氨糖软骨素钙姜黄复合物对骨密度的协同作用_何晶.pdf

131 研究探讨食品工业 2023 年第44卷第 2 期氨糖软骨素钙姜黄复合物对骨密度的协同作用何晶，邱春媚，黄远英，殷光玲，张旭光汤臣倍健股份有限公司（广州 510663）摘要研究采用动物试验,评估一种氨糖软骨素钙姜黄复合物对骨密度的影响及其安全性。复合物给予剂量为0.345,0.690和2.070 g/(kgbw)。通过试验考察动物生长发育情况,2.070 g/(kgbw)剂量组大鼠股骨中心和远心端骨密度,骨钙含量显著高于溶剂对照组(P0.05),氨糖软骨素钙姜黄复合物对于大鼠有增加骨密度的作用。通过小鼠的急性毒性试验、Ames试验及小鼠精子畸形试验,评估氨糖软骨素钙姜黄复合物的安全性。试验结果表明,氨糖软骨素钙姜黄复合物对小鼠未见明显毒性,试验动物均未产生异常反应,试验为阴性结果。氨糖软骨素钙姜黄的组合对骨密度有积极影响,且具有较好的安全性。试验结果为氨糖、软骨素、钙及姜黄的组合使用及相关食品开发提供研究基础。关键词骨密度;氨糖;软骨素;钙;姜黄Synergistic Effect of the Compound of Glucosamine Chondroitin Calcium and Curcumin on Bone Mineral DensityHE Jing,QIU Chunmei,HUANG Yuanying,YIN Guangling,ZHANG XuguangBy-Health Co.,Ltd.(Guangzhou 510663)Abstract Animal experiments were used to evaluate the effect of a glucosamine chondroitin calcium and curcumin composition on bone mineral density and its safety.Dosage of glucosamine chondroitin calcium and curcumin composition was 0.345,0.690 and 2.070 g/(kgbw).The growth of animals was investigated through experiments,bone mineral density in the center and distal end of femur and bone calcium content in 2.070 g/(kgbw)dose group were significantly higher than those in solvent control group(P0.05).Through the acute toxicity test,Ames test and sperm malformation test in mice,the safety of the glucosamine chondroitin calcium and curcumin composition was evaluated.The experimental results showed that the compound of glucosamine chondroitin calcium and curcumin had no obvious toxicity to mice,the experimental animals had no abnormal reaction,and the experiment was negative.According to the research,the compound of glucosamine chondroitin calcium and curcumin had a positive effect on bone mineral density,and had good safety.It provided a research basis for the compound of glucosamine chondroitin calcium and curcumin and the development of related foods.Keywords bone mineral density;glucosamine;chondroitin;calcium;curcumin近年来，骨质疏松症发病率逐年增长，作为重大疾病深受关注和讨论1。以骨密度为关键词检索，截至2022年8月，关于骨密度的注册保健食品有700余例，这些保健食品的主要功能成分为氨基葡萄糖、硫酸软骨素、钙等。补钙是治疗及预防骨质疏松的重要方式2-3。氨基葡萄糖可以促进软骨合成与软骨细胞生长，增加骨骼钙质摄取量，刺激黏多糖生化合成，增强滑膜液黏度，减轻患者疼痛4-6。硫酸软骨素可以逆转软骨损坏，增加关节滑液。软骨素通过对环氧化酶-2进行抑制，减轻关节的发炎情况；减少纤维蛋白血栓的形成，促进软骨下骨血循环6。软骨素与氨基葡萄糖协同作用，进一步提高改善效果，并且联合使用安全性加高，不会增加不良反应，两者的联合使用在骨关节产品中较为常见5,7。姜黄在我国传统医学中，具有悠久的使用历史8，其具有广泛的抗肿瘤、抗炎、抗氧化、清除自由基等作用。研究表明，姜黄对骨质疏松有一定治疗作用，主要是抗炎机制，以及对酶类，NF-B、OPG/RANKL、FoxO3a/Wnt、Wnt/-catenin、TGF-/Smad2/3等信号通路的调控9-11。通过研究一种氨糖软骨素钙姜黄复合物对骨质疏松模型大鼠的骨密度的影响，探究氨糖、软骨素、钙及姜黄在增加骨密度方面的协同作用，并对其安全性进行评估，为骨关节产品的研究与开发提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验样品样品为棕黄色片剂，人体推荐摄入量4.14 g/d，按体重折合剂量0.069 g/（kgbw）。样品中功效成分添加量约为氨基葡糖硫酸钾盐1 500 mg，硫酸软骨素500 mg，钙160 mg，姜黄素40 mg，其余为辅料用于片剂成型。样品粉碎后进行试验。1.1.2试验动物 骨密度试验：SPF级雌性SD大鼠（来源）。安全食品工业 2023 年第44卷第 2 期 132 研究探讨毒理试验：SPF级昆明种小鼠，SD大鼠（来源）。1.1.3仪器与设备contrAA700连续光源原子吸收光谱仪（德国Analytik Jena）；HOLOGIC双X线骨密度仪（美国HOLOGIC）；AU680全自动生化分析仪（美国BECK-MAN COULTER）。1.2试验方法1.2.1骨密度试验1.2.1.1卵巢切除大鼠以30 mg/（kgbw）的剂量注射戊巴比妥钠溶液，麻醉，切除双侧卵巢，术后注射青霉素。假手术组切除约0.5 g脂肪，保留双侧卵巢。卵巢切除后5 d，进行阴道涂片检查。1.2.1.2受试物给予试验动物按体重随机分组：假手术组、卵巢切除+溶剂对照组、卵巢切除+碳酸钙对照组、卵巢切除+样品低剂量组0.345 g/（kgbw）、卵巢切除+样品中剂量组0.690 g/（kgbw）、卵巢切除+样品高剂量组2.070 g/（kgbw）。假手术组和卵巢切除+溶剂组给予等体积的1%羧甲基纤维素，卵巢切除+碳酸钙对照组经口给予与样品高剂量组相同钙含量的碳酸钙。自试验开始，灌胃对应的受试液，试验时间为90 d。1.2.1.3动物生长发育指标每周称量动物体重。1.2.1.4股骨骨密度及骨钙含量的测定试验结束后，处死动物，剥离股骨，烘烤至恒重，检测股骨中点处、远心端的骨密度。称量股骨的总质量后，检测骨钙含量。1.2.2安全毒理试验1.2.2.1小鼠急性毒性试验采用最大耐受剂量法，选用20只试验小鼠，雌雄各半。每日经口灌胃2次（间隔4 h），每次0.2 mL/（10 gbw），累积达20.00 g/（kgbw）。初次灌胃前禁食16 h，灌胃后观察2周，记录试验动物状态。1.2.2.2Ames试验试验采用鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型TA97a，TA98，TA100，TA102菌株，以多氯联苯诱导的大鼠肝微粒体酶（S-9）为体外代谢活化系统。试验剂量为5 000，1 000，200，40和8 g/皿，同时设自发回变，溶剂对照和阳性突变剂对照（2-氨基芴、9-芴酮、叠氮钠、1、8-二羟基蒽醌、丝裂霉素C）。于37 培养48 h，计数每皿菌落数。1.2.2.3小鼠精子畸形试验取25只试验小鼠，随机分为5组5只。阳性对照：0.04 g/（kgbw）环磷酰胺；阴性对照：1%羧甲基纤维素。试验组剂量分别为10.00，5.00和2.50 g/（kgbw）。连续5 d，每天灌胃1次，末次灌胃后的第30天处死动物，取副睾涂片，每只计数1 000个结构完整的精子，计算畸变的发生率。1.3试验数据统计用SPSS等软件进行数据分析，结果以 XS表示。数据采用方差分析，先进行方差齐性检验，若方差不齐则对数据进行适当的变量转化，若仍达到未方差齐，则采用秩和检验进行统计。2结果与分析2.1氨糖软骨素钙姜黄复合物对大鼠体重的影响由表1可见，试验前各组动物的初始体重差异没有差异显著性（P0.05）。假手术组大鼠的第8周末重、试验末重及增重低于溶剂对照组，差异有显著性（P0.05）。试验剂量组与溶剂对照组体重，增重无显著差异（P0.05）。通过体重及增重的阶段性检测，表明手术对大鼠产生影响，氨糖软骨素钙姜黄复合物对大鼠体重未造成不良影响。分组初始体重4周末体重8周末体重末期体重增重(XS)/gP值(XS)/gP值(XS)/gP值(XS)/gP值(XS)/gP值假手术组303.112.50.848349.710.90.319372.215.90.016387.719.30.00784.617.70.001溶剂对照组302.012.1355.915.4393.920.2418.825.9116.817.3碳酸钙对照组303.012.00.999352.913.70.975389.818.40.974410.823.90.913107.820.30.789低剂量组303.311.40.998351.916.10.934388.921.10.948412.629.20.964109.423.20.878中剂量组303.511.20.995347.912.60.579383.815.20.626409.423.00.862105.924.20.665高剂量组303.411.60.997351.616.90.917381.224.10.431403.333.80.52999.927.10.289表1氨糖软骨素钙姜黄复合物对大鼠体重的影响2.2氨糖软骨素钙姜黄复合物对大鼠骨长度和骨密度的影响由表2可见，各组试验动物的股骨长度无显著差异（P0.05）。假手术组，高剂量组大鼠股骨中心和远心端骨密度高于溶剂对照组，差异有显著性（P 0.05）。高剂量氨糖软骨素钙姜黄复合物的干预，可促进大鼠骨密度的增加。氨糖、软骨素、钙及姜黄的组合使用，对骨密度有促进作用。2.3氨糖软骨素钙姜黄复合物对股骨质量和钙含量的影响由表3可见，各组试验动物的股骨质量无显著差异（P0.05）。假手术组，高剂量组骨钙含量高于溶剂对照组，差异有显著性（P0.05），高剂量氨糖软骨素钙姜黄复合物可提高大鼠骨钙含量。复合物补充钙，同时氨糖、软骨素及姜黄也一定程度地促进钙的吸收与转化等。133 研究探讨食品工业 2023 年第44卷第 2 期表3氨糖软骨素钙姜黄对大鼠股骨重量和钙含量的影响分组股骨重量骨钙含量(XS)/gP值(XS)/(mgg-1)P值假手术组0.7160.0680.417216.019.70.000溶剂对照组0.6910.064179.416.1碳酸钙对照组0.7130.0650.877193.917.40.178低剂量组0.7090.0670.928186.121.70.784中剂量组0.7170.0700.791193.113.10.217高剂量组0.7180.0660.785207.713.50.0022.4氨糖软骨素钙姜黄复合物的急性毒性试验氨糖软骨素钙姜黄复合物20.00 g/（kgbw）给试验动物灌胃后，动物未见明显中毒症状，无显著的体重变化，经过14 d的观察无死亡。观察期末处死受试动物进行解剖未见明显异常，包括肝、脾、肾、肠、心、肺等主要器脏。氨糖软骨素钙姜黄复合物对雌雄小鼠的最大耐受剂量（MTD）大于20.00 g/（kgbw），按保健食品分级标准12，属无毒级。表4氨糖软骨素钙姜黄复合物的急性毒性试验性别动物数/只剂量/(gkg-1bw-1)死亡数/只MTD/(gkg-1bw-1)雄1020.00020.00雌1020.00020.002.5Ames试验由表5和表6结果可见，对TA97a、TA98、TA100、TA102这4株试验菌株，加与不加S-9，氨糖软骨素钙姜黄复合物的各剂量组回变菌落均未超过自发回变菌落数的2倍，无剂量-反应关系，为阴性12，氨糖、软骨素、钙及姜黄的组合使用较为安全。分组股骨长度股骨中心骨密度股骨远心端骨密度(XS)/mmP值(XS)/(gcm-2)P值(XS)/(gcm-2)P值假手术组36.952.590.9050.2670.0190.0110.3310.0320.001溶剂对照组37.123.490.2430.0200.2840.019碳酸钙对照组37.392.191.0000.2570.0190.1800.3100.0320.204低剂量组37.173.391.0000.2500.0180.7000.2880.0270.994中剂量组37.352.581.0000.2570.0160.1850.3170.0400.073高剂量组37.462.681.0000.2660.0080.0120.3270.0330.011表2氨糖软骨素钙姜黄复合物对大鼠骨长度和骨密度的影响组别每皿剂量/gTA97aTA98TA100TA102+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9受试物5 000100.77.696.34.636.34.041.05.2146.717.0148.35.7282.330.7283.315.51 000106.023.4100.012.536.03.637.76.5150.013.2137.713.2277.714.5260.717.0200102.311.2103.36.837.05.037.33.1159.019.2155.710.7274.326.3268.313.640109.015.1110.314.238.73.539.75.9153.315.5153.78.7272.013.0264.78.18103.75.099.05.634.33.241.73.8151.312.3142.74.0267.017.3286.323.7自发回变108.310.0109.76.736.74.231.02.6148.012.0155.311.7272.313.4270.021.1溶剂对照109.315.0107.719.734.04.433.04.4143.712.7147.713.5281.713.3276.313.2阳性对照1 216.0134.4 1 144.0193.5 2 780.0185.9 2 284.7130.3 2 314.3284.3 2 446.7303.0 1 073.368.2 2 256.0217.8表5Ames试验结果（第1次）（XS）组别每皿剂量/gTA97aTA98TA100TA102+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9受试物 5 000101.318.8106.06.037.03.635.04.4147.022.6151.714.6297.718.0272.012.51 000112.07.9106.315.536.73.139.34.2145.39.5153.717.9275.720.4290.314.2200121.07.8112.712.536.05.633.74.7155.011.3144.09.5269.75.1287.021.040108.39.0120.010.434.36.734.03.0152.79.6141.311.0272.317.4276.729.58111.715.9105.713.635.73.536.34.5153.36.7150.024.3276.017.3287.724.0自发回变111.09.0113.012.538.34.934.74.2155.717.2144.310.3298.716.0280.315.6溶剂对照114.718.9115.025.033.33.135.34.5140.321.2143.721.2295.712.6278.721.7阳性对照1 244.0214.7 1 144.0132.6 2 748.7267.5 2 266.3269.5 2 394.7196.7 2 480.3135.7 1 061.389.52 278.7175.2表6Ames试验结果（第2次）（XS）2.6小鼠精子畸形试验由表7可见，氨糖软骨素钙姜黄复合物干预的各试验组的小鼠精子畸形发生率与阴性对照组比较无明显差异（P0.05），而阳性对照组与阴性对照组比较差异有显著性（P0.01）。试验表明氨糖软骨素钙姜黄复合物对小鼠精子未造成畸形12，氨糖、软骨素、钙及姜黄的组合经毒理评价具有一定安全性。食品工业 2023 年第44卷第 2 期 134 研究探讨组别受检精子数/个畸形总数/个畸形率(XS)/%各类精子畸形的构成比/%无钩香蕉形胖头无定形尾折叠双头双尾高剂量组5 0001212.420.4328.115.721.534.70.00.00.0中剂量组5 0001072.140.2929.011.219.640.20.00.00.0低剂量组5 0001122.240.3025.917.916.140.20.00.00.0阴性对照组5 0001182.360.2128.89.322.039.80.00.00.0阳性对照组5 0003817.620.54*28.616.518.936.00.00.00.0注:*与阴性对照组比较,P0.01。表7氨糖软骨素钙姜黄复合物对小鼠精子畸形发生率的影响3结论以0.345，0.690和2.070 g/（kgbw）剂量的氨糖软骨素钙姜黄复合物给雌性去势SD大鼠灌胃90 d，2.070 g/（kgbw）剂量组大鼠股骨中心和远心端骨密度，骨钙含量显著高于溶剂对照组（P0.05），氨糖软骨素钙姜黄复合物对于大鼠有增加骨密度的作用12。林丽萍等7、郁桦等13研究表明氨糖与软骨素协同作用促进骨密度，氨糖与软骨素可通过促进软骨增长，提高骨骼对钙的摄取，进而提高骨密度。阳春华等14研究软骨素加钙的干预，表明软骨素与钙联合使用可增加大鼠的骨密度。刘汝萃等15进行氨糖软骨素钙片的大鼠骨密度的试验，结果表明氨糖软骨素钙片可显著增加骨密度。王铜浩等9、李义等11研究姜黄对骨质疏松的影响，表明姜黄对骨密度等具有积极影响，姜黄通过抗炎、抗氧化等机制改善骨关节健康。小鼠试验表明，氨糖软骨素钙姜黄复合物对雌雄小鼠的MTD大于20.00 g/（kgbw），属无毒级。Ames试验表明，小鼠精子畸形均为阴性。氨糖软骨素钙姜黄复合物属于实际无毒12。黄佳宁等16、林丽萍等17、魏庆钢18、李庆等19研究也表明氨糖、软骨素、姜黄食用安全，毒理学试验为无毒级。钙为常规膳食补充剂，也具有大量研究及食用历史20-22。试验中氨糖、软骨素、钙及姜黄食用安全，4种原料组合使用未造成试验动物异常。氨糖、软骨素、钙及姜黄的组合对骨密度具有协同促进作用，并且具有一定安全性，可应用于保健食品等研究与开发。参考文献：1 李勇,季晖.骨质疏松症的药物治疗进展J.中国骨质疏松杂志,2002,8(1):3.2 伍汉文,邓小戈.钙与骨代谢和骨质疏松的关系J.湖南医科大学学报,1998,23(3):4.3 何伟玺,杨香婷,朱沛,等.补钙对骨密度的影响J.中国骨质疏松杂志,2003,9(3):2.4 QIU G X,GAO S N,GIACOVELLI G,et al.Efficacy and safety of glucosamine sulfate versus ibuprofen in patients with knee 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