基于铜死亡相关lncRNA构建乳腺癌预后预测模型.pdf

山东医药2023 年第 63 卷第 27 期基于铜死亡相关lncRNA构建乳腺癌预后预测模型张庆雪1，赵硕2，张莹莹2，高东程2，李靖若21 郑州大学第三附属医院乳腺外科，郑州450052；2 郑州大学第一附属医院乳腺外科摘要：目的构建铜死亡相关长链非编码核糖核酸（long non-coding RNA，lncRNA）预后预测模型，并进行效能验证。方法从癌症基因组图谱数据库下载女性乳腺癌患者的转录组数据及临床信息，通过Pearson相关性分析鉴定乳腺癌组织中的铜死亡相关lncRNA。将铜死亡相关lncRNA及临床资料均完整的乳腺癌患者作为整体组，以1：1的比例随机分为训练组和验证组。在训练组中通过单因素Cox回归、Lasso回归筛选与乳腺癌患者预后关系密切的铜死亡相关lncRNA。基于上述选择的lncRNA，采用多因素Cox回归分析构建乳腺癌预后预测模型，再根据AIC值选择最佳乳腺癌预后预测模型（AIC值最小）。依据最佳乳腺癌预后预测模型计算所有患者的风险评分。以训练组患者的中位风险评分作为截断值，将所有患者分为高、低风险组，通过生存曲线、亚组生存分析验证预后预测模型的区分能力，通过ROC及一致性指数曲线验证预后预测模型的准确性，通过单因素和多因素Cox回归验证预后预测模型的独立性。通过对高、低风险组差异表达基因进行GO及KEGG富集分析，对高、低风险组患者进行免疫浸润分析验证预后预测模型的临床实用性。结果乳腺癌预后预测模型由10个铜死亡相关lncRNA（AKT3.IT1、AL137847.1、AL807757.2、AC079766.1、AL451123.1、LINC02043、AL683813.1、AC073127.1、MFF.DT 和AC091588.1）构建而成，模型公式为风险评分=（-1.129 216 501 573 150AKT3.IT1表达量）+（-1.166 095 685 256 72AL137847.1表达量）+（0.729 804 497 137 164LINC02043表达量）+（0.745 696 645 441 295AL683813.1表达量）+（-0.903 562 388 041 113AL807757.2表达量）+（1.040 608 675 397 110AC073127.1表达量）+（2.160 133 554 898 460MFF.DT 表达量）+（1.417 144 256 517 410AC091588.1 表达量）+（-0.764 700 719 748 750AC079766.1表达量）+（-3.608 177 447 126 010AL451123.1表达量）。生存曲线表明高风险组患者的生存率更低（P0.001）；亚组生存分析表明除M1分期外，不同临床阶段的高、低风险组乳腺癌患者的预后差异均有统计学意义（P0.05）。ROC显示预后预测模型预测乳腺癌患者1年、3年和5年生存率的曲线下面积分别为0.807、0.739和0.709，ROC及一致性指数曲线结果显示风险评分的预测效能优于其他临床特征。单因素和多因素Cox回归分析表明风险评分是乳腺癌患者预后的独立影响因素。高、低风险组之间差异表达的基因富集于免疫和耐药相关通路；与低风险组比较，高风险组患者的免疫细胞和基质细胞评分低，M2巨噬细胞浸润丰度高（P0.05）。结论基于铜死亡相关lncRNA构建了乳腺癌预后预测模型，其区分能力、准确性、独立性及临床实用性良好。关键词：长链非编码核糖核酸；铜死亡；乳腺癌；预后预测模型；基因本体功能；信号通路；免疫细胞浸润doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.27.006 中图分类号：R737.9 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）27-0029-08Prognostic model construction for breast cancer based on cuproptosis-related lncRNAZHANG Qingxue1，ZHAO Shuo，ZHANG Yingying，GAO Dongcheng，LI Jingruo1 Breast Surgery，The Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，ChinaAbstract：Objective To construct a prognostic model for breast cancer based on cuproptosis-related long non-coding RNA（lncRNA）and to validate its efficacy.Methods The transcriptional data and clinical information of female patients with breast cancer were obtained from the Cancer Genome Atlas（TCGA）database，and cuproptosis-related lncRNAs in breast cancer were identified by Pearson correlation analysis.Breast cancer patients with complete cuproptosis-related lncRNA and clinical data were taken as an overall group and were randomly divided into the training group and validation group at a ratio of 1：1.The cuproptosis-related lncRNAs which were closely related to the prognosis of breast cancer 基金项目：河南省医学科技攻关计划省部共建项目（2018010002）；河南省高等学校重点科研项目计划（19A320074）。第一作者简介：张庆雪（1998-），女，硕士研究生，主要研究方向为乳腺良恶性疾病的诊治。E-mail：通信作者简介：李靖若（1968-），女，博士研究生，主任医师，主要研究方向为乳腺良恶性疾病的诊治。E-mail：L29山东医药2023 年第 63 卷第 27 期patients were screened out by univariate Cox regression analysis and LASSO regression analysis in the training group.The multivariate Cox regression analysis was used to construct a prognostic model in breast cancer based on the above-selected lncRNAs，and then the optimal prognostic model（with the smallest AIC value）was selected based on the AIC value.Risk scores were calculated for each patient based on the optimal breast cancer prognostic model.The median risk score of the patients in the training group was used as a cut-off value to categorize all patients into high-and low-risk groups.The differentiation ability of the prognostic model was validated by survival curves and subgroup survival analysis.The accuracy of the prognostic model was validated by receiver operator characteristic（ROC）and consistency index curves.The independence of prognostic models was verified by univariate and multivariate Cox regression.The clinical utility of the prognostic model was verified by Gene Ontology（GO）and Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes（KEGG）pathway enrichment analysis of differentially expressed genes in the high-and low-risk groups，and immune infiltration analysis of patients in the high-and low-risk groups.Results The breast cancer prognostic model was constructed by 10 cuproptosis-related lncRNAs（AKT3.IT1，AL137847.1，AL807757.2，AC079766.1，AL451123.1，LINC02043，AL683813.1，AC073127.1，MFF.DT and AC091588.1）.The model formula was risk score=（-1.129 216 501 573 150expression of AKT3.IT1）+（-1.166 095 685 256 72expression of AL137847.1）+（0.729 804 497 137 164expression of LINC02043）+（0.745 696 645 441 295expression of AL683813.1）+（-0.903 562 388 041 113expression of AL807757.2）+（1.040 608 675 397 110expression of AC073127.1）+（2.160 133 554 898 460expression of MFF.DT）+（1.417 144 256 517 410expression of AC091588.1）+（-0.764 700 719 748 750expression of AC079766.1）+（-3.608 177 447 126 010expression of AL451123.1）.The survival curves demonstrated that patients in the high-risk group had a lower survival rate（P0.001）.Subgroup survival analysis showed that there was significant difference in prognosis of breast cancer patients in different clinical stages，except for the M1 stage between the high-and low-risk groups（P0.05）.ROC curves showed that the area under the curve of the model for 1-，3-，and 5-year survival was 0.807，0.739，and 0.709，respectively.The multivariate ROC curves and the concordance index curves showed that the predictive efficacy of the risk score was superior to other clinical features.The univariate and multivariate Cox regression analysis showed that risk score was an independent prognostic feature for breast cancer.The differentially expressed genes between the high-and low-risk groups were mainly enriched in immune-and drug resistance-related pathways.Patients in the high-risk group had lower levels of immune cell and stromal cell scores and a higher abundance of M2 macrophage infiltration in comparison with patients in the low-risk group（all P0.4和P0.001为标准筛选出乳腺癌组织中的铜死亡相关 lncRNA，并使用 R 包“dplyr”、“ggalluvial”和“ggplot2”绘制桑基图。乳腺癌组织中与预后关系密切的铜死亡相关lncRNA筛选：选择铜死亡相关lncRNA表达谱与临床资料均完整的患者885例（整体组），用R包“caret”的“createDataPartition”函数按照1 1的比例将整体组患者随机分为训练组443例与验证组442例，并使用2检验分析组间临床资料（包括生存时间、生存状态、年龄、临床分期及T、N、M分期）差异。在训练组中，使用 R包“survival”进行单因素Cox回归分析初步筛选与乳腺癌患者预后相关的铜死亡相关 lncRNA，筛选标准为 P1，错误发现率0.05。使用 R 包“clusterProfiler”、“org.Hs.eg.db”和“enrichplot”进行京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析识别差异表达的基因31山东医药2023 年第 63 卷第 27 期主要参与的信号通路，进行基因本体功能（GO）分析差异表达的基因主要涉及的生物学过程、细胞成分和分子功能，P0.05和校正后的P值0.05，见表1，说明两组基线资料均衡可比。在训练组中，单因素Cox回归分析初步筛选出17个与乳腺癌患者预后相关的铜死亡相关lncRNAs，包括7个保护 lncRNAs 风险比（HR）1）；LASSO回归分析进一步确定了14个与乳腺癌预后关系密切的铜死亡相关lncRNAs。采用多因素Cox回归分析最后构建了由10个lncRNAs组成的乳腺癌预后预测模型，模型公式如下：风险评分=（-1.129 216 501 573 150AKT3.IT1表达量）+（-1.166 095 685 256 72AL137847.1 表达量）+（0.729 804 497 137 164LINC02043 表 达 量）+（0.745 696 645 441 295AL683813.1 表 达 量）+（-0.903 562 388 041 113AL807757.2 表达量）+（1.040 608 675 397 110AC073127.1 表 达 量）+（2.160 133 554 898 460MFF.DT 表 达 量）+（1.417 144 256 517 410AC091588.1 表 达 量）+（-0.764 700 719 748 750AC079766.1 表达量）+（-3.608 177 447 126 010AL451123.1表达量）。2.2乳腺癌预后预测模型的效能验证结果根据乳腺癌预后预测模型公式，训练组患者的中位风险评分为1.066，根据中位风险评分将患者分为高风险组和低风险组。生存曲线显示在训练组、验证组和整体组中，高、低风险组患者的总体生存率差异均具有统计学意义（P0.001），且高风险组患者预后较差，见图 13。亚组分析显示不同年龄、临床分期、T、N和 M0分期亚组中高风险组患者的生存率均低于低风险组（T3-4亚组P=0.003，其余P均60临床分期 T 分期 T1 T2 T3 T4N 分期 N0 N1 N2 N3M 分期 M0 M1整体组例515370160514195 16235521 99 30436294102 53869 16%58.241.818.058.122.0 1.826.558.911.2 3.449.333.211.5 6.098.2 1.8训练组例263 180 75 263 95 10 109 267 46 21 217 149 51 26 433 10%59.440.617.059.321.42.324.660.310.44.749.033.611.55.997.72.3验证组例252 190 85 251 100 6 126 254 53 9 219 145 51 27 436 6%57.043.019.256.822.6 1.428.557.512.0 2.049.632.811.5 6.198.6 1.4 高风险组 低风险组总生存率时间（年）P0.0011.000.750.500.250.000 5 10 15 20图1训练组高、低风险组患者总生存率的生存曲线 高风险组 低风险组总生存率时间（年）P0.0011.000.750.500.250.000 5 10 15 20 25图2验证组高、低风险组患者的生存曲线32山东医药2023 年第 63 卷第 27 期0.793，验证组中分别为 0.764、0.697、0.675，在整体组中分别为 0.807、0.739、0.709。在整体组中，多指标ROC（图9）及一致性指数曲线（图10）显示风险评分的 AUC 值和一致性指数均高于其他临床特征。单因素COX回归分析显示，风险评分与乳腺癌患 者 的 预 后 显 著 相 关（HR（95%CI）为 1.063（1.0451.081），P0.001；多因素Cox回归分析显示，风险评分是乳腺癌患者的独立预后影响因素（HR（95%CI）为1.065（1.0471.082），P0.001。高、低风险组间差异表达基因129个。GO分析显示，差异表达基因富集于铵离子代谢过程、体液免疫反应和内分泌激素分泌等生物过程，血液微粒子、角蛋白丝和中间丝等细胞成分，以及氨基酸结合、免疫球蛋白结合和ATP酶-偶联的无机阴离子跨膜 高风险组 低风险组总生存率时间（年）P0.0011.000.750.500.250.000 5 10 15 20 25图3整体组高、低风险组患者的生存曲线年龄60岁年龄60岁图4不同年龄亚组中高低风险组的生存曲线临床分期临床分期图5不同临床分期亚组中高低风险组的生存曲线T12T34图6不同T分期亚组中高低风险组的生存曲线N0N03图7不同N分期亚组中高低风险组的生存曲线M0M1图8不同M分期亚组的生存曲线灵敏度(%)100.080.060.040.020.00.00.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0100%-特异度(%)风险评分（0.709）年龄（0.617）分期（0.658）T（0.603）M（0.531）N（0.651）图9整体组风险评分及各临床特征的多指标预测乳腺癌患者生存率的ROC风险评分年龄分期TMN时间（年）一致性指数图10整体组风险评分及各临床特征的一致性指数曲线高风险组 低风险组高风险组 低风险组高风险组 低风险组高风险组 低风险组高风险组 低风险组高风险组 低风险组高风险组 低风险组高风险组 低风险组高风险组 低风险组高风险组 低风险组33山东医药2023 年第 63 卷第 27 期转运蛋白活动等分子功能。KEGG分析显示，这些差异表达基因显著富集于B细胞受体信号通路、色氨酸代谢、PI3KAkt 信号通路和铂类耐药性等通路。免疫细胞评分、基质细胞评分、肿瘤纯度及综合评 分 的 中 位 数 在 高 风 险 组 分 别 为 411.670、518.220、969.350、0.734，在 低 风 险 组 中 分 别 为594.006、757.348、1394.424、0.690。与低风险组比较，高风险组免疫细胞、基质细胞及综合评分低，肿瘤纯度高（P0.001）。低风险组中幼稚 B细胞、静息自然杀伤细胞、活化自然杀伤细胞和静息肥大细胞浸润丰度较高，高风险组中M0和M2巨噬细胞浸润丰度较高（P均0.05），见表2。3 讨论 乳腺癌是高度异质性的恶性肿瘤，在女性癌症中占新诊断患者的31%，占死亡患者的15%，是导致2059岁女性死亡的首要原因25。耐药和复发转移是导致患者预后不良的关键因素。肿瘤的异质性导致具有相同临床病理特征的患者预后亦可能存在较大差异，迫切需要探索有效的乳腺癌预后预测模型来准确预测患者预后，以利于进一步的临床决策。铜死亡是一种由铜触发的线粒体细胞死亡方式14。研究发现乳腺癌26、黑色素瘤27和肝细胞癌28等高线粒体代谢的肿瘤可能对铜离子载体诱导的铜死亡更敏感29。双硫仑已被证实能够作为铜离子载体诱导铜死亡发生15，研究30表明其在治疗乳腺癌时还可以降低肿瘤抑制基因PTEN的表达并激活乳腺癌组织中Akt信号传导，联合应用PI3K抑制剂可以显著抑制乳腺癌细胞的生长。本研究基于铜死亡相关lncRNA构建乳腺癌预后预测模型，旨在为乳腺癌的预后评估提供新的视角。本研究从TCGA数据库中获得719个铜死亡相关 lncRNAs，通过多因素 Cox 回归将 10 个 lncRNAs纳 入 预 后 预 测 模 型，LINC02043、AL683813.1、AC073127.1，MFF.DT 和 AC091588.1 是 危 险 lncRNAs，AKT3.IT1、AL137847.1、AL807757.2、AC079766.1 和 AL451123.1 是保护 lncRNAs，这些lncRNAs可能是乳腺癌的生物标志物及潜在治疗靶点。据研究31报道，LINC02043是酒精相关性肝细胞癌的危险lncRNA，与其他lncRNAs相结合可以预测酒精相关性肝细胞癌的无复发生存期。本研究发现LINC02043亦是乳腺癌的危险lncRNA，与患者的预后不良相关。YU等32研究提示，MFF.DT作为危险lncRNA与其他几种铜死亡相关lncRNAs联合构成乳腺癌的独立预后因素，本研究结果与之相符。然而暂时没有关于其余8种lncRNAs的研究报道，它们在乳腺癌中的生物学机制未来有必要通过进一步的体内外实验来探索，且有望成为乳腺癌的潜在治疗靶点。根据风险评分将乳腺癌患者分为高风险组和低风险组，随着风险评分升高患者死亡率增加。生存曲线显示无论是训练组、验证组还是整体组，高风险组患者的生存率均更低，表明预后预测模型对不同风险的患者有较好的区分能力。ROC显示风险评分预测乳腺癌患者 1 年、3 年和 5 年生存率的AUC值较高，表明预后预测模型具有较强的预测效能，且多指标 ROC 及一致性指数曲线表明模型的预测能力和临床应用效能优于其他临床特征。独立预后分析表明，风险评分是乳腺癌的独立预后因素。亚组生存分析表明，该预后预测模型适用于不同临床阶段的乳腺癌患者。由于样本中M1分期的患者人数较少，高、低风险组生存率的差异无统计学意义，但结果仍表现出高风险组患者总生存率较低的趋势。为了进一步验证预后预测模型的效能，我们探表2免疫细胞相对浸润丰度免疫细胞幼稚B细胞记忆B细胞Plasma cellsCD8+T细胞静息记忆CD4+T细胞活化记忆CD4+T细胞滤泡辅助T细胞调节性T细胞T细胞静息自然杀伤细胞活化自然杀伤细胞单核细胞M0巨噬细胞M1巨噬细胞M2巨噬细胞静息树突状细胞活化树突状细胞静息肥大细胞活化肥大细胞嗜酸性粒细胞中性粒细胞免疫细胞相对浸润丰度高风险组0.0910.0010.0390.0780.1500.0120.0640.0430.0020.0070.0100.0120.1770.0780.1410.0170.0070.0640.0040.0010.003低风险组0.1020.0020.0390.0850.1600.0090.0620.0420.0020.0060.0130.0140.1500.0750.1280.0190.0070.0780.0020.0010.00334山东医药2023 年第 63 卷第 27 期索了高、低风险组患者之间的生物学功能差异，对两组间差异表达的基因进行了功能富集分析。KEGG分析表明差异表达的基因主要富集于B细胞受体信号通路、PI3KAkt 信号通路和铂类耐药性等通路。GO分析表明差异表达的基因富集于体液免疫反应等生物过程。GARAUD等33发现，肿瘤浸润性B细胞可以产生持续的体液免疫反应，并有助于在乳腺癌肿瘤部位产生有效的抗肿瘤免疫反应。HARRIS等34在三阴性乳腺癌中发现，B 淋巴细胞具有 IgG偏向的克隆扩张，并与良好的预后相关，这可能是抗原驱动的体液免疫反应。PI3KAkt 信号通路在细胞代谢、细胞生长增殖、细胞凋亡和血管生成等基本细胞活动中起主要作用35，大约 70%的乳腺癌患者携带PI3K/AKT突变36，从而导致该通路的过度激活，促进肿瘤细胞生长、增殖和血管生成，是导致乳腺癌的内分泌治疗、靶向治疗和化疗耐药性的重要机制之一37-38。因此，高、低风险组间的预后差异可能与乳腺癌患者的免疫状态及化疗耐药性相关。肿瘤微环境包括肿瘤中的所有非癌宿主细胞（如免疫细胞和基质细胞）以及非细胞成分39，不同浸润性免疫细胞具有抗肿瘤或促肿瘤的功能，随着免疫逃逸的发生，免疫疗法成为癌症治疗的新策略40。ESTIMATE算法显示低风险组的基质评分、免疫评分和综合评分高，肿瘤纯度低，表明低风险组患者的免疫细胞浸润程度更高。肿瘤相关巨噬细胞可以分化为两个亚型，M1型巨噬细胞主要通过介导ROS诱导的组织损伤发挥抗肿瘤作用，而M2型巨噬细胞通过激活血管生成、免疫抑制及细胞外基质重塑表现出促肿瘤活性41-42。免疫浸润分析发现，高风险组患者M2型巨噬细胞浸润丰度较高，可能通过M2型巨噬细胞的促肿瘤作用导致癌细胞发生免疫逃逸而促进乳腺癌进展。因此，高、低风险组患者之间可能存在免疫状态差异，且低风险组患者的免疫原性更高，更可能从免疫治疗中获益。本研究构建的预后预测模型能够较为准确地反映乳腺癌抗肿瘤免疫状态，为评估乳腺癌患者对免疫治疗敏感性提供参考。综上所述，本研究基于TCGA数据库构建了由10个铜死亡相关 lncRNAs 构成的乳腺癌预后预测模型，该模型具有良好的准确性、区分能力、独立性，不仅可以有效地预测乳腺癌患者的预后，还可以评估患者的免疫浸润状态，反映免疫治疗敏感性，为实现个体化抗癌治疗提供参考。本研究也存在一定的局限性。首先，由于其他数据库中缺乏完整的 lncRNA 表达谱或临床信息，本研究采用了内部验证的方法，未来仍有必要基于独立的外部数据集来验证乳腺癌预后预测模型的有效性。此外，本研究在生物信息学层面分析了铜死亡相关 lncRNAs对乳腺癌患者预后的影响，未来需要通过体内外实验来进一步探索铜死亡相关 lncRNAs 在乳腺癌中的病理生理功能。参考文献：1SUNG H，FERLAY J，SIEGEL R L，et al.Global cancer statistics 2020：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 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