基于小鼠肝癌细胞系的卤代咔唑的芳香烃受体激活能力测定与比较.pdf

D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 1-5 3 3 7.2 0 2 3.4.1 0 7*收稿日期:2 0 2 2-0 5-0 5基金项目:国家自然科学基金(2 2 0 0 6 0 4 9).通信作者:张望龙,男,1 9 9 0-,博士,副教授;研究方向:环境化学、毒理学;E-m a i l:z h a n g w a n g l o n g q f n u.e d u.c n.基于小鼠肝癌细胞系的卤代咔唑的芳香烃受体激活能力测定与比较*张望龙,薛振宏,李腾洲,张丽雯,武佳润(曲阜师范大学生命科学学院,2 7 3 1 6 5,山东省曲阜市)摘要:选取多种卤代咔唑,以小鼠肝癌细胞系为测试体系,应用基于瞬时转染的荧光素酶报告基因方法对其AHR激活效力进行比较.发现其在1M浓度下的激活效力排序为:2 3 6 7 C C Z1 3 6 B C Z2 7 B C Z1 3 6 8 B C Z其他,同系物/不同卤素取代之间具有明显差异.因此,基于瞬时转染的报告基因方法可以有效开展类二噁英化合物的毒性评估,且提示可以通过变换转染细胞系开展其他物种特异性的毒性评估.关键词:卤代咔唑;芳香烃受体;信号通路;配体中图分类号:Q 8 9 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 1-5 3 3 7(2 0 2 3)0 4-0 1 0 7-0 60 引 言卤代 咔 唑(p o l y h a l o g e n a t e dc a r b a z o l e s,P HC-Z s)是由自然(如森林火灾、火山爆发)或工业过程(如电子设备、染料和制药工业)产生的一系列卤素取代的咔唑同系物1,在全球各地的多种环境介质中都有发现2,3,且作为一种新型的环境污染物逐渐受到关注.基于斑马鱼的毒理学研究表明,同系物2 7-B C Z和2 3 6 7-C C Z可诱导卵黄囊肿胀、心脏拉长及心包囊水肿4.这些毒性效应类似于典型二噁英同系物2,3,7,8-T C D D(后文简称T C D D)引起的心 脏 毒 性 效 应,且 与 激 活 细 胞 内 芳 香 烃 受 体AHR具有明显关联4.此外与T C D D相似,许多P HC Z s具有明显的诱导C Y P 1 A 1和1 B 1效力.虚拟分子对接结果也表明,某些P HC Z s可以利用类似T C D D的构象结合于AHR的配体结合域,再次印证了P HC Z s是潜在的AHR的配体并通过AHR发挥作用的观点1.而对于其通过受体-配体结合并激活AHR的效力、毒性评估的研究较少,且对于不同物种的效力差异需要进一步探究.AHR属于(b HLH-P A S)转录因子家族,大量研究报道了其介导环境污染物的毒性效应,主要包括:多氯二苯并对二噁英和多氯二苯并呋喃(P C-D D/F s)以及许多其他卤代芳烃(HAH s).AHR是一个配体依赖的核受体,当未结合配体时,它保持非活性形式并通过与伴侣蛋白(包括H S P 9 0、p 2 3和X A P 2(也称为A r a 9和A I P)结合而免受降解.此时,AHR的某些功能序列和界面(如核定位序列(N L S)和A R NT二聚化界面)被阻断,从而确保AHR定位在细胞质中.一旦与激动剂配体结合,AHR随后发生变构,并转位到细胞核,与A R NT二聚化,并以高亲和力结合特定的D NA识别位点5-G C G T G-3(称为二噁英响应元件d i o x i n-r e s p o n s ee l e m e n t(D R E).然后,调控下游基因表达及功能,通常表现为毒性效应5.为了研究化合物/污染物对AHR的激活效能,也即潜在的毒性效力,当前一种广泛应用的特异、灵敏的测定方法是基于荧光素酶的报告基因法.其主要机理为:利用二噁英及类似物可以结合并激活AHR的特点,使AHR被激活后结合细胞中人工合成的D R E序列并引导一个人工构建的荧光素酶报告基因的表达.其表达丰度与化合物激活能力和化合物浓度呈现一定的剂量依赖关系.因此,可以通过检测细胞中荧光素酶的表达,从而反映出外界化合物激活AHR的效力6-9.当前已有将这种方法应用于特定类二噁英化合物的毒性评估,例如应用荧 第4 9卷 第4期2 0 2 3年1 0月 曲阜师范大学学报J o u r n a l o f Q u f u N o r m a l U n i v e r s i t y V o l.4 9 N o.4O c t.2 0 2 3 光素酶报告基因方法研究多氯代二苯硫醚P C D P S s系列化合物的毒性,发现同系物之间的毒性差异以及物种间差异1 0.基于这一方法的优越性,本研究应用瞬时转染小鼠肝癌细胞的荧光素酶报告基因方法测定一系列P HC Z s(见图1)对AHR的激活效力,并与已报道的相关结果进行相互对比、印证,为评估P HC Z s对AHR的激活效力/毒性风险提供数据支撑,同时也将为瞬时转染法应用于其他物种的肝脏细胞系,并开展跨物种的毒性评估、测试同一化合物毒性的物种间差异性提供方法参考.1 材料与方法1.1 试剂DMEM培养基(G i b c o)、D P B S(美仑生物)、胰酶(美仑生物)、胎牛血清(生工生物)、青霉素/链霉素(美仑生物)、Y-2 0转染试剂(武汉优试生物)、DM S O(S i g m a)、H e p a 1 c 1 c 7细 胞 株(通 派 生 物)、AHR报告基因质粒(中国科学院生态环境研究中心 赵斌研究员惠赠)1 1、O p t i-MEM培养基(G i b-c o)、荧光素酶报告基因试剂盒(上海碧云天生物)、卤代咔唑标准品(W e l l i n g t o n公司)结构式见图1.图1 本研究所测定卤代咔唑结构式1.2 细胞培养小鼠肝癌细胞H e p a 1 c 1 c 7培养 于3 7、5%C O2的条件下,细胞生长至7 0%以上密度后进行传代,简要方法如下:去除旧培养基后使用D P B S清洗,随后加1m L胰酶放至培养箱内消化3m i n,消化后加入5m L完全培养基终止消化,吹打后将细胞悬液转移至5 0 m L离心管中,1 0 0 0r/m i n离心5m i n.离心去除上清液后使用完全培养基重悬浮,按13进行传代.1.3 铺板、转染及化合物暴露将生长状况良好(密度达到7 0%以上)的小鼠肝癌细胞H e p a 1 c 1 c 7消化并进行浓度测定,稀释并按照1 00 0 0细胞/孔接种进入9 6孔板,2 4h后进行转染操作.简要方法如下:利用O p t i-MEM减血清培养基稀释0.4LY-2 0转染试剂至5L,在室温下静置5m i n;利用O p t i-MEM减血清培养基稀释5 0n gAHR报告基因质粒至5L,在室温下静置5m i n;将两稀释液轻轻混合室温下孵育2 0m i n后,按照每孔1 0L进行转染,转染后加入一系列浓度梯度 的 卤 代 咔 唑 化 合 物 进 行 暴 露(浓 度 范 围 见图2),各浓度做3个重复.801 曲阜师范大学学报(自然科学版)2 0 2 3年图2 各卤代咔唑单体剂量-效应曲线1.4 荧光素酶报告基因检测暴露3 6h后进行荧光素酶报告基因检测.简要方法如下:自培养箱取出细胞后,吸弃培养基,每孔加入1 0 0L磷酸盐缓冲液清洗后吸弃;随后,每孔加入5 0L裂解液,震荡1 0m i n;使用B i o t e kH 1多功能酶标仪检测荧光值,反应体系为每孔注入5 0L荧光素酶底物.1.5 数据处理数据统计使用G r a p h P a d7.0,首先将化合物浓度数据使用l o g 1 0进行转换,将处理组荧光值除以DM S O对照进行标准化,随后将转换后的浓度值与标准化后的荧光值采用非线性剂量-效应关系方程进行拟合,并得出半数效应浓度值E C 5 0,拟合方程如 下:Y=B o t t o m+(T o p-B o t t o m)/1+1 0(L o gE C 5 0-X)H i l l S l o p e ,组间差异使用单因素方差分析,*P2 3 6 7 C C Z1 3 6 B C Z2 7 B C Z1 3 6 8 B C Z1 3 6 8 C C Z3 6 B C Z1 B 3 6 C C Z其他.图4 1M浓度下化合物诱导倍数2.3 基于E C 5 0的AHR激活效力对比为了对比不同化合物的激活效力,针对可以获得较好剂量-效应曲线的化合物,对其E C 5 0的大小进行对比也是评估卤代咔唑类化合物激活效力及毒性风险 的 重 要 依 据 和 方 法.通 过 非 线 性 拟 合 结 果(表1),E C 5 0越小,激活效力强,因此其依据E C 5 0得出其激活效力趋势为:T C D D 2 3 6 7 C C Z 1 3 6 8 B C Z1 3 6 8 C C Z 1 3 6 B C Z2 7 B C Z1 B 3 6 C C Z其他.总体趋势与2.2中趋势类似.当前基于E C 5 0对比化合物的AH R激活效力比较是常规方法,而部分化合物不足以拟合获得较完整的剂量-效应曲线,且部分剂量-效应曲线需进行专家判断并进行拟合参数的约束,可能使最终E C 5 0值的计算产生一定偏差.因此也有文献报道使用E C 1 0,或者E C 2 0进行计算.而对于本研究中检测的一系列卤代咔唑类化合物,其绝大多数为激活剂或弱激活剂,因此在初步筛查中看到,1M浓度下绝大多数卤代咔唑类化合物都可以产生较明显的诱导效应.因此提示在研究其他相关化合物时,可以采用单点初步筛选的方式以减少工作量,得出相应的激活效力排序.此外也应注意,基于E C 5 0的排序与1M浓度下激活效力的排序并不完全一致,E C 5 0排序靠后的化合物也可能在1M浓度下的激活诱导效力更高,因此基于某一特定浓度对比一系列化合物的激活效力,在毒性评估中也具有参考价值.011 曲阜师范大学学报(自然科学版)2 0 2 3年表1 各卤代咔唑类化合物的半数效应浓度E C 5 0化合物本研究E C 5 0文献报道E C 5 01T C D D9.8 91 0-1 22.5 01 0-1 12 3 6 7 C C Z1.3 11 0-73.4 01 0-91 3 6 8 B C Z7.0 31 0-73.7 01 0-61 3 6 8 C C Z1.7 01 0-65.9 01 0-71 3 6 B C Z2.3 61 0-65.3 01 0-72 7 B C Z3.0 71 0-69.3 01 0-81 B 3 6 C C Z5.7 31 0-61.6 51 0-63 C C Z未有效拟合未对比3 B C Z未有效拟合未对比3 6 C C Z未有效拟合未对比3 6 B C Z未有效拟合未对比1 8 B 3 6 C C Z未有效拟合未对比2.4 不同卤素取代的激活效应差异通过对比本研究中同一取代位点的不同卤代咔唑同系物发现,不同卤素取代相同位点所形成的化合物的激活效力具有明显差异,该结果也与D a n等1所 报 道 趋 势 相 符,例 如 通 过E C 5 0对 比:1 3 6 8 C C Z与1 8 B 3 6 C C Z,1 3 6 B C Z和1 B 3 6 C C Z.此外通过最大诱导倍数图4,也发现类似现象.因此,在化学品、环境污染物评估中需要关注,即使结构相似,其生物学效力也存在较大差异.3 结 论本研究针对一类新型卤代咔唑类环境污染物,应用灵敏的基于瞬时转染AHR报告基因的方式在小鼠肝癌细胞系进行了其AHR激活效力的测定(潜在的毒性效力).通过测定一系列浓度梯度的参照物T C D D及卤代咔唑,以“1M诱导倍数”和E C 5 0两种方式对1 1种同系物进行了对比和排序,发现了较强激活能力及弱激活能力的同系物.显示了两种对比排序方法的各自的优势,即“1M诱导倍数”方法简便,可用于初步筛查探索激活剂或弱激活剂;而E C 5 0方法可以显示不同浓度下的效应趋势,但也应注意两种方法下的排序结果并不完全一致,需要进行专家判断来识别潜在风险,以降低高估和低估其激活效力(毒性效力)的可能性.此外也发现同一位点不同卤素取代产物的效应差异,值得在未来研究中进行针对性的分析.因此,本研究显示了基于瞬时转染报告基因载体进入小鼠肝脏细胞系进行化合物毒性评估的可行性,同时也提示可以通过将报告基因载体瞬时转入不同物种的肝脏细胞系,进行跨物种的化合物毒性评估,但在未来研究中所用报告基因载体在物种间适配能力需要进一步评估和优化.参考文献:1MAD,X I EH Q,Z HAN G WL,e t a l.A r y l h y d r o c a r b o nr e c e p t o ra c t i v i t yo fp o l y h a l o g e n a t e dc a r b a z o l e sa n dt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mJ.S c iT o t a lE n v i r o n,2 0 1 9,6 8 7:5 1 6-5 2 6.2WAN GG W,J I AN G T M,L IS,e ta l.O c c u r r e n c ea n de x p o s u r er i s ke v a l u a t i o no fp o l y h a l o g e n a t e dc a r b a z o l e s(P HC Z s)i nd r i n k i n g w a t e rJ.S c iT o t a lE n v i r o n,2 0 2 1,7 5 0:1 4 1 6 1 5.3WUY,T AN HL,S UT T ONR,e t a l.F r o ms e d i m e n t t ot o pp r e d a t o r s:b r o a de x p o s u r eo fp o l y h a l o g e n a t e dc a r-b a z o l e s i nS a nF r a n c i s c oB a y(U S A)J.E n v i r o nS c iT e c h n o l,2 0 1 7,5 1(4):2 0 3 8-2 0 4 6.4F AN G M L,GUOJH,CHE N D,e ta l.H a l o g e n a t e dc a r b a z o l e s i n d u c ec a r d i o t o x i c i t yi nd e v e l o p i n gz e b r a f i s h(D a n i or e r i o)e m b r y o sJ.E n v i r o n T o x i c o lC h e m,2 0 1 6,3 5(1 0):2 5 2 3-2 5 2 9.5Z HANG W L,X I EH Q,L IY,e t a l.T h ea r y l h y d r o c a r-b o nr e c e p t o r:Ap r e d o m i n a n tm e d i a t o r f o r t h e t o x i c i t yo fe m e r g i n gd i o x i n-l i k ec o m p o u n d sJ.J H a z a r d M a t e r,2 0 2 2,4 2 6:1 2 8 0 8 4.6马慧,宋博宇,张嵩岩,等.基于荧光素酶报告基因的二英类生物检测法的发展与应用J.中国科学:化学,2 0 1 8,4 8(1 0):1 0.7A R T SJM MJG,D E N I S ON MS,D EHAANLH J,e ta l.A hr e c e p t o r m e d i a t e d l u c i f e r a s ee x p r e s s i o n:at o o l f o rm o n i t o r i n g d i o x i n l i k e t o x i c i t yJ.O r g a n o h a l o g e nC o m d,1 9 9 3,1 3:3 6 1-3 6 4.8G I Z Z IG,HOOG E N B OOM LAP,VON HO L S TC,e ta l.D e t e r m i n a t i o no fd i o x i n s(P C D D s/P C D F s)a n dP C B si nf o o da n df e e du s i n gt h eD RC A L UX b i o a s s a y:R e-s u l t so f a n i n t e r n a t i o n a l v a l i d a t i o ns t u d yJ.F o o dA d d i tC o n t a m,2 0 0 5,2 2(5):4 7 2-4 8 1.9P O S T L I N D H,VUTP,TUK E YR H,e ta l.R e s p o n s eo fh u m a nC Y P 1-l u c i f e r a s ep l a s m i d st o2,3,7,8-t e t r a-c h l o r o d i b e n z o-p-d i o x i na n dp o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o-c a r b o n sJ.T o x i c o lA p p lP h a r m,1 9 9 3,1 1 8(2):2 5 5-2 6 2.111第4期 张望龙,等:基于小鼠肝癌细胞系的卤代咔唑的芳香烃受体激活能力测定与比较 1 0Z HAN GR,Z HAN GX W,Z HAN GJJ,e ta l.A c t i v a-t i o no fa v i a na r y lh y d r o c a r b o nr e c e p t o ra n di n t e r-s p e-c i e ss e n s i t i v i t yv a r i a t i o n sb yp o l y c h l o r i n a t e dd i p h e n y l-s u l f i d e sJ.E n v i r o nS c iT e c h n o l,2 0 1 4,4 8(1 8):1 0 9 4 8-1 0 9 5 6.1 1Z HAN GSY,L ISZ,Z HOUZG,e ta l.D e v e l o p m e n ta n da p p l i c a t i o no fan o v e lb i o a s s a ys y s t e mf o rd i o x i nd e t e r m i n a t i o na n da r y lh y d r o c a r b o nr e c e p t o ra c t i v a t i o ne v a l u a t i o ni n a m b i e n t-a i rs a m p l e sJ.E n v i r o n S c iT e c h n o l,2 0 1 8,5 2(5):2 9 2 6-2 9 3 3.T h e c o m p a r i s o no fa r y lh y d r o c a r b o nr e c e p t o ra c t i v a t i o na b i l i t yo fp o l y h a l o g e n a t e dc a r b a z o l e sb a s e do nm o u s eh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m ac e l l l i n eZHANG W a n g l o n g,XU EZ h e n h o n g,L IT e n g z h o u,ZHANGL i w e n,WUJ i a r u n(S c h o o l o fL i f eS c i e n c e s,Q u f uN o r m a lU n i v e r s i t y,2 7 3 1 6 5,Q u f u,S h a n d o n g,P R C)A b s t r a c t:I n t h i s s t u d y,av a r i e t yo f p o l y h a l o g e n a t e dc a r b a z o l e sw e r e s e l e c t e d,a n d t h e i rAHRa c t i v a t i o np o t e n t i a lw a se v a l u a t e db yt r a n s i e n tt r a n s f e c t i o n-b a s e dl u c i f e r a s er e p o r t e rg e n ea s s a yi nm o u s eh e p a t o m ac e l l s.I tw a s f o u n dt h a t t h eo r d e ro fa c t i v a t i o na t1Mc o n c e n t r a t i o nw a s2 3 6 7 C C Z1 3 6 B C Z2 7 B C Z1 3 6 8 B C Zo t h e r s,a n dt h e r ew e r ed i f f e r e n c e sa m o n gc o n g e n e r s/d i f f e r e n th a l o g e ns u b s t i t u t i o n s.I ns u mm a-r y,t h et r a n s i e n tt r a n s f e c t i o n-b a s e dr e p o r t e rg e n ea s s a yc a ne f f e c t i v e l ye v a l u a t et h ep o t e n c y/t o x i c i t yo fd i o x i n-l i k ec o m p o u n d s,a n d i ta l s os u g g e s t st h a t,b yu s i n gc e l l l i n e sf r o mo t h e rs p e c i e s,p e r f o r m i n gas p e-c i e s-s p e c i f i c t o x i c i t ye v a l u a t i o nc o u l db ea v a i l a b l e.K e yw o r d s:p o l y h a l o g e n a t e dc a r b a z o l e s;a r y lh y d r o c a r b o nr e c e p t o r;s i g n a l i n gp a t h w a y;l i g a n d(上接第1 0 6页)F a g o p y r u md i b o t r y s(D.D o n)H a r a,an a t i o n a l s e c o n d-c l a s sk e yp r o t e c t i o nw i l dp l a n t i nC h i n a,b e i n gf i r s t r e c o r d e df r o mS h a n d o n gL ENGZ h e n n i n g,B I NG M e n g y a o,T ANG M e n g y a n g,L IW e n q i a n,HO UY u a n m i a n,HO UY u a n t o n g(S c h o o l o fL i f eS c i e n c e s,Q u f uN o r m a lU n i v e r s i t y,2 7 3 1 6 5,Q u f u,S h a n d o n g,P R C)A b s t r a c t:F a g o p y r u m d i b o t r y s,an a t i o n a ls e c o n d-c l a s sk e yp r o t e c t i o nw i l dp l a n ti nC h i n a,h a sb e e nd i s c o v e r e df r o mS h a n d o n gf o rt h ef i r s t t i m e.T h e i d e n t i f i c a t i o nc h a r a c t e r i s t i c sa r ed e s c r i b e di nd e t a i l,a n dt h ed i s t r i b u t i o nr e a s o n,a p p l i c a t i o nv a l u e sa n ds u r v i v a l s t a t u sa r e f u r t h e rd i s c u s s e d i nt h i sp a p e r.K e yw o r d s:F a g o p y r u md i b o t r y s;n a t i o n a l s e c o n d-c l a s sk e yp r o t e c t i o nw i l dp l a n t;n e wg e o g r a p h i c a l d i s-t r i b u t i o n;S h a n d o n g211 曲阜师范大学学报(自然科学版)2 0 2 3年