基于转录组测序分析转化生长因子-β1诱导肾纤维化机制.pdf

JOURNAL OF ZHEJIANG UNIVERSITY（MEDICAL SCIENCES）浙 江 大 学 学 报（医 学 版）2023 年 10 月October 2023基于转录组测序分析转化生长因子-1诱导肾纤维化机制李华男1，李佩芬1，李善义1，张雪莹1，董欣茹1，杨明2，沈维干11.扬州大学医学院细胞生物学教研室 江苏省中西医结合老年病防治重点实验室，江苏 扬州 2250092.扬州大学附属医院肾内科，江苏 扬州 225009摘 要 目的:探究转化生长因子-1（TGF-1）诱导肾纤维化的机制。方法:将TGF-1处理和未处理的肾成纤维细胞NRK-49F进行转录组测序，采用DESeq2分析测序结果，以错误发现率低于0.05且log2FC绝对值大于1为标准筛选差异表达的基因，并对差异表达的基因进行基因本体（GO）、京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。进一步筛选差异表达基因中编码转录因子的基因，并利用单侧输尿管梗阻诱导的小鼠肾纤维化模型和高通量基因表达数据库GSE104954数据集对这些基因在肾纤维化过程中的表达进行验证。结果:TGF-1处理6、12和24 h后，分别有552、1209和1028个差异表达基因。GO分析表明，这些差异表达基因在发育、细胞死亡和细胞迁移过程中显著富集。KEGG分析显示，在TGF-1诱导早期（TGF-1处理6 h）主要表现为Hippo、TGF-、Wnt信号通路的变化，而在TGF-1诱导晚期（TGF-1处理24 h）主要表现为细胞外基质受体相互作用、局灶黏附和黏附分子连接等相关通路的改变。在TGF-1处理6 h时291 个上调的差异表达基因中，Snai1、Irf8、Bhlhe40、Junb、Arid5a、Vdr、Lef1、Ahr、Foxo1、Myc、Tcf7、Foxc2、Glis1等13个基因编码转录因子。在细胞模型中验证发现，TGF-1可以诱导其中9个编码转录因子基因（Snai1、Irf8、Bhlhe40、Junb、Arid5a、Vdr、Lef1、Myc、Tcf7）的表达，其余4个基因的表达水平在TGF-1处理后无显著变化。在动物模型验证中发现，Snai1、Irf8、Bhlhe40、Junb、Arid5a、Myc和Tcf7显著上调，而Vdr显著下调，Lef1无显著变化。在GSE104954数据集中验证发现，IRF8在糖尿病肾病患者和IgA肾病患者的肾小管间质中显著高表达，MYC在糖尿病肾病患者中高表达，而其他7个基因的表达产物与对照组相似。结论:TGF-1诱导肾成纤维细胞基因差异表达，Irf8和Myc可能是慢性肾脏病和肾纤维化的潜在靶点。DOI：10.3724/zdxbyxb-2022-0672收稿日期（Received）:2022-11-28 接受日期（Accepted）:2023-08-24 网络预发表日期（Online）:2023-09-28基金项目（Funding）:国家自然科学基金（32100911）；江苏省高等学校自然科学研究项目（20KJB310002）；2019江苏省双创博士项目；2020年扬州市“绿扬金凤计划”第一作者（First author）:李华男，讲师，硕士生导师，主要从事肾纤维化发病机制的研究；E-mail：；https：/orcid.org/0000-0002-1976-2895通信作者（Corresponding author）:沈维干，教授，博士生导师，主要从事肿瘤和肾纤维化发病机制的研究；E-mail：；https：/orcid.org/0000-0001-9978-4551 原 著 Open Access李华男，等.基于转录组测序分析转化生长因子-1诱导肾纤维化机制关键词 转录组；转化生长因子-1；成纤维细胞；肾纤维化；机制；小鼠中图分类号 R34 文献标志码 AMechanism of transforming growth factor-1 induce renal fibrosis based on transcriptome sequencing analysisLI Huanan1,LI Peifen1,LI Shanyi1,ZHANG Xueying1,DONG Xinru1,YANG Ming2,SHEN Weigan1（1.Department of Cell Biology,School of Medicine,Yangzhou University,Jiangsu Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Senile Diseases,Yangzhou 225009,Jiangsu Province,China;2.Department of Nephrology,Affiliated Hospital of Yangzhou University,Yangzhou 225009,Jiangsu Province,China）Corresponding author:SHEN Weigan,E-mail:,https:/orcid.org/0000-0001-9978-4551Abstract Objective:To explore the mechanism of transforming growth factor-1(TGF-1)induce renal fibrosis.Methods:Renal fibroblast NRK-49F cells treated with and without TGF-1 were subjected to RNA-seq analysis.DESeq2 was used for analysis.Differentially expressed genes were screened with the criteria of false discovery rate1.Gene Ontology(GO)and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)pathway enrichment analyses were performed for differentially expressed genes.Genes encoding transcription factors were further screened for differential expression genes.Then,the expression of these genes during renal fibrosis was verified using unilateral ureteral obstruction(UUO)-induced mouse renal fibrosis model and a public gene expression dataset(GSE104954).Results:After TGF-1 treatment for 6,12 and 24 h,552,1209 and 1028 differentially expressed genes were identified,respectively.GO analysis indicated that these genes were significantly enriched in development,cell death,and cell migration.KEGG pathway analysis showed that in the early stage of TGF-1 induction(TGF-1 treatment for 6 h),the changes in Hippo,TGF-and Wnt signaling pathways were observed,while in the late stage of TGF-1 induction(TGF-1 treatment for 24 h),the changes of extracellular matrix-receptor interaction,focal adhesion and adherens junction were mainly enriched.Among the 291 up-regulated differentially expressed genes treated with TGF-1 for 6 h,13 genes(Snai1,Irf8,Bhlhe40,Junb,Arid5a,Vdr,Lef1,Ahr,Foxo1,Myc,Tcf7,Foxc2,Glis1)encoded transcription factors.Validation in a cell model showed that TGF-1 induced expression of 9 transcription factors(encoded by Snai1,Irf8,Bhlhe40,Junb,Arid5a,Vdr,Lef1,Myc,Tcf7),while the expression levels of the other 4 genes did not significantly change after TGF-1 treatment.Validation results in UUO-induced mouse renal fibrosis model showed that Snai1,Irf8,Bhlhe40,Junb,Arid5a,Myc and Tcf7 were up-regulated after UUO,Vdr was down-regulated and there was no significant change in Lef1.Validation based on the GSE104954 dataset showed that IRF8 was significantly overexpressed in the renal tubulointerstitium of patients with diabetic nephropathy or IgA nephropathy,MYC was highly expressed in diabetic nephropathy,and the expressions of the other 7 genes were not significantly different compared with the 595浙江大学学报（医学版）Journal of Zhejiang University（Medical Sciences）control group.Conclusion:TGF-1 induces differentially expressed genes in renal fibroblasts,among which Irf8 and Myc were identified as potential targets of chronic kidney disease and renal fibrosis.Key words Transcriptome;Transforming growth factor-1;Fibroblasts;Renal fibrosis;Mechanism;MiceJ Zhejiang Univ(Med Sci),2023,52(5):594-604.缩略语 细胞外基质（extracellular matrix，ECM）；转化生长因子（transforming growth factor，TGF）；聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）；定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）；信使RNA（messenger RNA，mRNA）；错误发现率（false discovery rate，FDR）；倍数变化（fold change，FC）；基因本体（Gene Ontology，GO）；京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）；单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）；蜗牛家族转录抑制因子（Snail family transcriptional repressor，Snai）；干扰素调节因子（interferon regulatory factor，Irf）；基本螺旋-环-螺旋家族成员e40（basic helix-loop-helix family member e40，Bhlhe40）；富含AT的交互式含域蛋白5A（AT-rich interactive domain 5A，Arid5a）；维生素 D 受体（vitamin D receptor，Vdr）；淋巴增强结合因子（lymphoid enhancer binding factor，Lef）；芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，Ahr）；叉头框-O1（forkhead box O1，FoxO1）；转录因子（transcription factor，Tcf）；叉头框-C2（forkhead box C2，FoxC2）；GLIS家族锌指蛋白（GLIS family zinc finger，Glis）；辅助性T细胞（helper T cell，Th细胞）肾纤维化是许多进行性肾脏疾病的共同表现，其特征是正常组织结构逐渐被ECM（如胶原、蛋白聚糖和糖蛋白）所取代1-2，直接原因是间质成纤维细胞增殖并分化为肌成纤维细胞，导致ECM过度合成3。Kuppe等4通过单细胞转录组测序发现，血小板源生长因子受体阳性且血小板源生长因子受体阳性的成纤维细胞/肌成纤维细胞是人肾纤维化瘢痕形成的主要来源。TGF-1是一种多功能的细胞因子，是促进成纤维细胞分化为促纤维化表型和产生ECM的主要介质5-6。通过多种途径靶向TGF-1可抑制肾纤维化，部分靶向药物已用于临床研究7-9。然而，TGF-1不仅参与纤维化过程，还参与炎症反应、免疫调节等，直接阻断TGF-1信号通路可能带来诸多副作用，限制了其作为一种抗纤维化治疗方法在临床上的应用7-9。因此，了解TGF-1诱导纤维化的机制和TGF-1信号通路下游的效应分子将有助于探索预防和抑制肾纤维化的方法。TGF-1 诱 导 的 正 常 大 鼠 肾 成 纤 维 细 胞NRK-49F是典型的体外肾纤维化细胞模型。Zhou等10采用质谱法对TGF-1处理48 h的NRK-49F细胞和对照细胞的细胞裂解物及条件培养基在蛋白质组水平进行分析。与对照组比较，在NRK-49F细胞的细胞裂解物中鉴定出628种差异表达的蛋白质，在条件培养基中鉴定出62种差异表达的蛋白质。TGF-1调节的细胞裂解物蛋白表现为核糖体蛋白增加，参与多种代谢途径的蛋白质失调，包括醛脱氢酶3家族成员A1减少、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1和肌苷单磷酸脱氢酶2增加；酶联免疫吸附试验结果显示，TGF-1处理组胶原降解调节因子（丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族E成员1增加、基质金属蛋白酶3减少）、胶原交联因子（前胶原-赖氨酸、2-氧葡萄糖酸5-双加氧酶2增加）、信号分子（细胞通信网络因子1、细胞通信网络因子2和Tsukushi增加，细胞通信网络因子3减少）和趋化因子（C-C基序趋化因子配体2、C-C基序趋化因子配体7增加）的分泌异常10。然而，由于转录和翻译的调控作用，基因在转录水平与翻译水平的表达可能存在差异。TGF-1作用于成纤维细胞不同时间后基因596李华男，等.基于转录组测序分析转化生长因子-1诱导肾纤维化机制的表达可能不同，TGF-1仅处理48 h可能会丢失一些早期表达的差异基因；此外，由于基因的表达经历先转录后翻译的过程，蛋白质组比转录组提供的诊断信息晚11。因此，上述研究在寻找TGF-1 信号通路下游的潜在靶点上存在局限性10。本研究使用转录组测序技术检测了TGF-1处理6、12和24 h的NRK-49F细胞转录组，汇总了表达上调和下调的基因、差异表达基因参与的生物过程和信号通路，并采用qRT-PCR在动物模型和数据库慢性肾脏病患者的转录组数据中进行验证，为更好地理解TGF-1诱导的肾纤维化机制以及研发新的诊断和治疗方案提供参考。1材料和方法1.1细胞、动物、试剂和仪器正常大鼠肾成纤维细胞株NRK-49F 购自中国科学院细胞库。8周龄 C57B/L6小鼠（体重约20 g）购自扬州大学比较医学中心，动物在通风、室温为 24 的动物房中饲养，进行 12 h 光照、12 h 黑暗的循环，所有动物均可自由获得食物和水。动物实验方案通过扬州大学医学院伦理委员会审查（YXYLL-2021-05），符合美国国立卫生研究院发布的 实验动物护理和使用指南。DMEM/F12培养基、胎牛血清为赛澳美细胞技术（北京）有限公司产品；青霉素/链霉素为武汉赛维尔生物科技有限公司产品；重组小鼠/大鼠TGF-1为北京义翘神州科技股份有限公司产品；TRIzol试剂为美国Invitrogen公司产品；戊巴比妥钠为北京方程生物科技有限公司产品；HiScript Q RT SuperMix试剂盒和ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品。PCR 仪为德国 Eppendorf 公司产品；ABI 7500实时荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。1.2细胞培养及处理NRK-49F细胞在含10%胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基中，置于37、5%二氧化碳的培养箱中培养。加入终浓度为5 ng/mL的TGF-1处理6、12和24 h后收集细胞，同期收集未经TGF-1处理的对照细胞。1.3转录组测序文库构建及测序转录组测序文库构建及测序由武汉爱基百客生物科技有限公司完成，主要步骤如下：使用TRIzol试剂从细胞中提取总 RNA，并使用 Qsep1仪器评估所有 RNA 样品的完整性；取 3 g 总RNA，采用MGIEasy mRNA文库制备试剂盒构建RNA文库（具体包括使用Oligo-dT磁珠分离polyA富集的mRNA、mRNA片段化、片段化的mRNA逆转录合成cDNA、末端修复、加碱基A并连接测序接头）；文库在Illumina测序平台（Illumina NovaSeq 6000）上使用武汉爱基百客生物科技有限公司的双末端技术进行测序。1.4转录组测序结果的生物信息学分析1.4.1识别差异表达基因通过 Cutadapt 1.11过滤出衔接子和低通量测序片段，然后使用Hisat 2 2.1.0将纯化的测序片段与大鼠参考基因组RN6进行比对12-13。将所有样本的比对信息使用 Stringtie 2.0.4 进行转录本重构。使用 RSEM 1.2.6 评估转录本的丰度，并将表达值标准化为FPKM（每千个碱基的转录本每百万映射读取的片段数）14。差异表达基因用DESeq2进行鉴定，FDR低于0.05且log2FC绝对值大于1的基因作为差异有统计学意义的基因。使用 R 语言中的ggplot2包绘制火山图展示差异表达基因的分布，使用Venn Diagram包绘制维恩图展示TGF-1处理 6、12和 24 h后差异表达的交集基因数，使用pheatmap包对差异表达基因进行层次聚类并绘制热图，展示组间差异和差异基因表达的动态变化。1.4.2差异表达基因的 GO 和 KEGG 通路富集分析使用 R 语言中的 ClusterProfiler 包对差异表达基因分别进行 GO 和 KEGG 通路富集分析15-16。按照FDR低于0.05筛选富集结果。1.5转录因子的筛选根据美国国家生物技术信息中心在线网站（https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的基因信息，在差异表达的基因中筛选编码转录因子的基因。1.6动物模型验证 TGF-1信号通路下游的转录因子C57B/L6小鼠在造模前禁食8 h，腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉小鼠，无菌条件下剪开小鼠皮肤及肌层至腹膜后，通过中线切口暴露并游离左侧输尿管，并用4-0丝线在肾盂下方5 mm处结扎两次，建立UUO诱导的肾纤维化小鼠。手术对照组以类似方式处理，但不结扎输尿管。造模7 d后收取小鼠肾组织，去包膜，使用TRIzol试剂提取总RNA。597浙江大学学报（医学版）Journal of Zhejiang University（Medical Sciences）1.7通过数据集 GSE104954 验证 TGF-1 信号通路下游的转录因子为了进一步证实肾纤维化的潜在靶点，从高通量基因表达数据库中筛选GSE104954数据集，并在数据集中选择健康对照（活体捐献者）、糖尿病肾病患者和IgA肾病患者数据，使用GEO2R工具筛选上述数据集中糖尿病肾病患者和IgA肾病患者肾组织标本分别相对于健康对照肾组织标本间的差异表达基因，筛选条件为FDR低于0.05和 log2FC绝对值大于1。使用 Prism Graph 8.0软件绘制相关转录因子的表达图谱。1.8qRT-PCR检测相关基因的表达使用HiScript Q RT SuperMix试剂盒将1 g总 RNA 进行逆转录，合成 cDNA。使用 ChamQ SYBR qPCR Master Mix 试剂盒进行定量 PCR 检测。实验中所使用的引物见表1。PCR 条件：95 30 s，95 10 s，60 30 s，进行 40 次扩增。使用ABI 7500 实时荧光定量 PCR 仪进行定量PCR检测，每个基因的表达量表示为-actin的倍数，每组进行三次独立重复实验。1.9统计学方法采用Prism Graph 8.0软件进行统计分析。计量数据以均数标准差（x s）表示，两组样本之间比较采用双侧 Students t 检验，P0.05为差异有统计学意义。2结 果2.1TGF-1 诱导的体外纤维化模型构建成功qRT-PCR结果显示，纤维化相关基因 Acta2、Col1a1和 Col3a1的表达在 TGF-1处理后显著上调（图1），提示TGF-1诱导的体外纤维化细胞模型构建成功。2.2TGF-1诱导的差异表达基因高通量转录组测序结果显示，与对照组比较，TGF-1处理6 h时有552个基因差异表达，其中 291 个基因表达上调，261 个基因表达下调；TGF-1处理12 h时有1209个基因差异表达，其中 363 个基因表达上调，846 个基因表达下调；TGF-1处理24 h时有1028个基因差异表达，其中342个基因表达上调，686个基因表达下调（图2）。将三个时间点的差异表达基因取交集，共有207个基因在 TGF-1 处理 6、12 和 24 h时均差异表达，其中89个基因在三个时间点均上调，110个基因在三个时间点均下调（图3）。聚类分析显示两表1定量逆转录聚合酶链反应中所使用的引物Table 1Primers used in the experiment基 因Snai1Irf8Bhlhe40JunbArid5aVdrLef1AhrFoxO1MycTcf7FoxC2Glis1上游引物（5-3）CCACTCGGATGTGAAGAGATACTGGACATTTCCGAGCCATACCTCCTACCCGAACATCTCAAACCCTTTCTATCACGACGACTCATACGTTGGGACCACCTGGTAAAGCTGAACGGAGAGGATTCTGATGGAGAAAGGAACAGGAGCCTAAACAGTGTAGAGCACAAGTCAGAGCGCCAAACACCAGTCTAAATTCAGCTTCGCTAACAGGAACTATGCTCGGACAAACTTCCAGAGTCGGACGTGCCCAAGGATAAGGTCTGTGAGAGACTGCTTCATT下游引物（5-3）AGACTCTTGGTGTTTGTGGAGTCAGCTCCTCGATCTCTGAATCTGCTGCTGCTGATCAATTACTAAGGTGGGTTTCAGGAGTTTGCTTTGGGCTTGGGATAGAAGGATGCTGTAACTGACAAGGTCTACGACATTCGCCCTCATTGGATAGTGGAAGACGCATAGAAGCTGTCCTGAAGTGTCTGCATAGCTGCTGTTGCTGGTGATAGAGAGCAGATTGAAGGCAGAGTAGGCTCTTGACCACCACTTTCTGGTAGGGCTTCTTGCTTGATSnai：蜗牛家族转录抑制因子；Irf：干扰素调节因子；Bhlhe40：基本螺旋-环-螺旋家族成员e40；Arid5a：富含AT的交互式含域蛋白5A；Vdr：维生素D受体；Lef：淋巴增强结合因子；Ahr：芳香烃受体；FoxO1：叉头框-O1；Tcf：转录因子；FoxC2：叉头框-C2；Glis：GLIS家族锌指蛋白.TGF-1TGF-1TGF-101234Acta2 mRNA*6 h*12 h*24 h6 h12 h24 h0.00.51.01.5Col1a1 mRNA*6 h12 h24 h0.00.51.01.52.0Col3a1 mRNA*与对照组比较，*P0.05，*P0.01.TGF：转化生长因子；ACTA：-平滑肌肌动蛋白；COL1A1：型胶原1；COL3A1：型胶原1.图1TGF-1处理组与对照组肾纤维化相关基因的mRNA表达Figure 1The mRNA expression of renal fibrosis-related genes in TGF-1 treated group and the control group598李华男，等.基于转录组测序分析转化生长因子-1诱导肾纤维化机制个主要分支，即对照组和TGF-1处理组（图4）。以上结果表明，TGF-1处理后成纤维细胞中的基因表达出现变化，且与TGF-1诱导的时间相关。2.3差异表达基因 GO分析和KEGG分析结果GO 分析结果显示，前二十个富集条目集中在生物过程上。其中，TGF-1处理6和12 h差异表达的基因主要富集在 组 织 发 育（tissue development）和 小 管 发 育（tube development），而 TGF-1 处理 24 h 差异表达的基因主要富集在细胞迁移的调控（regulation of cell migration）。细胞死亡的调控（regulation of cell death）、细胞凋亡的调控（regulation of apoptotic process）和程序性细胞死亡的调控（regulation of programmed cell death）仅出现在TGF-1处理6 h差异表达的基因中，而细胞对细胞因子刺激的反应（cellular response to cytokine stimulus）、对含氧化 合 物 的 反 应（response to oxygen-containing compound）和 对 细 胞 因 子 的 反 应（response to cytokine）仅出现在TGF-1处理24 h差异表达的基因，见图5。结果提示，TGF-1作用后，成纤维细胞中与差异表达基因相关的分子过程和生物途径发生改变，且与TGF-1诱导的时间相关。KEGG富集分析结果显示，在TGF-1诱导早6 h24 h207335439209895784712 h6 h24 h7815547149208913512 h6 h24 h90374502411024930312 hTGF：转化生长因子.图3TGF-1处理6、12、24 h后表达变化基因的维恩图Figure 3Venn diagram of differentially expressed genes after TGF-1 treated for 6，12，24 hABC40200log10 FDR2.50.02.5log2 FC 291 261 11 3767550100250log10 FDR2.55.00.02.55.07.5log2 FC 363 846 10 598604080200log10 FDR2.55.00.02.55.0log2 FC 342 686 10 731A：TGF-1处理6 h后差异表达基因；B：TGF-1处理12 h后差异表达基因；C：TGF-1处理24 h后差异表达基因.红色表示上调基因，绿色表示下调基因，蓝色表示使用标准log2 FC绝对值大于1无法区分上调和下调的基因.FDR：错误发现率；FC：倍数变化；TGF：转化生长因子.图2TGF-1处理6、12、24 h后表达变化基因的火山图Figure 2Volcano plot for the differentially expressed genes after TGF-1 treated for 6，12，24 h6 h6 h24 h24 h1220112 h12 hTGF-1TGF：转化生长因子.图4TGF-1处理组与对照组基因表达分层聚类和热图Figure 4Hierarchical clustering and heatmap showing the genes expression in TGF-1 treated group and the control group 599浙江大学学报（医学版）Journal of Zhejiang University（Medical Sciences）期（TGF-1 处理 6 h）主要表现为Hippo、TGF-、Wnt 信号通路的变化，而在TGF-1诱导晚期（TGF-1处理24 h）主要表现为ECM受体相互作用、局灶黏附和黏附分子连接等相关通路的改变，见图 6。结果提示，TGF-1作用后，成纤维细胞中差异表达基因参与的信号通路发生改变，且与 TGF-1 诱导的时间相关。2.4肾间质成纤维细胞中TGF-1信号通路下游的转录因子对TGF-1处理6 h时差异表达基因中编码转录因子的基因进行筛选发现，影响上述生物过程和信号通路的基因主要集中在上调的基因中。在TGF-1处理6 h时291个上调的差异表达基因中，Snai1、Irf8、Bhlhe40、Junb、Arid5a、Vdr、Lef1、Ahr、Foxo1、Myc、Tcf7、Foxc2、Glis1这13个基因可以编码转录因子，其中部分转录因子在TGF-1处理12、24 h 时较对照组也上调（图 7）。qRT-PCR验证发现，在细胞模型中，TGF-1可以诱导其中9个编码转录因 子 基 因（Snai1、Irf8、Bhlhe40、Junb、Arid5a、Vdr、Lef1、Myc、Tcf7）的表达（图8），其余4个基因的表达水平在TGF-1处理后没有显著变化。在动物肾纤维化模型中，上述9个编码 转 录 因 子 基 因 中 Snai1、Irf8、Bhlhe40、Junb、Arid5a、Myc 和 Tcf7 这7 个编码转录因子基因显著上调，而 Vdr 显著下调，Lef1 没有变化，见图9。数据集GSE104954验证结果显示，IRF8在糖尿病肾病患者（1.1490.119）和 IgA 肾 病 患 者（1.0770.098）的肾小管间质中相比健康对照（1.0000.093）显著高表达（均P0.01），MYC 在 糖 尿 病 肾 病 患 者（1.1000.075）中 相 比 健 康 对 照（1.0000.088）高表达（P0.01），而P5.0e71.0e61.5e62.0e6MAPK2505075100ABP1.0e102.0e103.0e104.0e10500100150200CP5.0e81.0e71.5e72.0e7500100150200A：TGF-1 处理 6 h 与同一时间对照组差异表达基因富集的前 20 条通路；B：TGF-1处理12 h与同一时间对照组差异表达基因的前20条通路；C：TGF-1处理24 h与同一时间对照组差异表达基因的前20条通路.TGF：转化生长因子；GO：基因本体.*表示分子功能，其余为生物过程.图5差异表达基因的GO分析结果Figure 5Results of GO analysis of differentially expressed genes600李华男，等.基于转录组测序分析转化生长因子-1诱导肾纤维化机制其他7个基因的表达产物与对照组比较差异无统计学意义。以上结果提示，Irf8和 Myc可能是肾纤维化的潜在干预靶点。3讨 论肾纤维化是糖尿病、高血压、免疫复合物沉积等引发的慢性肾脏病的共同病理特征，表现为ECM合成与降解的失调1-2。TGF-1等细胞因子诱导间质成纤维细胞增殖并分化为肌成纤维细胞，导致ECM过度合成，是肾纤维化发生的直接原因3。深入了解TGF-1诱导纤维化的机制和TGF-1信号通路下游的效应分子将有助于探索预防和抑制肾纤维化的方法。相比蛋白质组，转录组的变化更为提前，因此可以为诊断提供更早期的信息。本研究采用转录组测序技术检测了TGF-1处理6、12和24 h后NRK-49F细胞和对照细胞的基因表达谱，对差异表达的基因进行了全面分析，为进一步了解TGF-1诱导肾纤维化的机制提供了信息。本文资料显示，TGF-1处理6、12和24 h后，分别有 552、1209 和 1028 个差异表达基因。GO分析表明，这些差异表达基因在发育、细胞死亡和细胞迁移过程中显著富集，而Zhou等10的蛋白质组研究显示差异表达蛋白主要富集在翻译、氧化还原过程、对药物的反应等生物过程，进一步证明了TGF-1处理的成纤维细胞在转录和翻译水平的差异。KEGG分析显示，在TGF-1诱导的早期主要表现为 Hippo、TGF-、Wnt信号通路的变化，与之前的研究报道 TGF-信号通路与2.212.111.821.511.472.081.361.491.431.061.151.111.022.513.291.751.891.972.271.330.000.001.141.290.000.002.153.092.061.451.770.001.360.000.001.181.660.000.00JunbMyc6 h24 h12 h8e40AT5AD1-O17-C2GLIS1数值表示为log2FC值.FC：倍数变化.图7热图显示13个转录因子的表达Figure 7The heat map shows the expression changes of 13 transcription factorsTNFWntTGF-Hippo0.0500.1000.1501020301.00.80.60.40.20.0PAPI3K-AktEstrogenWntRNAHippo0.120.080.160.200.2420304050601.00.80.60.40.20.0PBHippoRelaxinRNAApelinPI3K-AktTNF0.0750.1250.1750.22520103040501.00.80.60.40.20.0PCA：TGF-1处理6 h与同一时间对照组相比上调基因富集的前20条通路；B：TGF-1处理12 h与同一时间对照组相比上调基因富集的前20条通路；C：TGF-1处理24 h与同一时间对照组相比上调基因富集的前 20 条通路.TGF：转化生长因子；TNF：肿瘤坏死因子；PI3K：磷酸肌醇3-激酶；KEGG：京都基因和基因组百科全书.图6差异表达基因的KEGG分析结果Figure 6Results of the KEGG analysis of diff