基于网络药理学及分子对接技术探讨解郁方治疗抑郁症的潜在作用机制.pdf

中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 1 基于网络药理学及分子对接技术探讨解郁方治疗抑郁症的潜在作用机制 徐若然1 侯志峰2 蔡永亮2 1.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230000 2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230000 摘要：摘要：目的 通过网络药理学及分子对接技术探索解郁方治疗抑郁症分子层面的作用机制。方法 利用 TCMSP 数据库及相关文献获取解郁方所含中草药的成分，使用多个药物靶点数据库获取药物相关靶点，通过多个疾病数据库获取疾病靶点基因信息，借助韦恩图获取解郁方治疗抑郁症的可能作用靶点；建立 PPI 网络、构建核心靶点网络后对所获取核心靶点进行 GO 分析、KEGG 富集分析，并进行分子对接验证。结果 得到 46 个有效成分、237 个成分靶点基因和 1745 个疾病靶点基因，两者取交集后获取 119 个交集靶点。利用 STRING 数据库和 Cytoscape 软件最终得到 AKT1，IL6，TNF，VEGFA 共 4 个核心靶点。GO 分析和 KEGG 富集分析得到多条作用通路。结论 解郁方可通过多个成分作用于多个靶点发挥抗炎、抑制细胞凋亡等作用，进而实现抗抑郁的作用。关键词：关键词：自拟方；网络药理学；抑郁症，中图分类号：中图分类号：R277 抑郁作为一种世界上常见的精神障碍，其核心症状为持续的情绪低落、思维迟缓、食欲不佳，具有高患病率、高自杀率、高复发率的临床特点1。一项在全球展开的流行病学调查显示，全球的抑郁症患病率高达 4.7%2，在我国约为 5%3。同时，抑郁症也是目前全球导致伤残的主要疾病之一，患者在精神健康及经济方面均面临着巨大压力。目前，抑郁症的治疗方案以抗抑郁药联合抗精神病药为主，如 5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂及单胺氧化酶抑制剂（MAOI）等，但是有着服药周期长，且副作用较大。解郁方，是安徽省中医院蔡永亮教授根据长期实践所拟方剂，其组成药物为当归，白芍，百合，柴胡，川芎，合欢花，黄连，石菖蒲，酸枣仁，临床治疗抑郁症有较好的疗效，但该方药效物质基础和药物作用于机体的机制尚未完全阐明。网络药理学由 Hopkins4于 2008 年首次提出，其内涵是基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用的网络，全面综合地观察药物对疾病的网络影响，从分子生物学角度出发，研究药物治疗疾病的相关机制。中医中药作为祖国医学的治疗手段，已进入分子时代的现代医学研究更可进一步证明其疗效。中医中药结合网络药理学，则更加符合分子医学时代对生物医药系统性探索的发展趋势。1 材料与方法 1.1 解郁方活性成分和靶点的收集及筛选 利用 TCMSP 数据平台及相关药理学文献获取解郁方中草药的有效成分，筛选条件为 OB30%，OL0.18，将筛选后的成分收集后建立成分库，利用 drugbank、Swiss Target Prediction 数据库获取有效成分的相关靶点，对蛋白质对应的基因名称进行统一需要通过Uniprot 数据库检索后完成。1.2 抑郁症相关靶点的收集与分类 在 GeneCards 数据库、DisGeNET 数据库数据库等疾病数据库中使用关键词“Depression”进行搜索，将检索获得靶点信息合并、去重，即可获取抑郁症对应的靶点，再借助韦恩图对筛选出的疾病基因与药物相关基因、靶点信息进行处理，取二者的交集，结果即解郁方治疗抑郁症的潜在靶点，再通过 Cytoscape 3.8.0 构建“解郁方-活性成分-靶点-疾病”网络。1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的建立 通过 STRING 11.0 数据库构建 PPI 网络，可得到蛋白质之间相互作用的网络，拓扑分析在导入Cystoscape 3.8.0 的 PPI 网络基础上完成，筛选标准的参数选定为 degree、betweenness centrality（BC）、average shortest path length（AS）、closeness 中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 2 centrality（CC），以 degree 值大小作为标准进行排序，将 degree、BC、CC、AS 值均大于各参数平均值的基因作为核心靶点。1.4 GO 分析和 KEGG 分析 使用 Metascape 数据库对通过上述方式获得的解郁方治疗抑郁症的潜在靶点进行 GO 功能富集及 KEGG分析，并将所得结果导入 Cytoscape 3.8.0 构建出“解郁方-关键成分-核心靶点-通路”的网络图。1.5 分子对接 根据度值筛选，将度值15 的药效分子作为候选对接药效成分，下载筛选出的药效分子相应的 SDF 文件，及 degree 值最大的 4 个靶点相对应的 PDB 文件进行分子对接，对分子和靶点进行对接模拟计算。若配体与受体自发结合，可知两者力小于 0。选取部分结果计算结果进行模拟，并绘制 3D 图。2 结果 2.1 解郁方的活性成分及靶点 在 TCMSP 数据库中以 OB30%、DL0.18 为条件，对当归，白芍，百合，柴胡，川芎，黄连，石菖蒲，酸枣仁的有效成分进行筛选，在药理学等相关领域文献中查找合欢花的有效成分，对获取化学药物还应进行以药材中含量及生物效能等为标准进行进一步筛选。最终共得到潜在活性成分 67 个，活性成分以黄酮类、类固醇、生物碱类药物为主。在 TCMSP 数据库中以 OB30%、DL0.18 为条件，对当归，白芍，百合，柴胡，川芎，黄连，石菖蒲，酸枣仁的有效成分进行筛选，在药理学等相关领域文献中查找合欢花的有效成分，对获取化学药物还应进行以药材中含量及生物效能等为标准进行进一步筛选。最终共得到潜在活性成分 67 个，活性成分以黄酮类、类固醇、生物碱类药物为主。2.2 抑郁症相关疾病靶点 以“Depression”作为检索词，在 BATMAN、GeneCards、GeneBank 等疾病数据库进行检索，将所得相关基因整合并去除重复后得到 1176 个基因，所得结果即为抑郁症相关的靶点。2.3 解郁方抑郁症的关键靶点 对经上述步骤所得 238 个药物靶点及 1176 个疾病靶点输入 EXCEL 软件并取二者交集，通过 Venny2.1 绘制韦恩图，最终得到 119 个药物及疾病的共同靶点，见图 1。图 1 交集所含靶点即为解郁方治疗抑郁症的作用靶点 将上述 119 个共同靶点上传至 STRING 网站，自动绘制得一个节点数为 119、边数 1793，平均局部聚类系数 0.639 的初步的蛋白互作信息图，去除孤立蛋白后下载 TSV 格式文件。将 TSV 格式文件导入Cytoscape3.8.0，进行拓扑分析并调整可视化参数；使用 Cytohubba 工具，在 TOP 选项中以 10 为条件进行排序，可得核心蛋白互作信息图。蛋白基因的作用强度与度值成正相关关系，根据软件计算结果可知，度值较大的几个蛋白基因为 VEGFA、TNF、AKT1、Interleukin-6（IL-6）、JUN、PTGS2。可知在解郁方的蛋白互作网络中，上述蛋白基因的作用显著，推测上述蛋白基因所对应的靶点可能是解郁方治疗抑郁症的关键靶点。图 2 解郁方治疗抑郁症的关键靶点 2.4 关键靶点 GO 和 KEGG 富集分析 对关键靶基因的GO分析及KEGG分析在Metascape数据库中完成，Metascape 数据库进行 GO 富集后分析如下：解郁方可通过共 1593 条生物学途径治疗抑郁症，主要富集在对氮化合物的反应、对肽的反应、对肽激素的反应、对有机环状化合物的反应、对激素的反应等生物学途径上；相关性大的 CC 有膜筏（membrane raft）、膜微域（membrane microdomain）、突触后膜中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 3（postsynaptic membrane）、受体复合物（receptor complex）等；与交集基因集合相关的 MF 主要有神经递质受体活性、转录因子结合、儿茶酚胺结合、DNA结合转录因子结合等。将这些数据进行处理并导入微生信平台（http:/ 富集分析结果可得到 202 条与关键靶基因相关的通路，主要包括癌症通路（Pathways in cancer），化 学 致 癌 -受 体 活 化（Chemical carcinogenesis-receptor activation）通路，流体剪切应力动脉粥样硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis），糖尿病并发症中的 AGE-RAGE 信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）等。以 p 值大小进行排序，对 p 值最小的 20 条通路进行分析。2.5 靶点通路网络的构建 将靶点基因和 KEGG 富集所得到的通路导入Cytoscape 中构建网络“靶点-通路”，并进行拓扑分析，根据此网络可对解郁方治疗抑郁症的生物过程做出判断。将拓扑分析的结果导出至 excel，筛选 type 为“drug”，选取 degree 值最大的五个成分作为药效分子，分别为-谷甾醇（Beta-Sitosterol），异鼠李素（isorhamnetin），山奈酚（Kaempferol），槲皮素（quercetin），豆甾醇（Stigmasterol）。2.6 分子对接结果 为进一步验证上文所得结果，选取 2.5 步骤中所得 -谷 甾 醇（Beta-Sitosterol），异 鼠 李 素（isorhamnetin），山奈酚（Kaempferol），槲皮素（quercetin），豆甾醇（Stigmasterol）五个药效分子，从对接靶点中选出 VEGFA、AKT1、IL-6、TNF 进行进一步的分子对接处理。结合能小于-5 kcal/mol、小于-7 kcal/mol 时分别表明靶点与药效分子有较好结合活性、有强烈的结合活性。根据对接结果可知-谷甾醇、谷甾醇、异鼠李素、槲皮素与 AKT1、VEGFA、IL-6和 TNF 均有较好活性，见表 1。使用 Pymol 绘制 3D 图，将对接结果可视化，见图 3。3 讨论 解郁方从肝脾论治抑郁症，蔡永亮教授认为郁证病机为肝郁脾虚、痰湿内停，故以柴胡疏肝解郁，当归、白芍养血柔肝，川芎养血行气，又因郁证病起于 表 1 分子对接结果 活性成分 结合能（kcal/mol）VEGFA（7LL8）AKT1（7NH5）IL-6（5FUC）TNF（1A8M）-谷甾醇-6.2-10.3-5.9-6.8 异鼠李素-5.7-9.4-6.8-7.2 山奈酚-5.6-9.8-6.9-6.8 槲皮素-5.9-10.5-7.2-7.3 豆甾醇-6.8-10.7-7-6.8 （1A8M quercetin）（5FUC quercetin）（7LL8 stigmasterol）(7nh5 stigmasterol)图 3 对接结果可视化 七情不畅，气郁易化火，故用黄连化热，气郁则气机不调，脾不可运化水湿，聚而成痰，配以石菖蒲醒神化湿，酸枣仁与合欢花二药可奏疏肝解郁及宁心安神之效，解郁方以疏肝健脾为主，辅治痰湿，调节气机以达解郁之功。本研究利用网络药理学分析发现，解郁方的药物成分-疾病-靶点网络中度值较高的前 15 个成分中，以黄酮类、类固醇、生物碱类药物为主。黄酮类对抑郁症的预防及治疗是通过增加大脑中的 5-HT、多巴胺等神经递质和脑源性神经营养因子（BDNF）的含量，调控 HPA 轴来实现的。山奈酚的抗炎作用已被细胞实验证实，通过抑制肿瘤坏死因子(TNF-)、白介素 8(IL-8）等炎症因子的表达及细胞氧化应激反应实现其抗抑郁的作用5。刘晓峰等6发现-谷甾醇的脂类衍生物改善小鼠抑郁样行为的药理作用是使小鼠脑内五羟色胺及多巴胺的水平上升。槲皮素可以降低细胞内 IL-6、TNF-和 IL-1水平从而起到抗炎、抗氧化的作用，可抑制下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴对应激的应答反应来发挥抗抑郁作用7,也通过神经保护调节神经递质系统等多种途径发挥抗中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 4 抑郁作用，是否仍有其他途径发挥抗抑郁作用还有待更多的实验证明。AKT1、TNF、VEGFA、IL-6 为解郁方治疗抑郁症靶点蛋白 PPI 网络中的枢纽蛋白。AKT1 作为 BDNF P13K途径上的重要靶点因子，在通路的信号传导中起重要作用。BDNF 及其信号通路在中枢系统的海马体、前额叶皮质中分布，亦存在于周围神经系统、纹状体、丘脑中，具有保护神经系统、促进血管新生的作用，也是近期抑郁症研究的热点通路8。血管内皮生长因子 A（VEGFA）属于 PDGF/VEGF 生长因子的一员，可通过刺激血管再生，保护及修复大脑缺血神经元9。IL-6 和 TNF-其来源为免疫活性细胞，也是人体重要的免疫因子，参与了神经元兴奋性传递的调节、谷氨酸（Clu）、多巴胺（DA）和 5-羟色胺（5-HT）等神经递质代谢，及介导了神经退行性过程10。同时多项研究11-12结果显示，抑郁的临床表现与炎症介质释放后对神经递质的合成、释放有一定的相关性，抑郁障碍的病理过程中不能排除有神经免疫的参与。KEGG 结果显示，解郁方主要通过 VEGF 信号通路、TNF 信号通路、NF-B 信号通路、HIF-1 信号通路、ErbB信号通路治疗抑郁症。本研究对“解郁方-活性成分-靶点-通路”中所得关键活性成分与所得关键靶点进行分子对接后所得两两结合能结果显示，4 个关键靶点与 5 个关键活性成分均有良好结合性。综上所述，通过网络药理学及分子对接技术，本文探讨并了解郁方治疗抑郁症的作用机制，结果提示解郁方具有治疗抑郁症的作用，其作用机制可能与 TNF、AKT1、VEGFA、IL-6 等核心靶点，调控信号通路、核因子 KB信号通路，进而减轻炎症、改善氧化应激，与神经元凋亡、神经发生、神经可塑性等生物学过程有关。证明了中药复方多靶点多通路的治疗特色，验证了解郁方在治疗抑郁症的药理作用，也为后续的实验奠定了基础。参考文献 1周义萍,曾文卫,黄云.中医对抑郁症的认识及目前治疗进展概况J.光明中医,2018,33(10):1516-1518.2 FERRARI A J,SOMERVILLE A J,BAXTER A J,et al.Global variation in the prevalence and incidence of major depressive disorder:a systematic review of the epidemiological literatureJ.Psychol Med,2013,43(3):471-481.3潘剑.心理认知护理干预对抑郁症患者的临床护理效 果 观 察 J.中 国 冶 金 工 业 医 学 杂志,2019,36(6):661-662.4 HOPKINS A L.Network pharmacology:the next paradigm in drug discoveryJ.Nature Chemical Biology,2008,4(11):682-690.5 Nam S Y,Jeong HJ,Kim H M.Kaempferol impedes I L-32-induced monocyte-macrophage differentiation J.Chem Biol Interact,2017(274):107-115.6刘晓峰,曹馨元,尹永霞,等.百花花楸果中-谷甾醇及其衍生物的制备及抗抑郁活性研究J.中国药房,2021,32(1):64-70.7陈文龙,戴富臻,邵正勇,等.槲皮素对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化抑制作用和肝保护作用J.中国免疫学杂志,2021,37(1):46-50.8 Wu C C,Lu J,Lu S J,et al.Increased ratio of mature BDNF to precursor-BDNF in patients with major depressive disorder with severe anhedoniaJ.J Psychiatr Research 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