基于网络药理学研究灵芝治疗骨质疏松症的分子机制.pdf

116中国合理用药探索CHINESE JOURNAL OF RATIONAL DRUG USE经 方和经验方用药基于网络药理学研究灵芝治疗骨质疏松症的分子机制Exploration into Molecular Mechanism of Ganoderma in the Treatment of Osteoporosis by Network Pharmacology冯平，李晓峰*，霍乐乐基金项目河南省中医药科学研究专项课题（2015ZY02068）作者简介冯平，男，主治医师，专业方向：中医骨伤科学相关疾病的研究。E-mail：。通讯作者李晓峰，男，副主任医师，专业方向：中医骨伤科学相关疾病的研究。E-mail：。河南省洛阳正骨医院（河南省骨科医院），郑州 450016FENG Ping,LI Xiao-feng*,HUO Le-leLuoyang Orthopedic-Traumatological Hospital Of Henan Province(Henan Provincial Orthopedic Hospital),Zhengzhou 450016,China摘要目的：应用网络药理学方法对灵芝治疗骨质疏松症的主要活性成份及可能作用机制进行预测分析。方法：分别在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、OMIM 等数据库检索并筛选灵芝的活性成份及骨质疏松症相关靶点；利用 Cytoscape3.2.1 软件构建“灵芝活性成份-骨质疏松症-共同靶点”网络，采用 String 数据库构建蛋白质相互作用网络筛选关键靶点，利用 David 数据库对共同靶基因进行基因本体（GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析。结果：筛选得到灵芝与骨质疏松症相关的 61 种活性成份和 21 个共同靶基因。其中-谷甾醇、环氧灵芝醇 B、环氧灵芝醇 C、麦角甾-4,7,22-三烯-3,6-二酮、灵芝酮三醇、灵芝醇 A、Lucialdehyde A、Lucialdehyde B 是灵芝治疗骨质疏松症的主要活性成份；MAPK3、MAPK1、NR3C1、ESR1、AR、CYP19A1、NOS3、HIF1A是骨质疏松症的治疗中的核心靶点。GO 分析和 KEGG 分析显示，灵芝治疗骨质疏松症主要涉及核受体的活性、配体激活的转录因子活性、类固醇结合、类固醇激素受体活性、DNA 结合转录激活剂活性、RNA 特异性聚合酶等生物学过程，通过参与调节催乳素信号通路、雌激素信号通路、肾细胞癌、乳腺癌等发挥抗骨质疏松作用。结论：通过网络药理学初步预测了灵芝治疗骨质疏松症的潜在活性成份及其可能机制，揭示其可通过多成份、多靶点、多途径的方式发挥作用，为进一步开展灵芝抗骨质疏松作用机制的研究提供了新思路和新方法。关键词灵芝；骨质疏松；网络药理学；生物过程；信号通路中图分类号 R285 文献标志码A 文章编号 2096-3327（2023）10-116-07DOI10.3969/j.issn.2096-3327.2023.10.019Abstract Objective:The biological processes were employed to analyze the active ingredients and the potential molecular mechanism of Ganoderma in the treatment of osteoporosis(OP).Methods:The main active ingredients of Ganoderma and OP related targets were screened in the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform(TCMSP)database and OMIM database.The ganoderma-active ingredients-potential targets network was constructed using Cytoscape3.2.1 software.The protein-protein interactions network mapping was constructed using the String database to select the key targets.The gene oncology(GO)and KEGG of the key targets were analyzed using DAVID.Results:A total of 61 active ingredients and 21 common targets of Ganoderma for OP treatment were screened.Among the active ingredients,beta-sitosterol,epoxyganoderiol B,epoxyganoderiol C,ergosta-4,7,22-trien-3,6-dione,ganodermatriol,ganodermenonol,Lucialdehyde A,Lucialdehyde B are the main active ingredients of Ganoderma in treating OP.MAPK3,MAPK1,NR3C1,ESR1,AR,CYP19A1,NOS3 and HIF1A are the key targets in treating OP.The GO-biological process and KEGG pathways enrichment analysis showed that the mechanisms of Ganoderm in treating OP mainly involve nuclear receptor activity,ligand-activated transcription factor activity,steroid binding,steroid hormone receptor activity,DNA-binding transcription activator activity,RNA polymerase-specific,by regulating prolactin signaling pathway,estrogen signaling pathway,renal cell carcinoma,breast cancer,and other signaling pathways to exert its anti-osteoporosis effect.Conclusion:The potential active ingredients of Ganoderma in the treatment of OP and their possible mechanisms were preliminarily predicted through network pharmacological,which revealed that it could play its role through multi-ingredients,multi-targets and multi-channels,providing new ideas and methods for further research on the anti-osteoporosis mechanism of Ganoderma.Key words Ganoderma;osteoporosis;network pharmacology;biological process;signaling pathway中国合理用药探索2023年第10期1023.indd 1162023/11/6 15:39:43117第 20 卷2023 年第 10 期经 方 和 经 验 方 用 药近年来，骨质疏松症已成为老年人群和绝经后妇女的重要公共卫生问题之一。骨质疏松症会增加骨折风险，因而在世界范围内越来越受到重视1-2。随着老龄化进程的加快，我国骨质疏松症、骨质疏松性骨折的发生率逐年上升。据报道，2016 年我国60 岁以上人群骨质疏松症的患病率为 36%，估计到2050 年将有 599 万以上的老年人出现骨质疏松性骨折，给全社会带来巨大的经济压力和医疗负担3-4。因此，迫切需要开发有效的治疗策略来干预和治疗骨质疏松症。中医药是中华民族的瑰宝，多味中药已被证实在治疗骨质疏松症、骨折、类风湿性关节炎等多种骨科相关疾病时具有疗效较佳、不良反应较少的优点5-7。也有大量的研究表明，有些中药能够通过改善肠道对钙离子的吸收、促进成骨细胞成熟、增强细胞的成骨活性以及抑制破骨细胞的形成来预防和治疗骨质疏松症8-9。因此积极寻找具有治疗骨质疏松症作用的中药并明确其有效成份是当前的研究热点之一。灵芝为多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.或紫芝Ganoder-ma sinense Zhao，Xu et Zhang 的干燥子实体，别名赤芝、木灵芝等，味甘，性平，归心、肺、肝、肾经，具有补气安神、止咳平喘的功效。目前已从灵芝中分离并鉴定出灵芝多糖、灵芝酮三醇等 400 多种化合物。现代药理学研究表明，灵芝具有免疫调节、降血糖、抗氧化、抗衰老等多种生物学活性10。神农本草经记载其“利关节，保神，益精气，坚筋骨久食轻身不老，延年神仙”11，提示其在骨质疏松症等衰老性疾病的治疗中有巨大潜力。然而灵芝的药效物质基础尚不明确，其抗骨质疏松作用的靶点及机制也有待深入研究，这在一定程度上限制了其在临床上的推广和应用。网络药理学是在经典药理学、计算机技术和生物信息学等多学科交叉融合的基础上发展起来的一门新兴学科，它可以从多个方面系统地研究药物与人体之间的相互作用及规律。网络药理学有助于探索药物发挥疗效的多种作用途径和（或）信号通路，该策略已被广泛应用于中医药多成份、多靶点、多路径、多功能研究及中药配方分析、新药开发等领域7。基于此，本研究通过运用网络药理学方法系统地探讨了灵芝治疗骨质疏松症的生物学机制，以期为临床应用提供理论依据。1 资料与方法1.1 收集、筛选灵芝的活性成份及作用靶点利 用 中 药 系 统 药 理 学 数 据 库 与 分 析 平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https：/tcmsp- 于 吸 收、分 布、代 谢 及 排泄等药代动力学参数，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）30%、药 物 相 似 性（drug-likeness，DL）0.18 为限定条件筛选得到灵芝中的潜在活性成份。将获得的活性成份输入 PubChem 数 据 库（https：/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到其相应的分子结构，并保存为 SMILES 格式。为了确定灵芝的潜在靶标，将筛选得到的活性成份的 SMILES 文件逐一输入Swiss Target Prediction 数据库（http：/www.swisstargetprediction.ch/），限定物种为“homo sapiens”，通过整合去重后得到灵芝主要活性成份的预测靶点。应用 Uniprot 数据库（https：/www.uniprot.org/）对预测的靶点进行人类基因名转换。1.2 骨质疏松症相关靶点的筛选以“osteoporosis”为关键检索词，在DisGeNET数据库（http：/www.disgenet.org/）和 OMIM 数据库（https：/omim.org/）中检索并筛选骨质疏松症已知的疾病靶点，整合两个数据库的检索结果并删除重复靶点，得到已知的与骨质疏松症密切相关的疾病靶点。中国合理用药探索2023年第10期1023.indd 1172023/11/6 15:39:44118中国合理用药探索CHINESE JOURNAL OF RATIONAL DRUG USE经 方和经验方用药1.3 构建“灵芝活性成份-骨质疏松症-共同靶点”网络将灵芝活性成份与骨质疏松症的潜在作用靶点导入 Cytoscape 3.2.1 软件并构建“灵芝活性成份-骨质疏松症-共同靶点”可视化网络。1.4 构建蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction network，PPI）通过 Bioinformatics and Evolutionary Genomics在线网站（http：/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）将灵芝主要活性成份的潜在作用靶点与骨质疏松症已知靶点进行映射取交集，提取共同的靶基因。将共同的靶基因上传到 String 数据库（https：/string-db.org/），物种选择“homo sapiens”，获取蛋白质相互作用信息，并将结果导入 Cytoscape 3.2.1 软件，构建 PPI 并进行可视化展示，同时对网络结构进行拓扑分析。1.5 灵芝治疗骨质疏松症关键靶点通路与功能富集分析将灵芝中活性成份和骨质疏松症共同靶点作为关键靶点，通过 David 数据库（https：/david.ncifcrf.gov/），限定物种为“homo sapiens”，对关键靶点进行基因本体（gene ontology，GO）分析与京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析，得到共同靶点富集最具显著性的生物学注释。其中，GO 分析包括生物过程、细胞组分和分子功能，以P0.01为筛选标准；KEGG 分析以P0.05 为筛选标准。2 结果2.1 灵芝活性成份及其作用靶点通过 TCMSP 数据库共检索到灵芝中的 242 种化学成份，经筛选后得到 61 种灵芝活性成份。利用Swiss Target Prediction 数据库预测灵芝中所有活性成份的作用靶点，去除无效和重复靶点后，61 种活性成份共涉及 107 个作用靶点。2.2 灵芝治疗骨质疏松症的潜在作用靶点通过检索、合并、去重后共获得 478 个骨质疏松症相关靶点，将其与灵芝活性成份作用靶点相映射并绘制 Venn 图（图 1），获得 21 个共同靶基因，包括NR3C1、AR、HSD11B1、PGR、NOS3、CYP19A1、TACR3、CYP17A1、LDLR、ESR1、ESR2、CNR1、CNR2、VDR、HIF1A、NR1I2、MMP1、PTPN11、GC、MAPK1、MAPK3。2.3“灵芝活性成份-骨质疏松症-共同靶点”网络将灵芝治疗骨质疏松症的活性成份及作用靶点导入 Cytoscape 3.2.1 软件，得到“灵芝活性成份-骨质疏松症-共同靶点”网络（图 2）。结果表明，-谷甾醇（beta-sitosterol）、环氧灵芝醇B（epoxyganoderiol B）、环氧灵芝醇C（epoxyganoderiol C）、麦角甾-4,7，22-三 烯-3，6-二 酮（ergosta-4,7,22-trien-3,6-dione）、灵芝酮三醇（ganodermatriol）、灵芝86（15.25%）灵芝主要活性成份作用靶点21（3.72%）457（81.03%）骨质疏松症相关靶点图 1灵芝活性成份作用靶点与骨质疏松症相关靶点的交集中国合理用药探索2023年第10期1023.indd 1182023/11/6 15:39:44119第 20 卷2023 年第 10 期经 方 和 经 验 方 用 药醇 A（ganodermenonol）、Lucialdehyde A、Luci-aldehyde B 能与 6 个以上的靶点相连接，是灵芝治疗骨质疏松症时的主要活性成份。2.4 灵芝治疗骨质疏松症的关键靶点蛋白将灵芝与骨质疏松症映射得到的 21 个共同靶基因导入 String 数据库并绘制灵芝-骨质疏松症的 PPI（图 3）。在 PPI 中，去除 2 个孤立蛋白节点后，共有 21 个节点通过 126 条边发生相互作用。通过分析拓扑结构，筛选得到 MAPK3、MAPK1、NR3C1、ESR1、AR、CYP19A1、NOS3、HIF1A 等共 19 个灵芝治疗骨质疏松症的关键靶点蛋白（表 1）。2.5 GO 分析和 KEGG 分析利 用 DAVID 数 据 库 对 灵 芝 治 疗 骨 质 疏 松症的 21 个共同靶基因进行 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。在 GO 分析中，选取富集程度最高的 20 个生物过程进行展示（图 4），结果 显 示 灵 芝 主 要 涉 及 核 受 体 的 活 性（nuclear receptor activity）、配 体 激 活 的 转 录 因 子 活 性（ligand-activated transcription factor activity）、节点代表蛋白，边代表蛋白与蛋白之间的联系，边的粗细代表两个蛋白之间的密切性，位于网络中心且边数越多的节点越可能成为关键靶点图 3灵芝-骨质疏松症的 PPI 图CYP19A1CYP17A1ARVDRGCPGRMAPK3ESR1HSD11B1MAPK1MMP1ESR2NR3C1HIF1ACNR1NOS3CNR2LDLRPTPN11低高LZ：灵芝；OP：骨质疏松症图 2“灵芝活性成份-骨质疏松症-共同靶点”网络中国合理用药探索2023年第10期1023.indd 1192023/11/6 15:39:44120中国合理用药探索CHINESE JOURNAL OF RATIONAL DRUG USE经 方和经验方用药表 1灵芝治疗骨质疏松症的关键靶点蛋白序号关键靶点蛋白网络节点度（degree）序号关键靶点蛋白网络节点度（degree）1MAPK31311ESR272MAPK13112MMP153NR3C11113CNR154ESR11114VDR45AR915HSD11B136CYP19A1916PTPN1137NOS3917CNR218HIF1A818GC29PGR719LDLR110CYP17A17 nuclear receptor activityligand-activated transcription factor activitysteroid bindingsteroid hormone receptor activityDNA-binding transcription activitor activity,RNA poiymerase-specificphosphotyrosine residue bindingproterin phosphorylated amino acid bindinghormone receptor bindingATPase bindingMAP kinase bindingphosphoprotein bindingMAP kinase kinase activitymonooxygenase activityhormone bindingRNA polymerase general transcription initiation factor bindingheme bindingoxygen bindingnuclear hormone receptor bindingtetrapyrrole bindingDNA-binding transcription activitor activity0.0010.0020.0030.004028P值0.00546图 4灵芝活性成份关键靶点 GO 生物过程富集分析类固醇结合（steroid binding）、类固醇激素受体活性（steroid hormone receptor activity）、DNA 结合转录激活剂活性（DNA-binding transcription activitor activity）、RNA 特异性聚合酶（RNA polymerase-specific）等生物过程。在 KEGG 分析中，按照P值大小进行排序，选取富集程度最高的前 20 条信号通路展示（图 5），结果显示靶基因主要富集在催乳素信号通路（prolactin signaling pathway）、雌激素信号通路（estrogen signaling pathway）、肾细胞癌（renal cell carcinoma）、乳腺癌（breast cancer）等信号通路。3 讨论骨质疏松症是一种全身性代谢性骨病，其特征在中国合理用药探索2023年第10期1023.indd 1202023/11/6 15:39:45121第 20 卷2023 年第 10 期经 方 和 经 验 方 用 药图 5灵芝活性成份关键靶点的 KEGG 代谢通路富集分析0.0010.0020.0030.004P值prolactin signaling pathwayestrogen signaling pathwayrenal cell carcinomabreast cancerPD-L1 expression and PD-1 checkpoint pathway in cancerproteoglycans in cancerHIF-1 signaling pathwaylipid and atherosclerosisbladder cancerthyroid hormone signaling pathwayoocyte meiosisrelaxin signaling pathwayovarian steroidogenesisVEGF signaling pathwaysteroid hormone biosynthesiscushing syndromechronic myeloid leukemiacentral carbon metabolism in cancerGnRH secretionendocrine resistance0246于骨密度降低和脆性骨折风险增加。随着人类寿命延长和老龄化进程加快，骨质疏松症已成为重要的健康问题之一12。目前临床上所使用的降钙素、双膦酸盐、雌激素等抗骨质疏松药物大多数通过抑制破骨细胞活性发挥作用13，长期应用抗骨质疏松药物会增加乳腺癌、前列腺癌的患病风险，并易导致下颌骨坏死等不良反应14。因此，从中医药中寻找能够有效预防和治疗骨质疏松症的提取物是一种新的治疗策略。灵芝对免疫系统、神经系统、内分泌系统以及心血管系统等都具有调节作用10。近年来，不少研究提示灵芝具有抗骨质疏松的作用15，但灵芝活性成份复杂，其在体内多成份、多靶点、多途径的药理特征尚未得到深入研究。本研究利用系统和规范的生物信息学方法来挖掘多种数据库，整合和分析靶蛋白和化合物的信息，对阐明灵芝抗骨质疏松的作用靶点及分子机制具有重要意义。在本研究中，基于网络药理学方法，通过药代动力学系统评估、PPI 分析以及 GO、KEGG 分析，初步研究了灵芝治疗骨质疏松症的有效成份和潜在靶点。本研究共筛选得到 61 种活性成份、107 个活性成份可能的作用靶点以及 478 个骨质疏松症相关靶点。“灵芝活性成份-骨质疏松症-共同靶点”网络分析显示-谷甾醇、环氧灵芝醇 B、环氧灵芝醇C、麦角甾-4，7，22-三烯-3，6-二酮、灵芝酮三醇、灵芝醇 A、Lucialdehyde A、Lucialdehyde B 等活性成份能协同作用于多个靶点，表明灵芝在治疗骨质疏松症过程中具有多成份、多靶点交互作用的特性。进一步对 21 个灵芝治疗骨质疏松症的共同靶基因进行 PPI 分析，结果表明 MAPK3、MAPK1、ESR1、NR3C1、AR、CYP19A1、NOS3、HIF1A在交互网络中具有最高权重，提示其可能是灵芝治疗骨质疏松症的关键靶点蛋白。MAPK3、MAPK1基因编码的 MAPK1 和 MAPK3 属于蛋白激酶，是MAPK 信号通路中的重要分支之一，在细胞增殖、分化中起重要作用。MAPK1/MAPK3 与细胞分化及骨形成密切相关。MAPK1/MAPK3 被磷酸化后能够调节成骨分化特异性转录因子 RUNX2 及其下游OSX基因的表达，上调成骨分化标志物碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨钙素（osteocalcin，OCN）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）的表达，促中国合理用药探索2023年第10期1023.indd 1212023/11/6 15:39:45122中国合理用药探索CHINESE JOURNAL OF RATIONAL DRUG USE经 方和经验方用药进成骨细胞的成熟及基质的矿化16-17。雌激素受体（estrogen receptor，ER）属于核受体超家族，主要存在于细胞核中，通过与雌激素结合而参与多种生理过程的调节。ESR1是ER的一个亚型，在皮质骨中高表达。全基因组关联研究表明，ESR1基因多态性与骨密度密切相关18。糖皮质激素由于具有良好的抗炎作用而被广泛用于自身免疫性疾病和炎症性疾病的治疗，然而长期过量应用糖皮质激素会抑制成骨细胞分化、促进成骨细胞凋亡从而导致骨质疏松症。NR3C1能够编码糖皮质激素受体，直接影响RANKL启动子的活性及其转录调控，诱导成骨细胞凋亡，导致主要骨重塑途径 RANK/RANKL/OPG 轴的失衡，骨吸收增加19。KEGG通路富集分析表明，灵芝中的生物活性成份可以通过多种途径发挥抗骨质疏松作用，其核心靶点主要涉及通路包括催乳素信号通路、雌激素信号通路、肾细胞癌、乳腺癌等。雌激素主要通过与 ER 结合来发挥其功能和作用，雌激素信号通路通常在骨质疏松症中出现失调，绝经后女性会由于体内雌激素水平的下降而发生骨重建失衡、骨吸收增加20。综上所述，本研究应用网络药理学筛选了灵芝中的活性成份及其潜在靶点，揭示了灵芝发挥抗骨质疏松作用的潜在机制可能是基于其对潜在靶点和通路的直接或间接调控，体现了灵芝多成份、多靶点、多途径的治疗特点。网络药理学为灵芝治疗骨质疏松症提供了新的思路和方向，但仍需相关体外的细胞功能实验、体内的骨质疏松模型实验进行验证。参 考 文 献1 REID IR，BILLINGTON EO.Drug therapy for osteoporosis in older adultsJ.Lancet，2022，399（10329）：1080-1092.2 ANAM AK，INSOGNA K.Update on osteoporosis screening and managementJ.Med Clin North Am，2021，105（6）：1117-1134.3 WANG LH，YU W，YIN XJ，et al.Prevalence of osteoporosis and fracture in China：the China osteoporosis prevalence studyJ.JAMA Netw Open，2021，4（8）：e2121106.4 YU F，XIA WB.The epidemiology of osteoporosis，associated fragility fractures，and management gap in ChinaJ.Arch Osteoporos，2019，14（1）：32.5 SUVARNA V，SARKAR M，CHAUBEY P，et al.Bone health and natural products-an insightJ.Front Pharmacol，2018，9：981.6 TANG HJ，HOSEIN A，MATTIOLI-BELMONTE M.Traditional 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