基于正交试验设计的大黄甘草洗液提取工艺研究.pdf

44中国处方药 第 21 卷 第 9 期实验研究特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）的中医病名为“四弯风”。该病是一种慢性、复发性、炎症性皮肤病，涉及婴儿、儿童、成人和老人，瘙痒剧烈，严重影响患者的生活质量，且多数患者需要长期治疗1。外用制剂是治疗特应性皮炎主要手段。以西医为例，外用的糖皮质激素类为临床一线药物。然而据研究显示：我国 25%的 AD 患儿父母担心激素不良反应而拒绝外用；皮损改善后，79.4%的 AD 患儿父母停止外用激素2。近年来，由于外用中成药没有激素长期应用的不良反应，因此受到更多的患者及业内同行认可。大黄甘草配伍始于张仲景的 金匮要略。本研究中大黄甘草洗剂是在延续大黄甘草经典配伍下加减野菊花、马齿苋、地骨皮、艾叶、制何首乌等多种药材，具有清热解毒，除湿止痒，养血润肤的功效。经过临床应用证实，大黄甘草洗液对四弯风等皮肤疾病疗效显著，能明显消退、缓解局部红丘疹，肥厚，脱屑，少量渗出等皮肤表现，改善患者生活质量，一期好转率达 97%。本研究采用正交试验设计，以蒙花苷含量为工艺评价指标，优选药材浸泡时间、加水倍量、提取时间及提取次数进行考察。为大黄甘草洗液进行工业量产摸索出可靠工艺。1 仪器与试药1.1 仪器CT-C-IA 热风循环烘箱（常州博立干燥制粒设备有限公司），中药多功能提取浓缩机组（衡阳市金一帆制药设备实业有限公司），QG-200 可倾式夹层锅（衡阳市金一帆制药设备实业有限公司），GZ-6 外用液体灌装机（天津三基于正交试验设计的大黄甘草洗液提取工艺研究何娟1，曹富宁1，谢宁1，夏循明1，张颖2，韦韡2，宋志钊2（1 南宁市中医医院药学部，南宁 530001；2 广西壮族自治区中医药研究院，南宁 530022）【摘要】目的 对大黄甘草洗液的提取工艺进行优化，为中试放大生产提供质量控制依据。方法 利用高效液相色谱法测定蒙花苷的含量，采用正交试验考察加水倍量、浸泡时间、提取时间及提取次数等因素对提取效果的影响。结果 大黄甘草洗液的最佳提取工艺为药材加 14 倍量水浸泡 1 小时，提取 2 次，每次 2 小时。结论 提取工艺优化后稳定可靠，可为该药的量产提供保证。【关键词】大黄甘草洗液；提取工艺；正交试验；蒙花苷；高效液相色谱法Study on the extraction technology of Dahuang Gancao Lotion by orthogonal experimental design HE Juan，CAO Fu-ning，XIE Ning，et al.Nanning Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530001，China.【Abstract】Objective To optimize extraction technology of Dahuang Gancao Lotion，in order to offer the quality control foundation for pilot production.Methods HPLC is used to determine the content of linarin.Operation condition including liquid multiple ratio，immersion time，extraction time and extraction frequency are optimized with orthogonal design method.Results The best extraction technology of Dahuang Gancao Lotion were as fallows：liquid multiple ratio was 14 times，immersion time was one hour，extraction time was twice for two hour at a time.Conclusion The best extraction technology is reliable，it can provide a guarantee for pilot production.【Key words】Dahuang Gancao Lotion；Extraction technology；Orthogonal design method；Linarin；High-performance liquid chromatography基金项目：广西壮族自治区中医药管理局自筹经费 科研课题（GXZYZ20210311）间合适；杂质检测能力未受影响；在主峰及后杂分离度上有较明显改善，优化后方法较好。4 讨论经优化，最终确定的色谱条件如下：检测波长选择 220 nm；流动相比例调整为 0.1%三乙胺溶液-乙腈（94.55.5）；柱温选择 40；流速调整为 1.5 ml/min；色谱柱经比对选择 C8柱；供试品溶液经考察稳定性差需临用新制，另外增加进样盘控温；供试品浓度参考各标准为 5 mg/ml。在检出能力相当的情况下二聚体峰型得到有效改善，优化后方法分离度更好。参考文献1 谢奇恩，林福林，庞素秋.碳青霉烯类抗生素的研究进展J.北方药学，2011，8（2）：51-54.2 柯超，许一凡.美罗培南在儿科中的应用研究进展 J.精细与专用化学品，2018，26（5）：31-33.3 国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部 S.北京：中国医药科技出版社，2020：1013-1015.4 USP 43-NF 38.United States Pharmacopeia and National Formulary：USP 43-NF 38.The Official Compendia of StandardsS.Rockville，MD：United States Pharmacopeial Convention，Inc.；2020.45Journal of China Prescription Drug Vol.21 No.9实验研究延精密机械有限公司），JW5624 三相异步电动机（安徽省朝阳微电机厂），XG1.UP 脉动真空灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司），1525-2489-2707 高效液相色谱系统；江苏昆山 KQ5200E 型超声波清洗仪（40 kHz，200 W）；奥豪斯 AR-224CN 万分之一天平（奥豪斯仪器常州有限公司）；梅特勒 XS205 十万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q 超纯水机。1.2 试药大黄、甘草、野菊花、马齿苋、艾叶、地骨皮、酒黄精、当归及制何首乌等药材均购置安徽德昌药业有限公司。经南宁市中医医院中药房薛彩红副主任药师鉴定，均符合2015 年版 中国药典 一部项下各味药基源的规定。蒙花苷（批号：111528-201710，纯度 96.6%），购自中国食品药品检定研究院；甲醇：色谱纯（赛默飞）；实验用水为超纯水，其余化学试剂为分析纯。2 方法与结果2.1 蒙花苷标准曲线的绘制 2.1.1 色谱条件 色谱仪为 waters1525 高效液相色谱仪，色谱柱：大连 XBridge-C18柱（4.6 mm250 mm，5 m），流动相为甲醇-0.5%冰醋酸溶液（5050）；检测波长 334 nm，流速：1.0 ml/min；柱温：25；理论塔板数按岩白菜素峰计算应不低于 3 000。2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取蒙花苷对照品 10.8 mg，置 100 ml 量瓶中用甲醇超声溶解并稀释至刻度，制成含量为 104.33 g/ml对照品储备液，备用。2.1.3 供试品溶液制备 精密量取大黄甘草洗液样品 5.0 ml，置 25 ml 量瓶中，加甲醇 15 ml，超声处理 30 min（频率 40 kHz、功率 200 W），放冷，加甲醇至刻度，滤过，取续滤液作为供试品溶液。2.1.4 线性关系考察 精密吸取蒙花苷储备液适量，置 25 ml 量瓶中用 50%甲醇稀释至刻度，制成浓度为 70.94 g/ml 的对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液 0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2 ml，分别置 10 ml 量瓶中，加 50%甲醇稀释至刻度，制成浓度依次为 1.42 g/ml、2.84 g/ml、5.68 g/ml、11.35 g/ml、17.03 g/ml、22.70 g/ml 的蒙花苷对照品溶液，吸取上述 6 个不同浓度蒙花苷对照品溶液各 20 l，进样测定，得回归方程为：Y 2 328 025.466 0X-16 569.379 7，r 0.999 3。结果表明：蒙花苷进样量在 0.028 4 0.454 g/ml 之间与峰面积线性关系良好。2.1.5 精密度试验 分别精密吸取蒙花苷对照品溶液（13.35 g/ml）和供试品溶液（批号 190603）各 20 l，连续进样 6 次，依次测定峰面积值，测定结果见表 1。2.1.6 重现性试验 精密量取同一批号供试品（批号 190603）共 6 份，按供试品制备项下方法进行提取，各吸取 20 l 进样测定，结果测得平均值 60.33 g/ml，RSD为 0.63%。2.1.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液在上述色谱条件下，分别在 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 分别进样 20 l，测定峰面积值，RSD为 2.02%。2.1.8 回收率试验 精密称取已测知含量的同一批号（批号 190603）供试品 2.5 ml（含 量：60.33 g/ml）6 份，加 入 104.33 g/ml蒙花苷对照品溶液 1.4 ml，按供试品制备项下方法进行提取，进样量 20 l，测得蒙花苷的平均回收率为 97.24%，RSD为 2.09%；表明本法回收率高。2.1.9 正交试验设计 采用水提工艺，以蒙花苷提取率为评价指标，考察不同水平下浸泡时间、提取溶剂量、提取次数及提取时间对评价指标的影响，从而摸索出最佳工艺。因素水平见表 2。表 2 水提工艺条件正交试验因素水平表水平因素浸泡时间（A）加水倍量（B）提取次数（C）提取时间（D）10 h10 倍1 次1.0 h20.5 h12 倍2 次1.5 h31.0 h14 倍3 次2.0 h2.2 提取液中蒙花苷的测定2.2.1 色谱条件流动相：以甲醇-0.5%冰醋酸（5050）；流速：1.0 ml/min；柱温：25；检测波长 334 nm；进样量：10 l；理论塔板数按岩白菜素峰计算应不低于 3 000。此条件下对照品溶液、供试品溶液及阴性供试品溶液的 HPLC 见图 1、图 2和图 3。2.2.2 对照品溶液的制备精密称取蒙花苷（96.6%）对照品适量，加甲醇制成每0.109 8 mg/ml 的对照品溶液。2.2.3 供试品溶液的制备表 1 精密度试验结果（n 6）序 号123456RSD（%）对照品546 182546 619542 185551 422548 068548 5730.56样 品489 218487 184487 258486 403486 280485 6300.2646中国处方药 第 21 卷 第 9 期实验研究按照处方比例称取药材，加水提取、滤过、放冷定容，静置。精密量取提取液 5.0 ml，置 25 ml 量瓶中，加甲醇15 ml，超声处理 30 min（功率 200 W，频率 40 kHz），放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，制成供试品溶液。2.2.4 阴性供试品溶液按处方比例称取除野菊花外药材，其余按上述供试品溶液的制备方法，即得。2.3 水提取正交试验及结果按处方比例称取药材 9 份，根据正交试验表按不同的药材浸泡时间，加水倍量、提取时间和提取次数进行提取，采用高效液相色谱法进样检测蒙花苷提取量，用 SPSS 软件对数据进行处理，筛选出最佳提取工艺，结果见表 3 和表 4。从表 3 水提取工艺的直观分析中，R 值的大小提示各因素对蒙花苷的影响大小依次为 C（提取次数）D（提取时间）B（加水倍量）A（浸泡时间），结合 K 值（不同水平指标性成分含量总和，本法选择极差值大的结果符合研究预期）结果，可知：因素 C 提取时间选择 K2，因素 D提取时间应选择 K3，因素 B 加水倍量应选择 K3，因素 A 浸泡时间应选择 K3。根据表 4 指标性成分的方差分析可知，以上四因素对蒙花苷提取含量的影响差异无统计学意义（P 0.05）。因此，最优工艺确定为 C2D3B3A3，即药材加14 倍量水浸泡 1 h，提取 2 次，每次 2 h。2.4 验证试验按处方比例称取 3 份药材，按最优工艺 C2D3B3A3，按工艺稳定性制备样品分别测量蒙花苷含量，分别为 39.12 g/ml、38.77 g/ml、38.54 g/ml，平均含量为 38.81 g/ml，RSD%为 0.29%。3 讨论3.1 定量分析指标的选择目前，医院制剂的研发倡导以临床应用价值为导向。以特应性皮炎为例：皮肤菌群紊乱在特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）等炎症性皮肤病的发生、发展中发挥着重要作用。致病性金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）在宿主皮肤优势定植，可导致皮肤屏障被破坏及免疫系统失衡3-4。因此，选择性杀灭或抑制 AD 致病菌，改善皮肤屏障是防治特应性皮炎的新途径。本组方中大黄、甘草为君，野菊花、马齿苋为臣，佐以艾叶、地骨皮、酒黄精及制何首乌。在选择含量测定的评价指标时，前期预实验显示君药大黄的有效成分受制何首乌成分峰干扰故而未选。甘草意为调和，量较小故不作次选。臣药野菊花提取的有效成分为蒙花苷，已有研究5证实：野菊花提取物对致病性金黄色葡萄球菌有很好的抑制作用，表现为野菊花提取物作用于金黄色葡萄球菌后，菌体生长繁殖受到影响且细胞渗透性改变。因此，选野菊花中有效成分为含量测定评价指标切合特应性皮炎的防治机制。表 3 水提工艺正交试验 L9（34）直观分析表实验号ABCD蒙花苷含量（g/ml）111115.542122227.993133341.134212342.145223124.806231220.327313237.488321322.739332136.00K124.8828.3816.1922.11K229.0825.1735.3728.59K332.0732.4834.4735.33R7.187.3119.1813.22表 4 蒙花苷提取试验方差分析表因素离均差平方和自由度F值P 值A78.1421.000 0.05B80.5421.031 0.05C702.6028.992 0.05D262.1823.355 0.05注：P 0.05 为差异有统计学意义图 1 对照品溶液（蒙花苷 HPLC）图 2 供试品溶液（蒙花苷 HPLC）图 3 阴性供试品溶液47Journal of China Prescription Drug Vol.21 No.9医院药学3.2 剂型的选择大黄-甘草被纳入药对范畴已有数千年历史，曾作为经典内服泻下药对而被广泛使用。国内已有报道将大黄与甘草配伍以外治法应用于多种皮肤病6-7的治疗。在医院制剂的工艺研究中，本方可研发成洗剂或软膏剂。但从临床经验方研发成洗剂，即保留了原有传统剂型的优势，又切合特应性皮炎患者最基本的护理和治疗方法：洗浴。研究证实洗浴不仅可以去除皮肤表面污秽痂皮，还可降低皮肤表面金黄色葡萄球菌定植数量8。因此本方最终将剂型选定为洗剂。3.3 高效液相色谱条件的选择在高效液相色谱条件的优化研究中，本课题组参考中国药典（2015 版）野菊花项下蒙花苷检测标准，且经对照品及供试品溶液验证，最终选定检测波长为 334 nm。本课题组对流动相的比例（4060，5050，6040，V/V）及流速（0.8、1.0、1.2ml/min）进行了考察，以待测成分色谱峰峰形对称无拖尾及基线平稳为评判标准。最终形成“2.2.1”项下色谱条件。参考文献1 中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会环境与职业性皮肤病学组.特应性皮炎外用制剂合理应用及患者指导专家共识 J.中华皮肤科杂志，2022，55（4）：281-288.2 Li Y，Han T，Li W，et al.Awareness of and phobias about topical corticosteroids in parents of infants with eczema in Hangzhou，ChinaJ.Pediatr Dermatol，2018，35（4）：463-467.3 Tay ASL，Li C，Nandi T，et al.Atopic dermatitis microbiomes stratify into ecological dermotypes enabling microbial virulence and disease severity J.J Allergy Clin Immunol，2021，147：1329-1340.4 Nakatsuji T，Gallo RL.The role ot the skin microbiome in atopic dermatitisJ.Ann Allergy Asthma Immunol，2019，122：263-269.5 蒋雨，陈安均，于新，等.野菊花提取物抑菌活性 J.四川农业大学学报，2010，28（3）：328-332.6 赖江，李春霄，肖飏.大黄甘草汤加味坐盆结合派瑞松外擦治疗肛门湿疹 60 例临床观察 J.四川中医，2012，30（7）：106-1207 赵祖云，赵攀枚，蒲雪连.等.黄莺教授外用大黄甘草汤加味治疗皮肤病经验 J.亚太传统医药，2021，17（1）：94-96.8 中华医学会，中华医学会杂志社，中华医学会皮肤性病学分会，等.特应性皮炎基层诊疗指南（2020 版）J.中华全科医师杂志，2022，21（7）：609-619.慢性阻塞性肺疾病（以下简称“慢阻肺”）患者的收治主要集中在医院的呼吸内科，WHO 以及国家卫健委的资料显示1-2，慢阻肺的发病率在国际与国内均呈逐年升高趋势，严重危害了人们的健康，对国家、社会与个人带来了不同程度的经济负担与身心压力，并且慢阻肺的急性发作会加速患者的死亡，也是导致慢阻肺患者死亡的关键因素3。不同的研究发现4-5，处于慢阻肺发生、发展不同阶段的患者，他们的情绪、睡眠以及生活质量均受到了疾病的影响。当前，紧跟药学服务的飞速发展与模式转型，临床上，除了对慢阻肺患者针对性的治疗与护理外，药学服务渐渐发挥了它的价值。比如有研究针对性地对慢阻肺患者吸入装置进行用药教育，能提高患者的吸入治疗依从性及降低潜在不良反应6。本研究采用基于问题导向的用药教育对慢阻肺患者住院期间进行用药基于问题导向的用药教育对慢阻肺患者情绪与睡眠、生活质量的影响陈琪，高霞，王丹丹（南通大学附属南通第三医院/南通市第三人民医院，江苏南通 226006）【摘要】目的 探讨通过实施基于问题导向的用药教育对慢阻肺患者情绪、睡眠及生活质量的影响变化。方法 选择 2020 2021 年期间医院呼吸内科收治的慢阻肺患者 84 例，随机平均分为观察组与对照组，对照组患者给予普通的用药教育，观察组患者实施基于问题导向的用药教育，比较两组患者在干预前后肺功能指标、负性与抑郁情绪、睡眠质量及生活质量的变化。结果 不同模式干预后，观察组患者的肺功能较对照组患者改善显著（FEV1%pred 水平显著高于对照组患者）（P 0.05）；观察组患者的情绪较对照组得到了显著的正向改变（血清皮质醇水平显著低于对照组患者）（P 0.05）；观察组患者的睡眠质量较对照组患者显著改善（PSQI 评分显著低于对照组患者）（P 0.05）；观察组患者的生活质量较对照组患者显著改善（躯体功能、心理功能与社会功能评分均显著高于对照组患者）（P 0.05）。结论 基于问题导向的用药教育能够更好地解决慢阻肺患者的用药相关问题，从而更好地改善患者的肺功能，纠正患者的负性抑郁情绪，改善患者的睡眠质量，最终达到提升患者生活质量的目的。【关键词】基于问题导向；用药教育；慢性阻塞性肺疾病；睡眠质量；生活质量