旋2与与-螺旋螺旋3之之间的非螺旋部分与的非螺旋部分与RNA聚聚合合酶结合，促合，促进转录v正控制突正控制突变分析：分析：v正控制缺陷突正控制缺陷突变（positive control mutant，pc）v突突变发生在第生在第2螺旋或是第螺旋或是第2与第与第3螺旋的螺旋的连接区接区vpc突突变的的cI蛋白阻遏蛋白阻遏PR启启动，失去，失去对PRM的激活作用的激活作用71.uInteraction between the l l repressor dimer and DNA.Each l l repressor contains a helix-turn-helix motif.One of helices fits into the major groove of DNA72.73.l l噬菌体的开关噬菌体的开关v溶原化溶原化时，cI蛋白占有蛋白占有OR1、OR2位点，激位点，激活活PRM的的转录而抑制而抑制cro基因的基因的转录，cI蛋白蛋白的平衡的平衡维持溶原化状持溶原化状态v诱导时（紫外或（紫外或丝裂霉素裂霉素C等），宿主菌等），宿主菌recA基因的基因的产物具有蛋白物具有蛋白酶活性，活性，cI蛋白失蛋白失活或分解，平衡被打破，活或分解，平衡被打破，cro基因的基因的转录开开启启v裂解途径早期，裂解途径早期，cro蛋白与蛋白与OR3结合，阻止合，阻止cI基因的表达，基因的表达，转录朝裂解方向朝裂解方向进行行74.